Oznaczanie aktywności katepsyny A i katepsyny D w pełnych

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2011 • Volume 47 • Number 3 • 291-293
Praca oryginalna • Original Article
Oznaczanie aktywności katepsyny A i katepsyny D
w pełnych homogenatach tkankowych
– doniesienie wstępne
Activity and concentration of cathepsin A and cathepsin D
in the blood plasma and serum – initial report
Marta Siergiejuk, Michał Chlabicz, Marek Gacko
Klinika Chirurgii Naczyń i Transplantacji, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
Streszczenie
Do oznaczania aktywności katepsyny A i katepsyny D posłużono się pełnym homogenatem tkankowym sporządzonym przy użyciu
homogenizatora przepływowego i filtru poliamidowego. Przeliczano aktywność tych katepsyn na 1 g tkanki i na zawartość DNA.
Summary
A whole tissue homogenates, prepared with the use of a flow homogenizer and polyamide filter were used to determine cathepsin A and cathepsin D activities. The activities were calculated per 1 g of tissue and DNA content.
Słowa kluczowe:pełen homogenat tkankowy, aktywność katepsyny A i katepsyny D
Key words:whole tissue homogenate, activity of cathepsin A and cathepsin D
Wstęp
Homogenaty tkankowe sporządza się w celu oznaczenia
w tkance całkowitej zawartości/aktywności związku chemicznego/enzymu. Oznaczenia zawartości/aktywności tych
składników wykonywano dotychczas najczęściej w otrzymanym przez wirowanie płynie nadosadowym homogenatu. Część składników rozpuszczalnych może znajdować się
w osadzie, w wyniku adsorpcji na jego nierozpuszczalnych
cząstkach i fragmentach struktur komórkowych [2, 7]. Ponadto ilość składników rozpuszczalnych w nadosadzie i nierozpuszczalnych w osadzie może być różna w przypadku
tkanki prawidłowej i tkanki zmienionej patologicznie. Mimo
to, jedynie nieliczni autorzy dokonywali tych oznaczeń w pełnym homogenacie [6, 11, 12].
Celem pracy jest ocena aktywności katepsyny A i aktywności katepsyny D w pełnym homogenacie. Materiałem tkankowym użytym do oznaczeń była ściana tętniaka aorty i ściana aorty prawidłowej oraz skrzeplina przyścienna tętniaka
i skrzep krwi. Oznaczanie zawartości DNA pozwoliło obliczyć
liczbę komórek jądrzastych w tych tkankach.
Materiał i metody
Odczynnik Bradforda, odczynnik ninhydrynowy i Z-Phe-Ala
firmy Sigma, USA; globina otrzymana z erytrocytów wołu
metodą frakcjonowania kwasem solnym i acetonem [8].
Sporządzono 10% homogenaty 10 ścian tętniaka aorty
brzusznej, ścian aorty prawidłowej, skrzeplin wypełniających poszerzenie tętniakowe i skrzepów krwi. Roztworem
użytym do homogenizacji był 0,15 mol/l KCl, który to związek
jest naturalnym składnikiem cytozolu. Homogenizację przeprowadzono przy użyciu homogenizatora przepływowego,
w którym jeden raz homogenizowana tkanka przechodzi
przez obszar pracy tnącego noża. Homogenat sączono
przez filtr poliamidowy o wielkości porów 0,12 mm. Na filtrze
pozostają nierozpuszczalne wielkocząsteczkowe składniki
tkanki łącznej. W przesączu znajdują się składniki rozpuszczalne oraz fragmenty błon plazmatycznych i błon organelli
komórkowych. W homogenacie oznaczano aktywność katepsyny A przy użyciu Z-Phe-Ala [5] i aktywność katepsyny
D przy użyciu globiny wołu [8]. W pełnej tkance oznaczano
zawartość DNA [1].
Wyniki poddano analizie statystycznej posługując się testem
t-studenta; wartość p<0,05 przyjęto jako istotną statystycznie.
Wyniki
W pełnym homogenacie ściany tętniaka aktywność katepsyny A wynosi 786,5 Ala nmol/g/h i katepsyny D wynosi
1450,0 Tyr nmol/g/h (Tabela I). Aktywność tych peptydaz
w pełnym homogenacie aorty prawidłowej jest niższa i wynosi dla katepsyny A – 628,4 Ala nmol/g/h i dla katepsyny D
291
Oznaczanie aktywności katepsyny A i katepsyny D w pełnych homogenatach tkankowych – doniesienie wstępne
Tabela I.
