Instrukcja

ANALIZA I ROZDZIAŁ MIESZANINY NATURALNYCH BARWNIKÓW
ORGANICZNYCH
Cel ćwiczenia i wprowadzenie
Celem ćwiczenia jest potwierdzenie przydatności chromatografii kolumnowej do
rozdziału barwników zawartych w liściach roślin, a następnie ich identyfikacji i
analizie ilościowej metodą spektroskopii absorbcyjnej.
Chlorofil jest barwnikiem obecnym we wszystkich roślinach zielonych, algach
(glonach) i bakteriach fotosyntetycznych, którego zadaniem jest generowanie
pod wpływem światła widzialnego wolnych elektronów, które są następnie
spoŜytkowywane w dalszych etapach fotosyntezy. Zielony kolor chlorofilu
spowodowany jest bardzo niską absorpcją w "zielonej" części spektrum światła.
Inne barwniki, które bardzo często znajdują się w roślinach to karotenoidy (np.
luteina, wiolaksantyna, neoksantyna itp.). Stosunki ilościowe chlorofili w
roślinach zaleŜą między innymi od warunków siedliskowych: rośliny cieniolubne
mają więcej chlorofilu b, światłolubne — chlorofilu a.
Rysunek 1. Wzór strukturalny chlorofilu
Chlorofile są dosyć nietrwałe. W Ŝywych tkankach występują w formie związanej
np. z białkami, fosfolipidami, co powoduje stabilność zielonej barwy. Z kolei
zniszczenie Ŝywej tkanki roślinnej oraz struktury chlorofili poprzez np.
ogrzewanie, odwadnianie, kontakt z rozpuszczalnikami, enzymami, prowadzi do
przemian chlorofili i zmiany barwy. Rozpad chlorofilu przyśpiesza równieŜ
działanie światła i tlenu. W środowisku kwaśnym następuje przemiana chlorofilu,
związana z zastąpieniem jonu magnezu poprzez dwa jony wodoru i powstanie
feofityny (oliwkowozielona) lub przy niŜszym pH, równieŜ odszczepienie fitolu i
powstanie feoforbidyny (brunatna barwa). Środowisko zasadowe prowadzi do
hydrolizy wiązań estrowych, z zachowaniem jonu magnezu w strukturze
chlorofilu a produktami reakcji są chlorofiliny (zielona barwa), które pod
wpływem enzymu chlorofilazy tracą fitol i przekształcają chlorofilidy. Chlorofile z
łatwością ulegają reakcji wymiany jonów magnezu na jony metali
dwuwartościowych, takich jak Ŝelazo (barwa szarobrunatna), miedź (zielona
barwa) czy cynk (równieŜ barwa zielona). Barwniki chlorofilowe, jak równieŜ ich
pochodne, znajdują zastosowanie w przemyśle spoŜywczym, kosmetycznym i
farmaceutycznym.
Z uwagi na obecność podwójnych wiązań sprzęŜonych chlorofile są efektywnymi
fotoreceptorami. Charakterystyczną cechą takich związków jest bardzo silna
absorpcja w zakresie światła widzialnego wyraŜona poprzez wysokie molowe
współczynniki absorpcji, jedne z najwyŜszych, jakie znane są dla związków
organicznych (rysunki poniŜej).
Metaloporfiryny podobnie jak porfiryny charakteryzują się obecnością dwóch
pasm absorpcji w zakresie UV-VIS. Pierwsze, to dość ostre pasmo, zwane
pasmem Soreta (nazwisko francuskiego fizyka Charlesa Soreta) znajduje się w
zakresie 400-500 nm a molowy współczynnik absorpcji jest rzędu 10 -100.
Drugie pasmo Q, składające się z czterech części składowych (wolne porfiryny)
jest około 10 razy słabsze i leŜy w zakresie 500-700 nm. W przypadku
metalopochodnych porfiryny ilość pasm Q ulega zmniejszeniu z czterech do
dwóch lub trzech, natomiast pasmo Soreta przesunięciu wraz ze zmianą
molowego współczynnika absorpcji.
Karoten jest naturalnie występującym barwnikiem z grupy karotenoidów.
