pobierz

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 1, str. 75–84
PRACA ORYGINALNA – Original Article
STANISŁAW POTOCZEK1, DARIUSZ WOŁOWIEC1, BOŻENA JAŹWIEC1, KATARZYNA KAPELKO-SŁOWIK1, DONATA URBANIAK-KUJDA1, KAZIMIERZ KULICZKOWSKI1, ANNA KORYCKA-WOŁOWIEC2
Apoptoza spontaniczna i indukowana przez inhibitor kinazy fosfatydyloinozytolu 3 LY-294002 oraz ekspresja białka p27Kip1 w limfocytach przewlekłej białaczki limfocytowej
Spontaneous and phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor LY294002-induced
apoptosis and p27Kip1 expression in chronic lymphocytic leukemia cells
1
Z Katedry i Kliniki Hematologii Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku Akademii Medycznej we Wrocławiu
Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med. Kazimierz Kuliczkowski
2
Z Katedry i Kliniki Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. med. Tadeusz Robak
STRESZCZENIE
W patogenezie przewlekłej białaczki limfocytowej (PBL) kluczową rolę odgrywa zahamowanie zaprogramowanej
śmierci komórek białaczkowych. Jednym z najważniejszych mechanizmów wewnątrzkomórkowych powodujących
wydłużenie przeżycia limfocytów PBL jest konstytucyjna aktywacja kinazy fosfatydyloinozytolu-3 (PI3K), która za
pośrednictwem kinazy białkowej C δ (PKC δ) lub na drodze zależnej od kinazy Akt, poprzez czynnik jądrowy NFκB, aktywuje ekspresję szeregu genów kodujących białka o działaniu antyapoptotycznym. Dotychczas nie zostało
ustalone, na ile aktywność tego szlaku wpływa na obraz kliniczny choroby i jej dynamikę. Celem naszych obecnych
badań jest uzupełnienie wcześniejszych obserwacji i ocena związku pomiędzy żywotnością i apoptozą limfocytów
białaczkowych, poddanych działaniu LY294002 w 24-godzinnej hodowli, a obrazem klinicznym 25 nieleczonych
chorych na PBL w różnych stadiach zaawansowania klinicznego. Apoptozę wczesną oceniono na podstawie spadku
potencjału mitochondrialnego (wiązanie barwnika CMXRos), natomiast apoptozę późną na podstawie eksternalizacji
fosfatydyloseryny (znakowanie anneksyną V). Zbadano również komórkową ekspresję Ser473-Akt jako kinazy efektorowej PI3K oraz białka antyproliferacyjnego p27Kip1 o postulowanym działaniu antyapoptotycznym. Przeżywalność
i apoptozę limfocytów krwi obwodowej in vitro oceniano w obecności DMSO (apoptoza spontaniczna) lub z dodatkiem LY294002 (apoptoza indukowana). Dodanie do hodowli LY294002 istotnie zmniejszało przeżycie i zwiększało
apoptozę limfocytów w stosunku do apoptozy spontanicznej. Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy apoptozą
spontaniczną i indukowaną, szczególnie ocenianą metodą MCXRos, a limfocytozą krwi obwodowej. Nie wykazano
natomiast związku pomiędzy apoptozą ani żywotnością limfocytów, a pozostałymi parametrami klinicznohematologicznymi. Ser473-Akt nie była wykrywalna w limfocytach białaczkowych zarówno ex vivo, jak i po hodowli.
P27Kip1 było natomiast wykrywalne we wszystkich limfocytach, a jego zawartość komórkowa, cechowała się zmiennością osobniczą i nie wykazywała związku z podatnością limfocytów na apoptozę in vitro, ani z podstawowymi danymi kliniczno-laboratoryjnymi pacjentów. Nasze obserwacje wskazują, że konstytucyjna aktywność PI3K, której
pośrednim wskaźnikiem jest wrażliwość limfocytów na proapoptotyczne działanie LY294002, jest jednym z czynników przyczyniających się do akumulacji limfocytów we krwi. Zagadnienie zaangażowania białek Akt i p27Kip1
w apoptozę limfocytów białaczkowych in vivo wymaga jednak dalszych badań.
SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka limfocytowa – Apoptoza – Inhibitor kinazy fosfatydyloinozytolu-3 – p27Kip1
SUMMARY
Inhibition of apoptosis plays a crucial role in the pathology of chronic lymphocytic leukemia (CLL). CLL lymphocytes contain a constitutively activated phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), which is considered to trigger an antiapoptotic signaling pathway leading, by intermediate of kinase Akt or protein kinase Cδ, and nuclear factor-kappa B
76
S. POTOCZEK i wsp.
(NF-κB), to the expression of a number of antiapoptotic genes. LY294002, a specific inhibitor of PI3K, induces apoptosis in CLL lymphocytes. However, it is not known what is the influence of the constitutively activated PI3K-Akt
pathway on the clinical picture of the disease. The aim of the current study was to complete our previous observations
and to reassess the relationship between viability, spontaneous and LY294002-induced apoptosis of CLL lymphocytes maintained in 24 hours culture, and clinical picture of the disease, using two apoptosis assessment methods: loss
of mitochondrial potential (CMXRoss staining) and phosphatidyloserin externalization (annexin V staining). We
checked also intracellular content of Ser473-Akt, a downstream effector of PI3K activity, and p27Kip1, an antiproliferative protein with presumed antiapoptotic properties towards CLL cells. 25 previously untreated patients with CLL
were enrolled into the study. Their peripheral blood lymphocytes were maintained in 24-hours culture either with
LY294002 (LY294002-induced apoptosis) or with DMSO instead this agent (spontaneous apoptosis). LY294002 significantly decreased the viability and increased the apoptosis ratio in cultures as compared to spontaneous one. We
found a correlation between LY294002-induced apoptosis, especially assessed by MCXRos staining, and peripheral
blood lymphocytosis. Apoptosis and viability showed no relationship with the other clinical and hematological parameters studied. Ser473-Akt was undetectable in both fresh and cultured lymphocytes. P27Kip1 was expressed in all
CLL, but its cellular content varied from one patient to another. This content was not related to in vitro apoptosis and
viability of CLL lymphocytes, or to clinical and hematological parameters studied. Our observations suggest, that the
activity of PI3K, as assessed directly by the susceptibility of lymphocytes to the proapoptotic action of its inhibitor,
LY294002, may contribute to the accumulation of leukemic lymphocytes in peripheral blood of CLL patients. The issue of involvement of Akt kinase and p27Kip1 protein in the in vivo apoptosis of CLL lymphocytes requires further
studies.
