pomiary tlenu singletowego i wolnych rodników

Badanie mechanizmów działania fotouczulaczy
- pomiary tlenu singletowego i wolnych rodników
Marta Kempa
Badanie aktywności fotouczulaczy stosowanych w terapii PDT
metodami fizykochemicznymi (prof. dr hab. A. Ratuszna)
Terapia fotodynamiczna - Fotouczulacz
lek (fotouczulacz) + tlen + światło
 Mechanizm działania fotouczulaczy:
 Terapia fotodynamiczna
 I typ fotoreakcji (przeniesienie elektronu lub wodoru)
 II typ fotoreakcji (transfer energii)

FH   3O2  1F0  HO2
F   3O2  1F0  O2
Type-I
reaction
3

F *  RH  FH  R
3

F *  RH  F  RH



2O2  O2  O22
O2  O2 SOD

 H 2O2
n
 n1 
O2  H 2O2 Me
 Me O2  OH   OH 
(Haber –Weiss reaction)
1
F0  h  1F * ISC
 3F *
H 2O2  Men1  OH   OH   Men
(Fenton reaction)
Type-II
reaction
3
Oxidation of
Substraces
and Cellular
Damage
F * 3O2  1O2 1F0
Rysunek 1. Fizyczne i chemiczne mechanizmy zachodzące podczas PDT.
Badane fotouczulacze przykładowe struktury badanych związków
Chl 2
Chl b
Chl d
C41H53N5O5
C53H79N7O13
C47H62N6O14
M=695,89m/mol
M = 1022,23 g/mol
M=935,03 g/mol
Rysunek 2. Przykładowe struktury fotouczulaczy z grupy chloryn.
 Spektrofotometria Pomiary widm absorpcyjnych w
różnych środowiskach: hydrofilowym, hydrofobowym oraz
aprotycznym (położenie ostatniego pasma absorpcji, kontrola
nad formą występowania badanych związków w różnych
środowiskach)
5µM Chl 2
0,9
chl 2 PBS
chl 2 PBS + 0.2% Triton X100
chl 2 DMSO
Abs (a.u.)
0,6
0,3
0,0
300
400
500
600
700
wavelength (nm)
Wykres 1. Widmo absorpcji chloryny 2.
 Spektroskopia laserowa - detekcja fosforescencji
fotogenerowanego tlenu singletowego 1O2 Rejestracja
emisji przy długości fali 1270nm. W celu weryfikacji obserwowanego
sygnału do badanych próbek dodawany jest azydek sodu (fizyczny
wygaszacz tlenu singletowego) oraz wykorzystywane są dodatkowe
filtry 1195nm i 1355nm. Związki wzbudzane są światłem laserowym
o dł. 355nm. Pomiary wykonywane są dla związków rozpuszczonych
w różnych środowiskach. Stężenie badanych związków 10μM.
Filtry 1270, 1195 i 1355nm – Maksimum fosforescencji tlenu singletowego
położone jest przy długości fali 1270nm. Przy długościach fali 1195nm i 1355nm
nie powinien być rejestrowany sygnał pochodzący od wzbudzonego tlenu. Jeżeli
sygnał jest rejestrowany, może to oznaczać, że nie pochodzi on od 1O2.
Spektroskopia Laserowa
B
1000
chl 2 PBS (1270nm)
chl 2 PBS (1195nm)
chl 2 PBS (1355nm)
chl 2 PBS + 5mM NAN3 (1270nm)
Signal intensity (au.)
800
600
400
200
Signal intensity (a.u.)
A
chl 2 PBS + 0.2% Triton X100 (1270nm)
chl 2 PBS + 0.2% Triton X100 (1195nm)
chl 2 PBS + 0.2% Triton X100 (1355nm)
chl 2 PBS + 0.2% Triton X100 + 5mM NaN3(1270nm)
600
400
200
0
0
C
16000
0
Time (ns)
chl 2 PBS DMSO (1270nm)
chl 2 PBS DMSO (1195nm)
chl 2 PBS DMSO (1355nm)
chl 2 PBS DMSO + 5mM NaN3(1270nm)
6000
Signal intensity (a.u.)