Karotenoidy występują w liściach, lecz ich Ŝółto-pomarańczowa barwa jest zwykle
maskowana przez intensywną, zieloną barwę chlorofilu. Odpowiedzialne są za
piękną barwę wielu owoców (ananas, owoce cytrusowe, pomidory, papryka),
kwiatów (narcyz, pozłotka), skorupiaków, ryb (łosoś) i Ŝółtka jaj.
Karotenoidy zbudowane są z ośmiu jednostek izoprenowych (40 atomów węgla) i
naleŜą do grupy tetraterpenów. NaleŜą do nich karoteny i ksantofile. Warto tu
wspomnieć o ß-karotenie , który stanowi około 80 % wszystkich karotenów, z
uwagi na fakt, Ŝe jest prekursorem witaminy A (rysunek poniŜej). Karoten
występuje między innymi w korzeniu marchwi, stąd jego nazwa.
Zawartość chlorofilu oraz karotenu oznacza się metodą spektrofotometryczną, z
uwagi na wspomniane wysokie molowe współczynniki absorpcji. Wartości
molowych współczynników absorpcji podano w Załączniku 1, 2 i 3, na końcu
opisu ćwiczenia.
Odczynniki:
eter naftowy o twrz = 40 – 60°C
aceton
izopropanol
silica gel 60 (Merck)
NaCl
CaCO3
Na2SO4
50 g próbka materiału roślinnego (np. szpinak, natka pietruszki, brokuły)
Aparatura i szkło:
moździerz
szklana kolumna chromatograficzna
lejek szklany
cylinder miarowy (50ml)
kapilary (lub pipety Pasteura)
kolbki miarowe (25 ml)
bibuła filtracyjna, sączki
cylinder miarowy 25 ml
rozdzielacz 200 ml
pipeta 5 ml, 20 ml
erlenmajerki 100 ml
zlewki 100 oraz 500 ml
Wykonanie:
Ekstrakcja barwników z liści
Porcję świeŜych liści rozciera się w moździerzu z 22 ml acetonu i 3 ml eteru
naftowego i niewielką ilością CaCO3 (ok. 1 g). Po dokładnym roztarciu liści,
zabarwiony ekstrakt odsącza się. Ekstrakt przenosi się do rozdzielacza dodaje 20
ml eteru naftowego, a następnie przemywa 20 ml 10% wodnego roztworu NaCl.
Całość dokładnie wytrząsa się przez około 5 minut i odstawia do rozdzielenia.
Dolną warstwę (wodną) spuszcza się z rozdzielacza, a warstwę organiczną
przemywa 4-krotnie za pomocą 10 ml wody destylowanej. Po przemyciu ekstrakt
przenosi się do erlenmajerki i suszy za pomocą bezwodnego Na2SO4. Ciecz
odsącza się i zatęŜa do objętości 3-5 ml (Uwaga!! NaleŜy bardzo ostroŜnie
podgrzewać, ze względu na moŜliwość rozkładu barwników).
Przygotowanie eluentów
Eluentem jest mieszanina eteru naftowego i acetonu w stosunku 4:1 (v/v).
Napełnianie kolumny
Sposób napełniania kolumny ma decydujący wpływ na poprawny rozdział
substancji z uŜyciem chromatografii kolumnowej. Czystą i suchą kolumnę
umieszcza się na statywie w pozycji pionowej. Przy wylocie kolumny naleŜy
umieścić zlewkę do odbierania eluentu.
W zlewce przygotować zawiesinę Ŝelu krzemionkowego w eterze naftowym (w
stosunku 1:5). Następnie zawiesinę w zlewce naleŜy zamieszać i zdecydowanie,
ale niezbyt szybko wlać do kolumny do około 2/3 wysokości. Nie moŜna dopuścić
do tworzenia się pęcherzyków powietrza oraz szczelin wewnątrz złoŜa. Na
warstwie Ŝelu krzemionkowego moŜna umieścić odpowiednio dopasowany krąŜek
bibuły.
W trakcie napełniania kran powinien być nieznacznie otwarty, aby umoŜliwić
sączenie się rozpuszczalnika z kolumny. Po napełnieniu pozostawić kran
minimalnie otwarty, aby umoŜliwić upakowanie poprawne upakowanie fazy
nieruchomej.