KEY WORDS: Chronic lymphocytic leukemia – Apoptosis – Phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor – p27Kip1 protein
WSTĘP
Do najważniejszych zjawisk wewnątrzkomórkowych odpowiedzialnych za akumulację limfocytów
CD5+/CD19+ w przewlekłej białaczce limfocytowej (PBL) należy występujące in vivo zahamowanie ich
zaprogramowanej śmierci (apoptozy). Na zahamowanie apoptozy limfocytów PBL mają wpływ czynniki mikrośrodowiska, np. cytokiny (IL-4, IL-8, IFN gamma), oraz zjawiska wewnątrzkomórkowe polegające na konstytutywnej aktywacji prożyciowych szlaków przekazywania sygnałów [1, 2]. Spośród
tych zjawisk, kluczową rolę dla przeżycia limfocytów PBL przypisuje się kinazie fosfatydyloinozytolu3 (PI3K). Kinaza ta, podobnie jak zależna od niej kinaza białkowa Cδ, ulega w tych komórkach konstytucyjnej aktywacji. PI3K jest zbudowana z podjednostki katalitycznej o masie cząsteczkowej 110 kDa
oraz podjednostki regulacyjnej p85. Aktywacja PI3K prowadzi do zwiększonej ekspresji genów kodujących białka antyapoptotyczne, takie jak białka z rodzin Bcl-2 i IAP (inhibitors of apoptosis) oraz do
unieczynnienia kaspaz 3 i 8. Proces ten zachodzi za pośrednictwem kinazy białkowej Akt lub na drodze
zależnej od kinazy białkowej Cδ (PKCδ) i powoduje, za pośrednictwem czynnika jądrowego NF-κB,
zwiększenie ekspresji szeregu genów kodujących czynniki zaangażowane w przeżycie komórek. Produkty PI3K: 3,4-dwufosforan oraz 3,4,5-trójfosforan fosfatydylinozytolu, łączą się z kinazą serynowotreoninową Akt, co prowadzi do jej przemieszczenia z cytoplazmy do wewnętrznej powierzchni błony
komórkowej. Tam Akt ulega aktywacyjnej fosforylacji na reszcie treoniny 308 (Thr308) i seryny 473
(Ser473). Aktywowana Akt fosforyluje z kolei szereg wewnątrzkomórkowych czynników uczestniczących w regulacji przeżycia komórki, zapobiegając jej apoptozie. Tym samym kinaza Akt jest ważnym
efektorem antyapoptotycznego działania PI3K, a jej aktywację, konstytutywną lub indukowaną bodźcami o charakterze prożyciowym, stwierdzono w komórkach PBL, choć niektóre badania sugerują, że
Akt może być też aktywowana niezależnie od PI3K [3–8] .
Pomimo bardzo licznych danych doświadczalnych wskazujących na rolę zahamowania apoptozy
limfocytów białaczkowych w patogenezie PBL, nie ustalono dotychczas, jaki jest udział prożyciowych
mechanizmów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych w akumulacji limfocytów białaczkowych in vivo
oraz w kształtowaniu obrazu klinicznego tej choroby. Nasza wiedza na temat tego aspektu biologii jest
bardzo niepełna, co w dużej mierze wynika z trudności metodologicznych, dotyczących oceny przeżywalności limfocytów białaczkowych in vivo. Wyniki badań dotyczących przeżywalności limfocytów
Apoptoza spontaniczna i indukowana
77
białaczkowych in vitro w krótkoterminowych hodowlach nie odzwierciedlają bowiem w pełni właściwości tych komórek in vivo, gdyż jak wiadomo, wydłużenie ich wewnątrzustrojowego czasu przeżycia
kontrastuje ze zwiększoną podatnością na apoptozę w warunkach hodowli in vitro. Prawdopodobnie
dlatego jedynie w bardzo nielicznych badaniach udało się wykazać związek pomiędzy dłuższym czasem przeżycia limfocytów białaczkowych in vitro, a bardziej agresywnym przebiegiem choroby [9].
W przeprowadzonych wcześniej badaniach wykazaliśmy, zgodnie z doniesieniami innych autorów
[3, 4, 6], że obecność inhibitora PI3K, LY294002, w krótkoterminowej hodowli limfocytów krwi obwodowej pacjentów chorych na PBL zwiększa odsetek komórek apoptotycznych, w stosunku do wartości obserwowanej w hodowli bez tego czynnika. Pośrednio świadczy to o aktywności PI3K w badanych populacjach komórek białaczkowych. Wykazaliśmy ponadto, że apoptoza zależna od LY294002
była istotnie wyższa u chorych, u których doszło do progresji choroby lub rozwoju takich jej objawów,
które stanowiły wskazanie do rozpoczęcia leczenia [10]. Obserwacja ta nasuwa przypuszczenie, że
wyższa aktywność PI3K w limfocytach PBL jest związana z większą dynamiką choroby. Wymaga to
jednak potwierdzenia badaniami bezpośrednio oceniającymi aktywność tej kinazy w komórkach poddanych działaniu jej inhibitora.