Aktywność katepsyny A i aktywność katepsyny D w homogenacie ściany tętniaka, ściany aorty, skrzepliny przyściennej tętniaka
i skrzepu krwi w przeliczeniu na gram tkanki.
Homogenat
Katepsyna A, Ala
nmol/g/h
Katepsyna D, Tyr
nmol/g/h
Ściana tętniaka
786,5 ± 74,3*
1450,0 ± 128,6*
Ściana aorty
628,4 ± 63,2
986,5 ± 92,3
Skrzeplina przyścienna
18,2 ± 1,6*
1648,2 ± 146,0*
Skrzep krwi
8,2 ± 0,7
436,8 ± 41,7
* - różnica istotna statystycznie (p<0,05) w porównaniu odpowiednio
do ściany aorty i skrzepu krwi.
– 986,5 Tyr nmol/g/h. W pełnym homogenacie skrzepliny tętniakowej aktywność katepsyny A wynosi 18,2 Ala nmol/g/h
i katepsyny D wynosi 1648,2 Tyr nmol/g/h/. W skrzepie krwi
aktywność tych peptydaz jest niższa i wynosi odpowiednio
dla katepsyny A – 8,2 Ala nmol/g/h i dla katepsyny D – 436,8
Tyr nmol/g/h. Ściana tętniaka aorty brzusznej zawiera więcej
DNA (218,4 μg/g) niż ściana aorty prawidłowej (142,0 μg/g),
a skrzeplina przyścienna tętniaka zawiera więcej tego związku (128,4 μg/g) niż skrzep krwi (78,6 μg/g) (Tabela II). NajTabela II.
Zawartość DNA w ścianie tętniaka, ścianie aorty, skrzeplinie przyściennej tętniaka i skrzepie krwi oraz liczba komórek w 1 gramie
tych tkanek.
Materiał badany
Zawartość DNA,
μg/g
Liczba
komórek/g
Ściana tętniaka
218,4 ± 19,8
36 400 000
Ściana aorty
142,0 ± 12,4
23 666 000
Skrzeplina przyścienna
128,4 ± 11,6
21 400 000
Skrzep krwi
78,6 ± 6,4
13 100 000
większą liczbę komórek jądrzastych zawiera ściana tętniaka,
mniejszą ściana aorty prawidłowej i skrzeplina przyścienna
tętniaka. Najmniej komórek jądrzastych zawiera skrzep krwi,
na masę którego składają się głównie nie zawierające jądra
komórki krwi - erytrocyty i płytki krwi. W przeliczeniu na zawartość DNA największą aktywność katepsyny A wykazuje
ściana aorty prawidłowej, a największą aktywność katepsyny D – skrzeplina przyścienna tętniaka (Tabela III). Różnice
Tabela III.
Aktywność katepsyny A i aktywność katepsyny D w homogenacie ściany tętniaka, ściany aorty, skrzepliny przyściennej tętniaka
i skrzepu krwi w przeliczeniu na μg DNA.
Homogenat
Katepsyna A,
Ala nmol/ μg
DNA/h
Katepsyna D,
Tyr nmol/ μg
DNA/h
Ściana tętniaka
3,6*
6,64
Ściana aorty
4,42
6,95
Skrzeplina przyścienna
0,14*
12,84*
Skrzep krwi
0,10
5,56
* - różnica istotna statystycznie (p<0,05) w porównaniu odpowiednio
do ściany aorty i skrzepu krwi.
292
te zależą najprawdopodobniej od różnic w składzie komórek
jądrzastych, różniących się zawartością tych peptydaz lub
różną ich zawartością w międzykomórkowej macierzy.
Dyskusja
Do celów diagnostycznych oznacza się dotychczas najczęściej zawartość związków chemicznych i aktywność enzymów we frakcji rozpuszczalnej (nadosadzie) homogenatu.
Skład tej frakcji zależy od intensywności homogenizacji (typ
homogenizatora, szybkość obrotów ostrza tnącego, czas
homogenizacji), składu, stężenia i pH roztworu użytego
do homogenizacji oraz warunków wirowania (wielkość siły
odśrodkowej, czas wirowania). Dlatego konieczna jest równoczesna ocena zawartości/aktywności we frakcji nierozpuszczalnej homogenatu, która zawiera zawsze pewną ilość
składników rozpuszczalnych związanych niekowalencyjnie
z fragmentami błon cytoplazmatycznych i błon organelli [3,
9]. Dotyczy to także niższej aktywności katepsyny A i katepsyny D w nadosadzie homogenatu ściany tętniaka i ściany
aorty niezmienionej oraz w skrzeplinie i skrzepie krwi [4].