Pozostawić w kolumnie tyle rozpuszczalnika, aby sięgał kilka mm powyŜej
powierzchni piasku. Bardzo waŜne jest, aby nie dopuścić do wysuszenia kolumny,
tzn. poziom cieczy nie moŜe obniŜyć się poniŜej powierzchni piasku.
Rozdzielanie substancji na kolumnie chromatograficznej
Ekstrakt eterowy wprowadzić ostroŜnie za pomocą pipety bezpośrednio na
adsorbent, starając się aby roztwór nie spływał po ściankach kolumny. Odczekać,
aŜ ekstrakt wsiąknie w powierzchnię Ŝelu krzemionkowego, a następnie dodać
eluent (eter naftowy). Gdy poziom rozpuszczalnika obniŜy się w kolumnie do
poziomu adsorbenta, naleŜy dodać następną porcję eluentu.
Przy uŜyciu pipety 10 ml ekstraktu z liści dodaje się ostroŜnie na warstwę
adsorbentu, starając się aby roztwór nie spływał po ściankach kolumny.
Odczekać, aŜ ekstrakt wsiąknie w powierzchnię Ŝelu krzemionkowego, a
następnie dodać eluent. Następnie eluent dodaje się powoli tak, aby nie
spowodować wzajemnego mieszania się. Po dodaniu eluentu naleŜy otworzyć
kran. Faza ruchoma zaczyna przepływać przez kolumnę, na cząsteczkach
adsorbentu zachodzi „rozwijanie chromatogramu”. W trakcie przepływu fazy
ruchomej następuje rozdział składników ekstraktu. śółte pasmo pochodzące od
ß-karotenu powinno wędrować pierwsze, podczas gdy zielone pasmo
(nierozdzielone chlorofile a i b) pozostaje dłuŜej na szczycie warstwy adsorbenta.
Wypływającą fazę ruchomą naleŜy zbierać, w erlanmajerkach, które naleŜy
zmieniać, jeśli następuje zmiana koloru wypływającej fazy ruchomej. Aby
przyspieszyć zbieranie następnych frakcji, moŜna zwiększyć polarność eluentu
poprzez dodatek niewielkiej ilości np. acetonu do eteru naftowego (ok. 5%).
Zebrane frakcje przenieść (ilościowo) do kolbek miarowych o objętości 25 ml,
dopełnić do kreski eterem naftowym i dokładnie wymieszać.
Wykonać widma UV-vis otrzymanych roztworów, stosując eter naftowy jako
roztwór odniesienia. Opisać widma i przeprowadzić interpretację. Następnie
oznaczyć ilościowo zawartość chlorofilu a i b.
Wyniki i dyskusja
1) Analiza widm absorpcyjnych – opisać pasma absorpcji charakterystyczne dla
barwników porfirynowych i karotenu, wyznaczyć λmax pasm i wartości
absorbancji.
2) Obliczyć zawartości chlorofilu a i b w badanej próbce, z wykorzystaniem
podanych wartości molowych współczynników absorpcji (Załącznik 1 i 2). W tym
celu naleŜy odczytać molowe współczynniki absorpcji dla λmax pasm absorpcji
chlorofilu a i b. Następnie ułoŜyć układ równań (prawo addytywności absorbancji)
i obliczyć stęŜenie molowe chlorofilu a i b.
3) Na podstawie stęŜeń molowych wyznaczyć stosunek wagowy chlorofilu a do
chlorofilu b w próbce.
4) Obliczyć zawartość karotenu w badanej próbce, korzystając z podanych
wartości molowych współczynników absorpcji (Załącznik 3).
Masy molowe barwników:
Mchlorofil a = 893.5 g/mol
Mchlorofil b = 907.48 g/mol
Mkaroten = 536.88 g/mol
Zagadnienia teoretyczne:
Barwniki porfirynowe. Chlorofil a i b. Karotenoidy. Karoten. Budowa chemiczna,
występowanie, właściwości fizyko-chemiczne, zastosowanie chlorofilu i karotenu.
Spektrofotometria. Prawa absorpcji.