Act ufosforylowana na reszcie Ser473 (fosfo-Akt Ser473) jest wyrazem aktywacji szlaku PI3K-Akt,
podczas gdy białko p27Kip1 jest uniwersalnym inhibitorem kompleksów kinaz cyklinozależnych z cyklinami o właściwościach antyproliferacyjnych o postulowanej, choć nie udowodnionej formalnie, roli
prożyciowej w komórkach PBL [11, 12]. Celem badań była odpowiedz na pytanie czy apoptoza indukowana in vitro przez zahamowanie szlaku PI3K-Akt ma związek z obrazem kliniczno-hematologicznym PBL. Przedstawione poniżej badania stanowią uzupełnienie dokonanych wcześniej obserwacji o ocenę wpływu inhibitora kinazy fosfatydyloinozytolu 3, jakim jest LY294002 na spadek potencjału mitochondrialnego, jako wczesnego etapu apoptozy oraz przedstawiają komórkową ekspresję białka
p27Kip1 w limfocytach PBL ex vivo oraz po 24-godzinnej hodowli.
MATERIAŁ I METODY
Pacjenci
Badaniami objęto 25 nie leczonych chorych na PBL: 16 mężczyzn i 9 kobiet w wieku 52-95 lat (śr.
71,4, SD 11,3), będący pod opieką Poradni Hematologicznej SPSK1 we Wrocławiu w latach 20092010. Rozpoznanie choroby ustalono na podstawie ogólnie przyjętych kryteriów, przyjmując 5,0 G/l
jako dolną wartość graniczną liczby limfocytów krwi obwodowej o fenotypie CD5+/CD19+/CD23+ [13].
Dziewięciu chorych było w stadium zaawansowania klinicznego 0 wg Rai, 9 było w stadium I, 2 w II, 1
w III i czterech pozostałych w IV stadium. Liczba leukocytów wynosiła 16,2 – 150 G/l (śr. 51,3 + 38,2)
G/l, limfocytów 14,5 – 130,0 (śr. 45,2 + 32,4) G/l, poziom hemoglobiny 7,7 – 15,8 (śr. 12,9 + 1,89)
g/dl, liczba płytek krwi 51 – 266 (śr. 156,3 + 53,9) G/l. U 6 spośród 25 pacjentów (24%) wykazano
dodatnią ekspresję antygenu CD38, rozumianą jako jego obecność na co najmniej 20% komórek. Dodatnią ekspresję ZAP-70, również rozumianą jako wykrywalność tego antygenu w co najmniej 20%
komórek, stwierdzono u 11 chorych (44%).
Badanie uzyskało akceptację Komisji Bioetycznej przy Akademii Medycznej we Wrocławiu,
a wszyscy chorzy wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu. Materiał do badań stanowiły limfocyty
krwi obwodowej uzyskane od chorych w celu wykonania rutynowych badań diagnostycznych.
Ocena ekspresji antygenów CD5, CD19, CD23, CD38, ZAP-70, białek fosfo-Akt Ser473 i p27Kip1
Komórki jednojądrowe (MNC) izolowano z krwi obwodowej w gradiencie gęstości z użyciem Gradisolu L (Aqua Medica, Łódź). Koekspresję antygenów CD5, CD19 i CD23 wykazano na powyżej 90%
uzyskanych komórek. U wszystkich chorych na komórkach białaczkowych określono ponadto cytoflu-
78
S. POTOCZEK i wsp.
orometrycznie ekspresję antygenu CD38 i cytoplazmatyczną ekspresję białka ZAP-70, białka foso-Akt
Ser473, a u 20 pacjentów dodatkowo ekspresję białka p27Kip1. Wykorzystano w tym celu przeciwciała
monoklonalne do wybarwiania antygenów powierzchniowych (Beckman Coulter, Kanada), odczynnik
do utrwalania/permeabilizacji (IntraPrep, Beckman Coulter, Kanada), przeciwciało anty-ZAP-70
(Beckman Coulter, Kanada), mysie przeciwciało anty- p27Kip1 (Becton Dickinson, USA), odpowiednią
kontrolę izotypową i odczynnik do permeabilizacji (Perm 2 Permeabilizing Solution 2, Becton Dickinson, USA), królicze przeciwciało monoklonalne anty fosfo-Akt (Ser473) skoniugowane z Alexa Fluor
488 i króliczą kontrolę izotypową (Cell Signaling Technology, USA) oraz drugorzędowe przeciwciało
kozie przeciwko mysim immunoglobulinom skoniugowane z fluoresceiną (Dako, Dania). Do permabilizacji błon komórkowych w celu oznaczenia ekspresji Ser473-Akt komórki utrwalano w 3,7% paraformaldehydzie (Sigma, Wielka Brytania) i permeabilizowano przez 30 min w 90% metanolu na lodzie.
Kontrolą pozytywną dla oznaczania Ser473-Akt były komórki linii Jurkat.
Badanie żywotności komórek oraz apoptozy spontanicznej i indukowanej LY294002
MNC w stężeniu 1x106 komórek/ml poddawano 24-godzinnej hodowli. Stosowano w tym celu
płytki 6-dołkowe zawierające podłoże hodowlane RPMI 1640 (Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej, Wrocław) z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Invitrogen, USA) oraz gentamycyny (Sigma, Wielka Brytania) w końcowym stężeniu 100 µg/ml. Do hodowli dodawano inhibitor
PI3K, LY294002 (Calbiochem, Niemcy), w końcowym stężeniu 10µM. Ze względu na małą rozpuszczalność LY294002 w podłożu hodowlanym, związek był rozpuszczany w 0,1% dwumetylosulfotlenku
(DMSO). Do hodowli kontrolnych, bez LY294002, dodawano 0,1% DMSO [10].