8000
20000
40000
Time (ns)
4000
Wykres 2. Pomiar emisji luminescencji przy
różnych długościach fali w A - środowisku
wodnym (PBS), B -hydrofobowym (Triton x
100) oraz C- aprotycznym.
2000
0
0
20000
Time (ns)
40000
 Spektroskopia EPR, Fotokonsumpcja tlenu przy użyciu
sondy spinowej mHCTPO. Rejestracja sygnału sondy spinowej w czasie
naświetlania badanej próbki. Naświetlanie z zakresu 542-742nm.
Obserwowany zanik tlenu będzie sugerował możliwość produkcji
rodników w badanym układzie. Pomiary wykonywane są dla związków
rozpuszczonych w różnych środowiskach. Dodatkowo metodą tą można
pośrednio sprawdzić, czy w układzie generowany jest 1O2 (zamiana
środowiska z H2O na D2O, dodanie Histydyny, NaN3).
Rysunek 3. Struktura chemiczna sondy
spinowej mHCTPO.
Rysunek 4. Sygnał sondy spinowej mHCTPO. A – wysoka
koncentracja tlenu; B - niska koncentracja tlenu. Wyznaczany
parametr R jest proporcjonalny do koncentracji tlenu w
badanym układzie.
Fotokonsumpcja tlenu
chl 2 PBS
chl 2 PBS+ 0.5mM NADH
chl 2 PBS+ 0.5mM NADH + 5mM NaN3
chl 2 PBS+ 1mM His
chl 2 D2O+ 1mM His
A
0,30
chl 2 PBS+ 0.5% triton X100
chl 2 PBS+ 0.5% triton X100 + 0.5mM NADH
chl 2 PBS+ 0.5% triton X100 + 0.5mM NADH + 5mM NaN3
chl 2 PBS+ 0.5% tritonX100+1mM His
chl 2 D2O+ 0.5% tritonX100+1mM His
B
0,25
Oxygen concentration (a.u.)
Oxygen concentration (a.u.)
0,30
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0
1
2
3
4
5
Irradiation time (min)
6
7
0
1
2
3
4
5
6
7
Irradiation time (min)
Wykres 3. Zmiany stężenia tlenu w trakcie naświetlania chl 2. Pomiary dla próbki w
środowisku A - wodnym oraz B - hydrofobowym.
 Spektroskopia EPR, Pułapkowanie spinowe w celu
identyfikacji i porównania kinetyki fotogenerowanych rodników tlenowych
w różnych układach modelowych. Badanie zmian amplitudy sygnału
powstałych adduktów w trakcie naświetlania próbki. Naświetlanie w
zakresie 542-742nm. Pomiary wykonywane dla związków rozpuszczonych
w różnych środowiskach.
•R + ST → ST-•R
schemat reakcji pułapkowania spinowego
Popularne pułapki:
1) 2-metylo-2-nitrozopropan, MNP
2) α-fenylo-N-t-butylonitron, PBN
3) 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO
4) 2,2,6,6-Tetrametyl-1-piperidinyloxy, TEMPO
Powstały addukt wykazuje charakterystyczne widmo EPR. Identyfikaca
spułapkowanego rodnika oparta jest na stałych rozszczepienia nadsubtelnego
występujące w widmach EPR próbki.
Pułapkowanie spinowe
𝑎𝑁 =14,3 G
𝑎𝐻 β =11,3 G
𝑎𝐻 𝐼 =1,4 G
𝑎𝑁 =14,9 G
𝑎𝐻 β =14,9 G
Rysunek 5. A- Diagram pułapkowanego spinowo adduktu DMPO po interakcji z
anionorodnikiem ponadtlenkowym oraz rodnikiem hydroksylowym, B- spektrum
adduktu DMPO-OOH, C- spektrum adduktu DMPO-OH
Hitoshi Togashi et al. Analysis of hepatic oxidative stress status by electron spin resonance spectroscopy and imaging, Free
Radical Biology and Medicine , 2000, 28 846-853