Chromatografia cieczowa. Zasada rozdziału substancji metodą chromatografii
kolumnowej. Szereg eluotropowy.
ZAŁĄCZNIK 1.
Molowy współczynnik absorpcji chlorofilu a w eterze dietylowym
The molar extinction coefficient of Chlorophyll a, diethyl ether dissolved in diethyl ether based on the
absorbance measurements made by Junzhong Li on 12/11/97 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li,
A. Co rkan, J. S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in
photochemistry," Photochemistry and Photobiology, 68, 141-142, 1998]. The absorbance data was
normalized to have an extinction coefficient of 111700 at 427.75 nm [H. H. Strain, M. R. Thomas, and
J. J. Katz, "Spectral absorption properties of ordinary and fully deuteriated chlorophylls a and b,"
Biochim. Biophys. Acta, 75, 306-311, 1963]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply
by the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption
coefficient in (cm ), multiply by the -1molar concentration and 2.303.
Lambda
[nm]
Extinction
[cm-1/mol]
Lambda
[nm]
Extinction
[cm-1/mol]
Lambda
[nm]
Extinction
[cm-1/mol]
600,06
601,00
602,13
603,06
604,00
604,94
606,06
607,00
607,94
609,06
610,00
610,94
612,06
613,00
613,94
615,06
616,00
616,94
618,06
619,00
619,94
621,06
622,00
622,94
624,06
625,00
625,94
627,06
628,00
628,94
630,06
600,06
631,00
631,94
9179
9571
10121
10660
11069
11355
11773
12214
12516
12778
12803
13152
13079
13177
13301
13150
13147
13108
12769
12536
12277
12016
11597
11119
10585
9941
9860
9391
9131
8769
8496
9179
8572
8201
633,06
634,00
634,94
636,06
637,00
637,94
639,06
640,00
640,94
642,06
643,00
643,94
645,06
646,00
646,94
648,06
649,00
649,94
651,06
652,00
652,94
654,06
655,00
655,94
657,06
658,00
658,94
660,06
661,00
661,94
663,06
664,00
664,94
666,06
8280
8555
8691
8962
9365
9960
10992
12118
12828
14788
15996
17870
20619
23306
26422
30857
33868
37370
42694
48478
53639
60937
66796
72129
77768
81497
83855
85266
83927
81656
77375
72171
66094
57884
667,00
667,94
669,06
670,00
670,94
672,06
673,00
673,94
675,06
676,00
676,94
678,06
679,00
679,94
681,06
682,00
682,94
684,06
685,00
685,94
687,06
688,00
688,94
690,06
691,00
691,94
693,06
694,00
694,94
696,06
697,00
697,94
699,06
700,00
51467
44368
37375
31441
26259
20774
16648
12681
9502
7493
6105
5030
3863
3448
2686
2412
2036
1653
1542
1494
1328
1115
925
863
1003
885
937
854
409
638
704
630
449
450
ZAŁĄCZNIK 2.
Molowy współczynnik absorpcji chlorofilu b w eterze dietylowym
The molar extinction coefficient of Chlorophyll b dissolved in diethyl ether based on the absorbance
measurements made by Junzhong Li on 12/11/97 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Corkan, J.
S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry,"
Photochemistry and Photobiology, 68, 141-142, 1998]. The absorbance data was normalized to have an
extinction coefficient of 159100 at 435.8 nm [L. P. Vernon and G. R. Seely, The chlorophylls,
Academic Press, 1966].