Żywotność limfocytów białaczkowych oceniano za pomocą wybarwiania błękitem trypanu, traktując komórki które inkorporowały ten barwnik jako martwe. Kolejne etapy apooptozy oceniano przy
użyciu dwóch różnych metod. Apoptozę wczesną badano na podstawie spadku potencjału mitochondrialnego (∆Ψm), natomiast apoptozę późniejszą określaną dalej jako apoptoza zaawansowana oceniano na podstawie wykrywania eksternalizacji fosfatydyloseryny błonowej. Badania wykonywano po
pobraniu krwi od chorego oraz po zakończeniu hodowli.
Spadek ∆Ψm badano za pomocą przyswajania barwnika CMXRos (MitoTraker® Red CMXRos,
Invitrogen, USA) przez mitochondria, zgodnie z instrukcją producenta. Limfocyty inkubowano przez
60 min. z roztworem barwnika w podłożu hodowlanym w temp. 37oC, 5% CO2 , dodając w trakcie inkubacji przeciwciało przeciwko glikoforynie A sprzężone z FITC. Następnie określano cytofluorometrycznie odsetek komórek ulegających apoptozie, czyli nie wybarwiających się CMXRos ani nie wiążących przeciwciała przeciwko glikoforynie A (komórki ∆Ψmlow/Gly-A-).
Eksternalizację fosfatydyloseryny błonowej wykrywano poprzez znakowanie komórek anneksyną V
sprzężoną z FITC (Becton Dickinson, USA) oraz równocześnie jodkiem propydyny w buforze bogatym w
jony wapnia i analizowano cytofluorometrycznie. Odsetek komórek ulegających apoptozie obliczano jako
sumę odsetka komórek barwiących się tylko anneksyną oraz anneksyną i jodkiem propydyny.
Na podstawie danych uzyskanych bezpośrednio po pobraniu komórek (ex vivo) oraz po zakończeniu hodowli obliczano apoptozę spontaniczną, jako różnicę pomiędzy odsetkiem komórek apoptotycznych po zakończeniu hodowli bez LY294002 oraz komórek apoptotycznych ex vivo oraz apoptozę indukowaną LY294002, jako różnicę pomiędzy odsetkiem komórek apoptotycznych po zakończeniu hodowli z LY294002 oraz po hodowli bez tego inhibitora. W analogiczny sposób, określono odsetek limfocytów podatnych na śmierć na drodze apoptozy i/lub nekrozy spontanicznej i indukowanej LY294002
jako tzw. spontaniczną i indukowaną LY294002 utratę żywotności .Oceniano ją na podstawie różnicy
pomiędzy żywotnością komórek przed i po hodowli, w obecności DMSO bez LY294002, oraz po hodowli w obecności LY294002 i bez tego czynnika,
Apoptoza spontaniczna i indukowana
79
Analiza cytofluorometryczna
Analizę cytofluorometryczną wykonywano w cytometrze przepływowym PAS (Partec, Niemcy)
wyposażonym w laser argonowy o mocy 20 mW i program do akwizycji i analizy danych FloMax 2,4b.
Każdorazowo analizie poddawano 15.000 komórek. W przypadku badania apoptozy obliczano odsetek
komórek wiążących anneksynę lub MCXRos. Oznaczając ekspresję p27Kip1 badano średnią intensywność fluorescencji (MFI, mean fluorescence intensity) populacji komórek przyswajających odpowiednie
przeciwciało i wyrażano ją w jednostkach umownych (J.U.).
Analiza statystyczna
Rozkład danej cechy ilościowej w badanej populacji porównywano za pomocą testów nieparametrycznych: Manna-Whitney’a oraz testu znaków dla zmiennych powiązanych. Związek pomiędzy
dwiema zmiennymi ilościowymi oceniano za pomocą współczynnika R Spearmana. Za statystycznie
istotne przyjęto p<0,05.
WYNIKI
Żywotność i apoptoza spontaniczna i indukowana limfocytów PBL
Apoptoza limfocytów PBL oznaczona bezpośrednio po pobraniu ich od pacjentów (ex vivo) była niska, a ich żywotność wynosiła średnio powyżej 90%. Po zakończeniu 24-godzinnej hodowli w środowisku DMSO żywotność nie uległa istotnemu zmniejszeniu, ale zaobserwowano istotne zwiększenie się
odsetka komórek apoptotycznych zarówno ocenianych metodą z anneksyną V, jak i MCXRos. Hodowla in vitro z LY294002 istotnie zmniejszyła żywotność oraz zwiększyła apoptozę limfocytów w stosunku do wartości obserwowanych w hodowli bez tego czynnika (Tabela 1).
Tabela 1. Wskaźniki żywotności i apoptozy oraz wewnątrzkomórkowa zawartość p27Kip1 limfocytów krwi obwodowej pacjentów chorych na PBL poddanych 24-godzinnej hodowli w obecności DMSO oraz inhibitora kinazy fosfatydyloinozytolu 3,
LY294002.
Table 1. Viability, apoptosis and intracellular p27Kip1 content in lymphocytes obtained from patients with chronic lymphocytic
leukemia after 24 hours culture with dimethylosulfoxide (DMSO) and phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor LY294002.