Z uzyskanych wyników można wnosić, że oznaczanie zawartości/aktywności określonych składników chemicznych/
enzymów należy przeprowadzać w pełnym homogenacie,
z pominięciem wirowania. Unika się wówczas strat spowodowanych ich ubytkiem na skutek częściowej lokalizacji
w warstwie osadu i w lipoproteinowej warstwie flotującej. Do
homogenizacji tkanek najbardziej polecany jest homogenizator przepływowy [10]. Zapewnia on standaryzację tego
procesu, gdyż cały rozdrobniony w czasie homogenizacji
materiał tylko jeden raz i zawsze w tym samym czasie przechodzi przez obszar pracy noża tnącego. Płynem polecanym
do homogenizacji jest 0,15 mol/l roztwór KCl, który stanowi
naturalne środowisko komórki. Znajdujący się na filtrze materiał posłużyć może do oznaczania zawartości m.in. białek
nierozpuszczalnych – kolagenu i elastyny.
Zawartość/aktywność oznaczanych składników przelicza się
na ml homogenatu lub na 1 gram mokrej tkanki. W pewnych
przypadkach wskazane jest przeliczenie tych wartości na
1 mg białka lub na 1 mikrogram DNA [11, 12]. Wiedząc, że
komórka w stanie spoczynkowym zawiera 6 pg DNA, można
obliczyć ich liczbę w 1 gramie tkanki. Pozwala to wnosić, czy
zmiany zawartości białek lub aktywności enzymów zależą
od zwiększonej ich ilości/aktywności w poszczególnych komórkach, czy też zależne są od liczby komórek w materiale
badanym.
Wnioski
Homogenaty tkankowe należy sporządzać przy użyciu homogenizatora przepływowego.
Oznaczenia aktywności katepsyny A i katepsyny D należy
wykonywać w pełnym homogenacie i przeliczać na 1 g tkanki i na μg DNA w niej występującego.
Piśmiennictwo
1. Burton K. A study of conditions and mechanisms of the dife-
M. Siergiejuk, M. Chlabicz i M. Gacko
nylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochem J 1956; 62: 315-323.
2. Chyczewski L, Płoński A, Chyczewska E i wsp. Activity and tissue localization of cathepsin D in non small cell lung cancer.
Ann Acad Med Bialostoc 1997; 42, suppl.1: 217-229.
3. Fiszer-Szafarz B, Szafarz D. DNA and protein content as cellular biochemical parameters. A discussion with two examples:
acid phosphatase and cathepsin D in rat liver and hepatoma
and acid phosphatase in human breast normal tissue and adenocarcinoma. Anal Biochem 1984; 138: 255-259.
4. Gacko M, Głowiński S. Aktywność katepsyn tętniaka aorty.
Przegl Angiol 1996; 1: 52-54.
5. Iodice AA, Leong V, Weinstock JM. Separation of cathepsins A
and D of skeletal muscle. Archs Biochem Biophys 1966; 117:
477-486.
6. Karwowska A, Gacko M, Worowska A i wsp. Próby standaryzacji
rozdrabniania tkanek zwierzęcych do badań analitycznych. Bromat Chem Toksykol 2006; 39: 199-202.
7. Maksimowicz T, Chyczewska E, Chyczewski L i wsp. Activity
and tissue localization of cathepsin G in non small cell lung cancer. Ann Acad Med Bialostoc 1997; 42, suppl.1: 199-216.
8. Minarowska A, Karwowska A, Gacko M. Quantitative determination and localization of cathepsin D and its inhibitors. Folia
Histochem Cytobiol 2009; 47(2): 153-177.
9. Martinez JM, Prieto J, Ramirez J i wsp. Aminopeptidase activities in breast cancer tissue. Clin Chem 1999; 45: 1797-1802.
10. Panusz H. The influence of autolysis and homogenization techniques on the stability of preparations of subcellular fractions.
Ann Acad Med Lodzensis 1973; 14, suppl.10: 157-161.
11. Warwas M, Osada J. Cysteine proteases and their inhibitors in
the liver of rats infoxicated with karbon tetrachloride. Bromat
Chem Toksykol 1990; 23: 62-65.
12. Żak J, Chociłowski W. Effect of cadmium on lysosomes permeability in the liver. Bromat Chem Toksykol 1987; 20: 214-221.
Adres do korespondencji:
Klinika Chirurgii Naczyń i Transplantacji
Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
15-276 Białystok, ul. M. Skłodowskiej-Curie 24A
tel. (85) 746 82 77; faks (85) 746 88 96
e-mail: [email protected]; [email protected]
Zaakceptowano do publikacji: 14.04.2011
293