FLEX Monoclonal Mouse Octamer-Binding Transcription
Transkrypt
FLEX Monoclonal Mouse Octamer-Binding Transcription
FLEX Monoclonal Mouse Octamer-Binding Transcription Factor 3/4 Clone N1NK Ready-to-Use (Link) Nr kat. IR092 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Preparat Monoclonal FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Octamer-Binding Transcription Factor 3/4, Clone N1NK, Ready-to-Use (Link) jest przeznaczony do stosowania w immunohistochemii. Przeciwciała przeciwko czynnikowi transkrypcji sekwencji oktamerowej 3/4 (Oct3/4) znajdują zastosowanie w identyfikacji określonych podtypów guzów zarodkowych, w tym nasieniaka, raka zarodkowego oraz niesklasyfikowanej wewnątrzprzewodowej neoplazji komórek zarodkowych (IGCNU) (1-4). Interpretacja kliniczna wystąpienia barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Synonimy antygenu Białko wiąŜące sekwencję oktamerową 3 (Oct3), czynnik transkrypcji sekwencji oktamerowej 3 (Otf3), białko wiąŜące sekwencję oktamerową 4 (Oct4), czynnik transkrypcji sekwencji oktamerowej 4 (Otf4), POU5F1 (1-3, 5, 6). Podsumowanie i wyjaśnienie Alternatywny splicing powoduje powstanie dwóch wariantów mRNA ludzkiego genu Oct4 zlokalizowanego na chromosomie 6, zwanych pierwotnie Oct3A oraz Oct3B (7), które ostatecznie przyjęły nazwę Oct3/4. Izoformy Oct3A i Oct3B składają się odpowiednio z 360 i 265 aminokwasów, z których 225, zlokalizowanych w obrębie Ckońca sekwencji, jest identycznych. Czynnik Oct3/4 naleŜy do rodziny czynników transkrypcji POU (Pit-Oct-Unc) aktywujących ekspresję swoich genów docelowych przez wiązanie sekwencji oktamerowej AGTCAAAT (6). Oct3/4 ulega ekspresji w komórkach embrionalnych oraz komórkach zarodkowych (1) i pełni kluczową rolę w układzie regulacji transkrypcyjnej odpowiedzialnym za samoodnowę, zdolność do wielokierunkowego róŜnicowania się, a takŜe przynaleŜność do linii embrionalnych komórek macierzystych oraz komórek macierzystych ze zdolnością do wielokierunkowego róŜnicowania się (5). Ekspresja Oct3/4 występuje równieŜ w określonych podtypach guzów zarodkowych, takich jak nasieniaki, rozrodczaki, dysgerminoma, rak zarodkowy, komórki zarodkowe gonadoblastomów oraz IGCNU (1, 2, 4). Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC. Odczynnik dostarczony Mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci nadsączu hodowli komórkowej w buforze Tris-HCl o stęŜeniu 0,05 mol/l, zawierającym azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/l, o pH 7,2. Produkt zawiera białko stabilizujące. Klon: N1NK. Izotyp: IgG1. Immunogen Białko rekombinowane odpowiadające 147 aminokwasom na N-końcu ludzkiego białka Oct3/4. Swoistość W testach Western blot lizatów komórkowych hES-TW1 przeciwciało anty-Oct3/4, klon N1NK, rozpoznaje pasmo o masie cząsteczkowej ok. 40 kDa odpowiadające oczekiwanej masie cząsteczkowej białka Oct3/4 (8). Środki ostroŜności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować właściwe procedury postępowania. 4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne. 5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi. Przechowywanie (123656-001) Przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Nie nale Ŝy uŜywać odczynników po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne. P02767PL_002_IR092/2013.08 p. 1/4 W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Skrócona instrukcja uŜytkownika Krok Komentarze Utrwalanie Obróbka wstępna Formalina EnVision FLEX™, High pH (nr kat. K8004) ND 20 min HIER, 3 w 1 z uŜyciem PT Link