24-godzinna hodowla
LY294002
∆ (DMSO
∆(LY294002p
– ex vivo)
DMSO)
1
2
3
4
5
91,8+5,7
90,2+8,3
78,8+15,5
5,0+6,5
11,4+10,4
2 vs 1=NZ
Żywotność
(76-98)
(68-99,6)
(45,1-96,8)
(0,0 - 19,2)
(0,0 - 39,1)
3 vs 2= 0,00002
(%)
13,0+8,1
29,4+16,0
44,3+16,4
17,2+15,2
15,2+7,9
2 vs 1= 0,0003
Anneksyna V
(2,3-35,6)
(5,8-69,6)
(17,7-67,4)
(0,0-63,5)
(0,0-30,9)
3 vs 2=0,00001
(%)
4,0+3,2
21,9+19,8
36,3+21,7
18,3+18,6
14,6+10,3
2 vs 1=0,00006
CMXRos
(1,1-14,1)
(3,2-81,3)
(4,6-89,3)
(0,0-65,5)
(0,0-41,3)
3 vs 2=0,00001
(%)
6,4+4,0
5,9+2,5
6,0+2,4
-0,6+3,5
0,08+1,1
2 vs 1: NZ
p27Kip1
(1,9-18,6)
(2,3-10,1)
(2,4-10,7)
(-9,2-8,2)
(-2,5-2,2)
3 vs 2: NZ
(J.U.)
DMSO: dwumetylosulfotlenek; LY294002: inhibitor kinazy fosfatydyloinozytolu 3;
Ex vivo: wartość danego parametru w limfocytach bezpośrednio po pobraniu od chorego; ∆(DMSO – ex vivo): różnica w
wartości danego parametru pomiędzy oznaczeniem po hodowli kontrolnej, a wynikiem ex vivo; ∆(LY294002-DMSO): różnica
w wartości danego parametru pomiędzy oznaczeniem po hodowli z dodatkiem LY294002, a hodowli kontrolnej; żywotność:
odsetek komórek nie przyswajających błękitu trypanu; anneksyna V: odsetek komórek wybarwiających się anneksyną V;
CMXRos: odsetek komórek o niskim powinowactwie do CMXRos; J.U.: jednostki umowne; P- analiza statystyczna; NZ:
statystycznie niezamiennie
W każdym polu podano wartość średnią + odchylenie standardowe oraz zakres obserwowanych wartości.
ex vivo
DMSO
S. POTOCZEK i wsp.
80
Limfocytoza (G/L)
Nie stwierdzono zależności pomiędzy apoptozą lub ”śmiertelnością” limfocytów a podstawowymi
danymi kliniczno-hematologicznymi pacjentów, jak wiek, płeć, stadium zaawansowania klinicznego,
poziom hemoglobiny i liczba płytek. Stwierdzono natomiast związek pomiędzy liczbą limfocytów,
a ich „śmiertelnością” (R=0,40, p = 0,05), jak i apoptozą wczesną spontaniczną (R=0,51, p=0,009),
a także związek pomiędzy liczbą limfocytów a ich śmiertelnością” zależną od LY294002, apoptozą
wczesną i zaawansowaną (R=0,58, p= 0,002; R=0,54 ,p=0,005 i R=0,39, p=0,05; odpowiednio, Rycina
1). Apoptoza indukowana LY294002 była nieco wyższa u pacjentów wykazujących ekspresję CD38
(20,21 + 7,44) w porównaniu do chorych CD38– (12,81 + 10,52) (p=0,04).
140
120
R=0,5434 p=0,005
100
80
60
40
20
0
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Apoptoza wczesna zależna od LY294002
Ryc. 1. Zależność pomiędzy liczbą limfocytów we krwi obwodowej a apoptozą wczesną indukowaną przez LY294002
Fig. 1. The relationship between the peripheral blood lymphocyte count and early apoptosis induced by LY294002
Ekspresja p27Kip1 i Ser437-Akt w limfocytach PBL
Obecność p27Kip1 wykazano w prawie wszystkich limfocytach (>90% komórek), jednak zawartość
komórkowa oceniana za pomocą MFI wykazywała zmienność, zawierając się w granicach 1,92 – 18,63
(śr. 6,42 + 4,04) J.U. Była ona wyższa u pacjentów wykazujących ekspresję antygenu ZAP-70 niż
u chorych ZAP-70- (odpowiednio 8,41 + 4,55 i 4,45 + 2,26 I.U., p = 0,02). Poza tym nie wykazywała
ona związku z podstawowymi danymi klinicznymi i hematologicznymi (wiek, płeć, stadium zaawansowania klinicznego, liczba limfocytów i płytek, poziom hemoglobiny, ekspresja CD38), apoptozą
i „śmiertelnością” spontaniczną ani indukowaną. Komórkowa zawartość p27Kip1 nie ulegała istotnym
zmianom podczas hodowli w obecności DMSO i LY294002 (Tabela 1).
Apoptoza spontaniczna i indukowana
81
W żadnej z badanych populacji limfocytów PBL nie wykryto ekspresji Ser437-Akt zarówno bezpośrednio po pobraniu od pacjenta, jak i po hodowli z DMSO lub LY294002.