Pułapkowanie spinowe
A
B
*
Signal intensity [a.u.]
1,50E+05
1,00E+05
5,00E+04
+
*
+
1,50E+06
*
1,00E+06
+
+ +
*
Signal intensity [a.u.]
2,00E+05
+
0,00E+00
-5,00E+04
-1,00E+05
5,00E+05
+
*
*
*
+ +
+ +
*+
0,00E+00
-5,00E+05
-1,00E+06
-1,50E+05
-2,00E+05
3350
3360
3370
3380 3390 3400
Magentic Field [G]
3410
3420
-1,50E+06
3350
3360
3370
3380
3390
3400
Magnetic Field [G]
3410
3420
Rysunek 6. Spektrum EPR adduktu DMPO-OH (*) oraz DMPO-CH(CH3)OH (+)
powstałego podczas naświetlania roztworu A - chl 2 w PBS, B - chl 2 w PBS+0.5% Triton
X100
·OH+CH3CH2OH
·CH(CH3)OH
DMPO
DMPO-CH(CH3)OH (𝑎𝑁 =15,8 G, 𝑎𝐻β =22,8G)
Pułapkowanie spinowe
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
0
1
2
3
4
5
Irradiation time (min)
6
7
8
Signal amplitude DMPO-OH (a.u.)
1400000
Signal amplitude DMPO-OH (a.u.)
chl 2 PBS
chl 2 PBS + 0,5mM NADH
chl 2 PBS + SOD 50ug/ml
chl 2 PBS+0.5mM NADH+50u/ml SOD
chl 2 PBS+10% EOH
chl 2 PBS+0.5mM NADH+10% EOH
chl 2 PBS
chl 2 PBS + 0,5mM NADH
chl 2 PBS + 5mM NaN3
chl 2 PBS + 0,5% Triton X 100
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Irradiation time (min)
Wykres 4. Zmiany amplitudy rejestrowanego sygnału DMPO-OH w trakcie naświetlania
chl 2.
 Spektroskopia EPR, Wykrywanie obecności anionorodnika
ponadtlenkowego 𝑶−●
𝟐 przy użyciu sondy Tiron. Badanie generowania
anionorodnika ponadtlenkowego przez badane związki w trakcie ich
naświetlania. Naświetlanie w zakresie 542-742nm. Rejestracja sygnału
semichinionu. Pomiary wykonywane dla związków rozpuszczonych w różnych
środowiskach.
A
B
1,0E+06
chl2 PBS
chl2 PBS+50u/ml SOD
chl2 PBS+0,5% tritonX100 (siatka)
chl2 PBS+0,5% tritonX100+0,5mM NADH (siatka)
8,0E+05
1400000
4,0E+05
1200000
2,0E+05
0,0E+00
Signal amplitude(a.u.)
Signal intensity [a.u.]
6,0E+05
-2,0E+05
-4,0E+05
-6,0E+05
-8,0E+05
-1,0E+06
-1,2E+06
3380
3385
3390
3395
Magnetic field [G]
3400
1000000
800000
600000
400000
200000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Irradiation time (min)
Rysunek 7. A - Przykładowy zarejestrowany
sygnał semichinionu, B – struktura chemiczna
sondy spinowej Tiron.
Wykres 5. Zmiany amplitudy rejestrowanego
sygnału semichinionu w trakcie naświetlania
chl 2.
Podsumowanie
Stopień monomeryzacji chloryn w badanych środowiskach
determinuje fotosensybilizującą efektywność, wpływa również na
rodzaj mechanizmu działania jaki dominuje w danym układzie.
Prowadzone badania potwierdziły wytwarzanie przez badane
związki reaktywnych form tlenu.
W środowisku wodnym przeważa mechanizm typu I, w którym
kluczowa rolę odgrywają wolne rodniki takie jak anionorodnik
ponadtlenkowy i rodnik hydroksylowy.
W środowisku micelarnym dużą rolę będzie odgrywał Typ II
fotosensybilizowanego utleniania. Jednakże Typ I zdaje się wciąż
być bardzo znaczący, a nawet bardziej niż w środowisku
hydrofilowym.
Dziękuję za uwagę