i PT Link Rinse Station Rozcieńczenie Bufor rozcieńczenia Kontrola ujemna Wizualizacja Produkt gotowy do uŜycia Produkt rozcieńczony fabrycznie Inkubacja 20 min ND FLEX Negative Control, Mouse (nr kat. IR750) EnVision™ FLEX+, High pH (nr kat. K8002/K8012) Inkubacja 20 min Inkubacja 20 min, inkubacja w odczynniku Mouse (LINKER) 15 min, inkubacja w odczynniku DAB+ 2x5 min Barwnik kontrastowy Tkanka kontrolna EnVision™ FLEX Hematoxylin (nr kat. K8008/K8018) Nasieniak Inkubacja 5 min Szkiełka FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020) Zaleca się stosowanie w celu uzyskania lepszego przylegania skrawków tkankowych do szkiełek. Zatapianie preparatu Wymagane niewodne, trwałe zatapianie preparatów Po przeprowadzeniu barwienia, skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone i zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania. Oprzyrządowanie Autostainer Link 48 i Autostainer Plus NaleŜy stosować fiolki dostosowane do aparatu (nr kat. SK200-SK203 i S3425) Odczyn jądrowy Odczyn cytoplazmatyczny w obecności silnego odczynu jądrowego jest akceptowalny. *UŜytkownik jest zobowiązany przeczytać ulotki dostarczane do opakowań, które zawierają dokładne instrukcje przeprowadzania procedury barwienia i postępowania z produktem. Przygotowanie próbek Skrawki parafinowe: Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm. Obróbka wstępna: Wymagane jest poddanie utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje się po wstępnej obróbce tkanek metodą HIER przy uŜyciu rozcieńczonego roztworu EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004). Odparafinowanie, nawodnienie i cieplne odmaskowanie antygenu (HIER) moŜna przeprowadzić z uŜyciem Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link (PT Link User Guide). Dla aparatów PT Link naleŜy stosować następujące parametry: Temperatura ogrzewania wstępnego: 65°C; temperatura i czas odmaskowania antyge nu: 97°C przez 20 (±1) minut; ochłodzić do 65°C. Wyj ąć stojak na szkiełka ze zbiornika PT i niezwłocznie zanurzyć szkiełka w słoju lub zbiorniku (np. PTLinkRinseStation, nr kat. PT109) zawierającym rozcieńczony bufor EnVision™ FLEXWashBuffer (20x) (nr kat. K8007) w temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na 1-5 minut. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia, skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania. Procedura barwienia Wizualizacja: Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+, High pH (nr kat. K8002/K8012) łącznie z EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (nr kat. K8021/K8022) przy stosowaniu trwającego 20 minut okresu inkubacji w temperaturze pokojowej. Czas inkubacji EnVision FLEX+ Rabbit (LINKER) (nr kat. K8021/K8022) wynosi 15 minut w temperaturze pokojowej. Postępować zgodnie z procedurą dostarczoną z wybranymi systemami do wizualizacji. Program: W systemie Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana objętość uŜytego odczynnika to 1 x 200 µl lub 2 x 150 µl na preparat. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym systemie Autostainer Link, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Program instalacyjny oprogramowania Autostainer Link moŜna znaleźć pod adresem www.dako.com\Installer. Ten program instalacyjny uzupełni oprogramowanie DakoLink o dane protokołu i odczynnika Anti-Human Oct3/4, Clone N1NK. Krótka nazwa protokołu przeciwciała to Oct3/4. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Barwienie kontrastowe: Zalecanym barwnikiem kontrastowym jest EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (nr kat. K8008). W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. (123656-001) P02767PL_002_IR092/2013.08 p. 2/4 Kontrole: Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować nasieniaka lub raka zarodkowego, natomiast komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki, jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750). Interpretacja wybarwienia Charakterystyka działania Przeciwciała dają odczyn jądrowy. Rozsiany odczyn cytoplazmatyczny w obecności silnego odczynu jądrowego jest akceptowalny. . Tkanki prawidłowe: Przeciwciała anty-Oct3/4 nie wykazywały reaktywności w jądrze komórkowym w Ŝadnej z przebadanych prawidłowych tkanek (9). Rodzaj tkanki (liczba badanych przypadków) Nadnercza (3) Szpik kostny (3) Gruczoły sutkowe (3) Składniki tkankowe dające dodatni odczyn MóŜdŜek (3) 0/3 Rodzaj tkanki (liczba badanych przypadków) Trzustka (3) Przytarczyce (3) Przysadka mózgowa (3) Gruczoł krokowy (3) Mózgowie (3) 0/3 Ślinianki (3) Szyjka macicy (3) 0/3 Mięśnie szkieletowe 0/3 Jelito grube (3) 0/3 Skóra (3) 0/3 Przełyk (3) 0/3 Jelito cienkie (3) 0/3 Serce (3) 0/3 Śledziona (3) 0/3 Nerki (3) 0/3 śołądek (3) 0/3 Wątroba (3) 0/3 Jądra (3) 0/3 Płuca (3) 0/3 Grasica (3) 0/3 Komórki międzybłonka (3) Nerwy obwodowe (3) 0/3 Tarczyca (3) 0/3 0/3 Migdałki (3) 0/3 Jajniki (3) 0/3 Macica (3) 0/3 0/3 0/3 0/3 Składniki tkankowe dające dodatni odczyn 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Uwaga: zaobserwowano słabo dodatni odczyn immunohistochemiczny w cytoplazmie komórek nabłonka w 3 róŜnych prawidłowych typach tkanek. Składniki wykazujące reakcję obejmują komórki nabłonkowe jądra (2/3), Ŝołądka (1/3) oraz jelita cienkiego (2/3). Słabo dodatni odczyn był obecny w części komórek nabłonkowych jądra (10-20%), Ŝołądka (50%) i jelita cienkiego (20%). Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. (123656-001) Cheng L. Establishing a germ cell origin for metastatic tumors using OCT4 immunohistochemistry. Cancer 2004;101:2006-10. Jones TD, Ulbright TM, Eble JN, Cheng L. OCT4: A sensitive and specific biomarker for intratubular germ cell neoplasia of the testis. Clin Cancer Res 2004;10:8544-47. Ulbright TM. Germ cell tumors of the gonads: a selective review emphasizing problems in differential diagnosis, newly appreciated, and controversial issues. Modern Path 2005;18:S61-79 Hoei-Hansen CE, Kraggerud SM, Abeler VM, Karen J, Meyts ERD, Lothe RA. Ovarian dysgerminoma are characterised by frequent KIT mutations and abundant expression of pluripotency markers. Molecular Cancer 2007;6:12 Bhartiya D, Kasiviswanathan S, Unni SK, Pethe P, Dhabalia J, Patwardhan S i inni Newer insights into premeiotic development of germ cells in adult human testis using Oct-4 as a stem cell marker. J Histochem Cytochem 2010;58:1093-1106. Pan GJ, Chang ZY, Pei D. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4. Cell Res 2002;12:321-9. Takeda J, Seino S, Bell GI. Human Oct3 gene family: cDNA sequences, alternative splicing, gene organization, chromosomal location, and expression at low levels in adult tissues. Nucleic Acids Res 1992;20:4613–20. Yu J. Mouse Monoclonal Anti-Oct3/4: A test of the specificity of Anti-Oct3/4 clone N1NK by Western blotting. 2013;D15899. Yu J. Report of normal tissue immunohistochemical testing using mouse anti-human Octamer-binding transcription factor (Oct3/4), Clone N1NK. 2013;D13564. P02767PL_002_IR092/2013.08 p. 3/4 Wydanie 08/13 (123656-001) P02767PL_002_IR092/2013.08 p. 4/4