DYSKUSJA
W patogenezie PBL kluczową rolę odgrywa zahamowanie zaprogramowanej śmierci komórek białaczkowych spowodowane konstytutywną aktywacją wewnątrzkomórkowych, prożyciowych szlaków
przekazywania sygnałów, jak i oddziaływaniem zewnątrzkomórkowych czynników mikrośrodowiska,
takich jak cytokiny i komórki podścieliska szpiku. To właśnie czynniki środowiskowe są prawdopodobnie odpowiedzialne za przedłużone przeżycie komórek białaczkowych w warunkach wewnątrzustrojowych, gdyż utrzymywane w hodowli in vitro obumierają w większym stopniu niż limfocyty prawidłowe. Jednym z kluczowych mechanizmów wewnątrzkomórkowych powodujących wydłużenie
przeżycia limfocytów PBL jest konstytucyjna aktywacja PI3K. Kinaza ta, za pośrednictwem kinazy
białkowej Cδ (PKC δ) lub na drodze zależnej od kinazy Akt, poprzez czynnik jądrowy NF-κB, aktywuje ekspresję szeregu genów kodujących białka o działaniu antyapoptotycznym, takich jak: Mcl-1, BclxL czy XIAP. Pośrednim dowodem na to jest obserwacja, że LY294002, będący specyficznym inhibitorem PI3K, indukuje apoptozę limfocytów PBL w warunkach in vitro [3-8]. Pomimo udowodnionej roli
szlaku PI3K w zahamowaniu śmierci limfocytów PBL, nie zostało ustalone na ile aktywność tego szlaku wpływa na obraz kliniczny choroby i jej dynamikę. W poprzednio opublikowanych badaniach wykazaliśmy, że apoptoza limfocytów PBL indukowana w hodowli in vitro przez LY294002 jest wyższa
u pacjentów z progresywną postacią białaczki w stosunku do limfocytów uzyskanych od chorych na
białaczkę o stabilnym przebiegu [10].
Celem przedstawionych powyżej badań jest uzupełnienie powyższych obserwacji poprzez ocenę
związku pomiędzy żywotnością i apoptozą limfocytów białaczkowych zachodzącą w krótkoterminowej
hodowli pod wpływem LY294002, a obrazem klinicznym nie leczonych chorych na PBL. Apoptozę
ocenialiśmy nie tylko za pomocą znakowania anneksyną V, która rozpoznaje eksternalizację fosfatydyloseryny, a więc zaawansowany etap zaprogramowanej śmierci komórki, ale także poprzez wykrycie
spadku potencjału mitochondrialnego, co zachodzi w początkowej fazie tego procesu i uwidacznia się
niskim wychwytem barwnika CMXRos. Zbadaliśmy też, czy apoptozie indukowanej LY294002 towarzyszy pobudzenie komórkowej ekspresji kinazy serynowo-treoninowej Akt ufosforylowanej na reszcie
Ser473, co ma miejsce podczas jej aktywacji przez PI3K, a także oceniliśmy zawartość białka antyproliferacyjnego p27Kip1 o postulowanej aktywności antyapoptotycznej wobec limfocytów PBL.
Zgodnie z oczekiwaniem, limfocyty PBL podczas 24-godzinnej hodowli in vitro ulegały spontanicznej apoptozie, manifestującej się zarówno utratą potencjału mitochondrialnego, jak i eksternalizacją
fosfatydyloseryny. Odsetek komórek apoptotycznych istotnie zwiększał się pod wpływem inhibitora
PI3K, LY294002, co potwierdza ustalony pogląd o kluczowej roli tej kinazy, ulegającej konstytucyjnej
aktywacji w limfocytach białaczkowych, dla przeżycia tych limfocytów [3–7]. Oryginalnym spostrzeżeniem jest to, że apoptoza indukowana LY294002 wykazuje dodatnią korelację z liczbą limfocytów
we krwi obwodowej. Ponieważ wrażliwość limfocytów PBL na proapoptotyczne działanie LY294002
można uznać za pośredni wskaźnik wewnątrzkomórkowej aktywności PI3K, powyższa obserwacja
sugeruje, że zahamowanie śmierci komórkowej w wyniku działania szlaku przewodzenia sygnałów
zależnego od tej kinazy przyczynia się do akumulacji limfocytów we krwi obwodowej pacjentów chorych na PBL. Poprzednio wykazaliśmy, że apoptoza indukowana LY294002 jest wyższa u chorych na
progresywną postać PBL w stosunku do pacjentów ze stabilną chorobą [10]. Spostrzeżenia te wskazują,
że konstytucyjna aktywacja szlaku zależnego od PI3K nie tylko ma kluczowe znaczenie dla przeżycia
limfocytów białaczkowych, ale też w istotnym stopniu przyczynia się do progresji choroby. Stanowi to
podstawę do badań nad skutecznością inhibitorów szlaku PI3K/NFkappaB w leczeniu tej choroby.
Jednym z ogniw antyapoptotycznych szlaków przekazywania sygnałów aktywowanych przez PI3K
jest kinaza serynowo-treoninowa Akt, zwana również kinazą białkową B (PKB). Wiąże się ona z pro-
82
S. POTOCZEK i wsp.
duktami PI3K: 3,4-dwufosforanem oraz 3,4,5-trójfosforanem fosfatydylinozytolu, po czym ulega aktywacyjnej fosforylacji na reszcie treoniny 308 (Thr308) i seryny 473 (Ser473) [14, 15]. Wykazano, że aktywna Akt jest czynnikiem prożyciowym w licznych komórkach, a jej nadekspresję wykazano w różnych nowotworach narządowych [16–18]. Odgrywa ona też istotną rolę w zahamowaniu apoptozy limfocytów PBL, choć jej miejsce w wewnątrzkomórkowych szlakach przekazywania sygnałów prożyciowych nie jest jasne. Stymulacja szlaku sygnałowego poprzez receptor komórek B (B-cell receptor,
BCR) powoduje, między innymi, pobudzenie antyapoptotycznej drogi PI3K/Akt, przy czym długotrwała aktywacja Akt prowadzi do pobudzenia ekspresji białek antyapoptotycznych (Mcl-1, Bcl-xL, XIAP)
oraz większej przeżywalności limfocytów PBL [7]. Niektórzy autorzy opisali podwyższoną aktywność
Akt w limfocytach PBL ex vivo [6,8], co jednak nie znalazło potwierdzenia w innych doniesieniach [3,
4, 7]. Wykazano ponadto, że LY294002 nie wpływa na aktywność enzymatyczną Akt w limfocytach
PBL ex vivo lub stymulowanych za pomocą estrów forbolu (TPA) [6,8], podczas gdy w innych układach doświadczalnych fosforylacja aktywacyjna Akt w komórkach PBL ex vivo była hamowana zarówno przez LY294002, jak i inhibitor kinazy białkowej Cβ (protein kinase C β) [8]. Wskazuje to, że nabycie i utrzymanie przez kinazę Akt aktywności enzymatycznej oraz uruchomienie przez PI3K przyżyciowego szlaku przekazywania sygnałów, może być od siebie zależne w komórkach białaczkowych, ale
może również zachodzić w ramach odrębnych szlaków przekazywania sygnałów.