To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by the molar concentration and the pathlength
in centimeters. To convert this data to absorption coefficient in (cm ), multiply by the molar
concentration and 2.303. -1
Lambda
[nm]
Extinction
[cm-1/mol]
Lambda
[nm]
Extinction
[cm-1/mol]
Lambda
[nm]
Extinction
[cm-1/mol]
600,00
601,00
602,00
603,00
604,00
605,00
606,00
607,00
608,00
609,00
610,00
611,00
612,00
613,00
614,00
615,00
616,00
617,00
618,00
619,00
620,00
621,00
622,00
623,00
624,00
625,00
626,00
627,00
628,00
629,00
630,00
631,00
632,00
633,00
634,00
10493
10179
9862
9546
9310
9107
8944
8906
8841
8815
8808
8806
8769
8706
8618
8514
8439
8349
8246
8259
8313
8488
8723
9115
9658
10382
11278
12412
13780
15411
17303
19561
22295
25376
29094
635,00
636,00
637,00
638,00
639,00
640,00
641,00
642,00
643,00
644,00
645,00
646,00
647,00
648,00
649,00
650,00
651,00
652,00
653,00
654,00
655,00
656,00
657,00
658,00
659,00
660,00
661,00
662,00
663,00
664,00
665,00
666,00
667,00
668,00
669,00
33244
37726
42367
46940
51054
54563
57137
58501
58556
57292
54581
50881
46348
41392
36181
31067
26218
21890
18120
14976
11882
9493
8889
7303
6030
5228
4502
3974
3551
3136
2797
2500
2307
2120
1947
670,00
671,00
672,00
673,00
674,00
675,00
676,00
677,00
678,00
679,00
680,00
681,00
682,00
683,00
684,00
685,00
686,00
687,00
688,00
689,00
690,00
691,00
692,00
693,00
694,00
695,00
696,00
697,00
698,00
699,00
700,00
1795
1701
1589
1526
1455
1391
1364
1299
1262
1194
1131
1069
1009
957
886
835
784
735
689
671
638
592
585
552
538
515
514
508
495
472
473
ZAŁĄCZNIK 3.
Molowy współczynnik absorpcji beta-karotenu w heksanie
The molar extinction coefficient of Beta-carotene dissolved in hexane based on the absorbance
measurements made by R. A. Fuh on summer, 95 using a Cary 3 [H. Du, R. A. Fuh, J. Li, A. Corkan, J.
S. Lindsey, "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry,"
Photochemistry and Photobiology, 68, 141-142, 1998]. The absorbance data was normalized to have an
extinction coefficient of 139500 at 451 nm [L. Zechmeister, cis-trans Isomeric carotenoids vitamins A
and arylpolyenes, Springer-Verlag, 1962]. To convert this data to absorbance A=-log10(T), multiply by
the molar concentration and the pathlength in centimeters. To convert this data to absorption coefficient
in (cm ), multiply by the molar concentration and 2.303.
Lambda
[nm]
Extinction
[cm-1/mol]
Lambda
[nm]
Extinction
[cm-1/mol]
Lambda
[nm]
Extinction
[cm-1/mol]
400.00
401.00
402.00
403.00
404.00
405.00
406.00
407.00
408.00
409.00
410.00
411.00
412.00
413.00
414.00
415.00
416.00
417.00
418.00
419.00
420.00
421.00
422.00
423.00
424.00
425.00
426.00
427.00
428.00
429.00
430.00
431.00
432.00
484.00
58312
61186
62303
62920
63627
66127
66631
68117
68189
70135
73202
75463
76634
78693
80427
82224
86390
88259
91673
94790
97375
99496
100442
103176
103338
105923
106094
105775
106824
107216
106824
107572
109040
100163
434.00
435.00
436.00
437.00
438.00
439.00
440.00
441.00
442.00
443.00
444.00
445.00
446.00
447.00
448.00
449.00
450.00
451.00
452.00
453.00
454.00
455.00
456.00
457.00
458.00
459.00
460.00
461.00
462.00
463.00
464.00
465.00
466.00
467.00
110004
111436
113197
114129
116147
117944
120966
123367
126781
127835
130510
132087
135095
135383
136271
136699
138730
139500
137401
137572
135550
133122
130983
129479
126808
124367
121174
118336
116273
113535
112332
110148
110161
107995
468.00
469.00
470.00
471.00
472.00
473.00
474.00
475.00
476.00
477.00
478.00
479.00
480.00
481.00
482.00
483.00
433.00
485.00
486.00
487.00
488.00
489.00
490.00
491.00
492.00
493.00
494.00
495.00
496.00
497.00
498.00
499.00
500.00
700.00
108432
107608
108427
109283
109198
110148
111409
112395
111765
110405
112368
110711
110769
108409
106765
104356
109801
96758
95114
89497
85048
80611
76107
71000
66888
62996
58560
52736
49926
45332
40459
36338
32662
1437