W przedstawionych badaniach nie stwierdziliśmy ekspresji Ser473-Akt w limfocytach PBL zarówno
ex vivo, jak i po hodowli. Jest oczywiście możliwe, że wynika to ze zbyt małej czułości użytej metody
cytofluorometrycznego wykrywania Ser473-Akt, choć technika ta pozwoliła uwidocznić obecność białka
Ser473-Akt w komórkach linii Jurkat. Należy podkreślić, że obecności ufosforylowanych cząsteczek
omawianej kinazy w świeżo uzyskanych limfocytach PBL nie udało się też wykazać niektórym innym
autorom [3, 4, 7]. Nie wykrycie ekspresji Ser473-Akt, a tym samym aktywnej enzymatycznie formy tej
kinazy, w limfocytach badanych pacjentów chorych na PBL, nie daje więc podstaw do wnioskowania
o jej ewentualnej roli w kształtowaniu obrazu klinicznego tej choroby, która winna być oceniona z użyciem innych metod doświadczalnych.
Badania nad zjawiskami apoptozy w limfocytach PBL uzupełniliśmy oceną zawartości w nich białka p27Kip1. Jest to substancja należąca do rodziny inhibitorów kinaz cyklinozależnych (cdk), hamująca
aktywność większości znanych kompleksów enzymatycznych utworzonych przez cdk oraz ich podjednostki regulacyjne zwane cyklinami, których podstawową rolą jest umożliwienie komórce realizację
kolejnych etapów cyklu podziałowego. p27Kip1 wywiera więc działanie antyproliferacyjne, a niektóre
doniesienia wskazują też na jego pobudzającą lub hamującą rolę w procesie apoptozy [19–21]. Inaczej
niż w przypadku zdecydowanej większości guzów litych, gdzie dochodzi do obniżenia zawartości tego
białka na drodze nasilonej proteolizy [19], p27Kip1 jest wykrywalne w całej populacji limfocytów PBL,
a jego zawartość jest wyższa niż w prawidłowych komórkach CD5+CD19+ [11, 22–24]. Również
w przeciwieństwie do większości nowotworów narządowych, w których obniżenie komórkowej zawartości omawianego białka jest związane z większą agresywnością choroby, podwyższona komórkowa
zawartość p27Kip1 ma niekorzystne znaczenie rokownicze co do dużej dynamiki choroby [11, 23]. Zaobserwowano, że limfocyty białaczkowe wykazujące zwiększoną ekspresję p27Kip1 dłużej przeżywają
w hodowli in vitro, a ich apoptozie wywołanej przez fludarabinę towarzyszy proteoliza p27Kip1 [11,
12]. Sugeruje to, że p27Kip1 wywiera na komórki PBL działanie antyapoptotycznie, co mogłoby tłumaczyć niekorzystne znaczenie rokownicze jego podwyższonej zawartości cytoplazmatycznej.
W przedstawionych wyżej badaniach potwierdziliśmy wcześniejsze doniesienia, że p27Kip1 jest wyraźnie wykrywalne w całej populacji komórek PBL u wszystkich badanych pacjentów, a jego zawartość
cytoplazmatyczna jest zróżnicowania. Nie wykazaliśmy natomiast związku pomiędzy tą zawartością,
a żywotnością limfocytów PBL in vitro i apoptozą spontaniczną lub indukowaną LY294002. Być może
taki wynik doświadczenia wynikał z krótkiego, bo tylko 24-godzinnego czasu hodowli, podczas gdy
Vrhovac i wsp. [11] oceniali cytotoksyczność i wpływ LY294002 na apoptozę po 96-godzinnej hodowli. Zagadnienie związku p27Kip1 z podatnością limfocytów PBL na apoptozę in vitro oraz ich przeży-
Apoptoza spontaniczna i indukowana
83
ciem in vivo wymaga więc dalszych badań. Warto jednak zwrócić uwagę, że średnia zawartość tego
białka była wyższa u pacjentów wykazujących ekspresję ZAP-70 w stosunku do chorych, u których ten
antygen był stwierdzany w mniej niż 20% limfocytów. Może to świadczyć o istnieniu związku pomiędzy ekspresją p27Kip1 a ekspresją ZAP-70, która jest uważana za jeden z najistotniejszych niekorzystnych czynników rokowniczych co do szybkiej progresji choroby.
WNIOSKI
Przedstawione obserwacje sugerują, że konstytucyjna aktywność PI3K, której pośrednim wskaźnikiem jest wrażliwość limfocytów na proapoptotyczne działanie LY294002, jest jednym z czynników
przyczyniających się do akumulacji limfocytów białaczkowych we krwi obwodowej. Zagadnienie
związku pomiędzy białkami Akt i p27Kip1, a podatnością komórek białaczkowych na apoptozę in vitro
i ich czasem przeżycia in vivo wymaga natomiast dalszych badań.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Podhorecka M. Proces apoptozy w patogenezie przewlekłej białaczki limfatycznej B-komórkowej. Post Hig Med Dośw
2004; 58: 236-242.
Munk Pedersen I, Reed JC. Microenvironmental interactions and survival of CLL B-cells. Leukemia and Lymphoma,
2004; 45: 2365-2372.
Barragan M, Bellosillo B, Campas C, Colomer D, Pons G, Gil J. Involvement of protein kinase C and
phosphatydylinositol 3-kinase pathways in the survival of B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood 2002; 99:
2969-2976.
Ringshausen I, Scheller F, Bogner C. et al. Constitutively activated phosphatidylinositol-3 kinase (PI-3K) is involved in
the defect of apoptosis in B-CLL: association with protein kinase Cδ. Blood 2002; 100: 3741-3748.
Cuní S, Pérez-Aciego P, Pérez-Chacón G et al. A sustained activation of PI3K/NF-κB pathway is critical for the survival
of chronic lymphocytic leukemia B-cells. Leukemia 2004; 18: 1391-1400.
Plate JMD. PI3-kinase regulates survival of chronic lymphocytic leukemia B-cells by preventing caspase 8 activation.
Leukemia and Lymphoma 2004; 45: 1519-1529.
Barragan M, de Frias M, Iglesias-Serret D i wsp. Regulation of Akt/PKB by phosphatidylinositol 3-kinase-dependent and
–independent pathways in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells: role of protein kinase C (beta). J. Leukoc. Biol.
2006; 80: 1473-1479.
Longo PG, Laurenti L, Gobessi S, Sica S, Leone G, Efremov DG. The Akt/Mcl-1 pathway plays a prominent role in mediating antiapoptotic signals downstream of the B-cell receptor in chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood 2008;
111: 846-855.
Aguilar-Santelises M, Rottenberg ME, Lewin N, Mellstedt H, Jondal M, Bcl-2, Bax and p53 expression in B-CLL in
relation to in vitro survival and clinical progression Int J Cancer 1996; 69: 114-119.
Wołowiec D, Ganczarski G, Jaźwiec B i wsp. Ekspresja B-LyS oraz apoptoza komórek przewlekłej białaczki limfocytowej Bkomórkowej indukowana inhibitorem kinazy fosfatydyloinozytolu-3 (LY294002). Acta Haematol Pol 2007; 38: 63-73.
Vrhovac R, Delmer A, Tang R, Marie JP, Zittoun R, Ajchenbaum-Cymbalista F. Prognostic significance of the cell cycle
inhibitor p27Kip1 in chronic B-cell lymphocytic leukemia. Blood 1998; 91: 4694-4700.
Sanhes L, Tang R, Delmer A, DeCaprio JA, Ajchenbaum-Cymbalista. Fludarabine-induced apoptosis of B chronic lymphocytic leukemia cells induces early cleavage of p27kip1 by caspases. Leukemia 2003; 17: 1104-1111.
Hallek M, Cheson BD, Catovsky D i wsp. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a
report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer InstituteWorking Group 1996 guidelines. Blood 2008; 111: 5446-5456.
Alessi DR, Andejelkovic M, Caudwell B i wsp. Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF-1. EMBO J
1996; 15: 6541-6551.
Aoki M, Schetter C, Himly M, Batista O, Chang HW, Vogt PK. The catalytic subunit of phosphoinositide 3-kinase:
requirements for oncogeinicity. J Biol Chem 2000; 275: 6267-6275.
Cheng JQ, Godwin AK, Bellacosa A i wsp. AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of proteinserine/threonine kinase, is amplified in human ovarian carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 9267-9271.
Sun M, Wang G, Paciga JE i wsp. Akt1/PKBα kinase is frequently elevated in human cancers and its constitutive activation is
required for oncogenic transformation of NIH3T3 cells. Am J Pathol 2001; 159: 431-437.
Datta SR, Brunet A, Greenberg ME. Cellular survival: a play in three Acts. Genes Dev 1999; 13: 2905-2927.
84
S. POTOCZEK i wsp.
19. Ciszak L, Wołowiec D, Kosmaczewska A, Boćko D, Frydecka I. Białko p27: budowa, funkcje biologiczne oraz udział w
patomechanizmie procesów rozrostowych. Post Biol Kom 2000; 27: 481-503.
20. Katayose Y, Kim M, Rakkar AN, Li Z, Cowan KH, Seth P. Promoting apoptosis: a novel activity associated with the
cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Cancer Res 1997; 57: 5441-5445.
21. Hiromura K, Pippin JW, Fero ML, Roberts JM, Shankland SJ. Modulation of apoptosis by the cyclin-dependent kinase
inhibitor p27(Kip1). J Clin Invest 1999; 103: 597-604.
22. Wołowiec D., Ciszak L., Kosmaczewska A. i wsp. Cell cycle regulatory proteins and apoptosis in B-cell chronic lymphocytic
leukemia. Haematologica 2001; 86: 1296-1304.
23. Wołowiec D, Wójtowicz M, Ciszak L i wsp. High intracellular content of cyclin-dependent kinase inhibitor p27 in earlyand intermediate stage B-cell chronic lymphocytic leukemia lymphocytes predicts rapid progression of the disease. Eur J
Haematol 2009; 82: 260-266.
24. Decker T, Schneller F, Hipp S i wsp. Cell cycle progression of chronic lymphocytic leukemia cells is controlled by cyclin
D2, D3, and cyclin-dependent kinase (cdk) 4 and the cdk inhibitor p27. Leukemia 2002; 16: 327-334.
Praca wpłynęła do Redakcji 28.02.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 28.03.2011 r.
Adres Autora:
Stanisław Potoczek
Katedra i Klinika Hematologii Nowotworów Krwi
i Transplantacji Szpiku Akademii Medycznej we Wrocławiu
ul. Pasteura 4
50-376 Wrocław