Wydział Farmaceutyczny

Kraków, 28.07.2016
UNIWE RSYT E T
JAGIE L LOŃ SKI
Dr hab. Włodzimierz Opoka, prof. UJ
Col l egi um
Medi cum
Katedra Chemii Nieorganicznej i Analitycznej
Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie
K ate dra
C he mii
Recenzja
Pracy na stopień doktora nauk farmaceutycznych Pani mgr Karoliny
Stypułkowskiej zatytułowanej:
„Oznaczanie wybranych antybiotyków aminoglikozydowych oraz ich
zanieczyszczeń
metodą
wysokosprawnej
chromatografii
N ie organiczne j
i Anal ityczne j
cieczowej
sprzężonej z detekcją wyładowań koronowych i spektrometrii mas”, która
wykonana została w Zakładzie Chemii Farmaceutycznej Narodowego Instytutu
Leków w Warszawie pod kierunkiem:
Promotora: Prof. dr hab. n. farm. Zbigniewa Fijałka
oraz promotora pomocniczego dr n. farm. Agaty Błażewicz.
Mgr Karolina Stypułkowska zajęła się tematem interesującym
i ważnym z punktu widzenia praktycznego, a polegającym na zastosowaniu
wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z detekcją wyładowań
koronowych (HPLC-CAD) i spektrometrii mas do oznaczenia antybiotyków
aminoglikozydowych, a także towarzyszącym im zanieczyszczeniom.
Przedstawione do recenzji opracowanie mgr Karoliny Stypułkowskiej
na stopień doktora nauk farmaceutycznych zawarte jest na 149 stronach
maszynopisu. Do 46 strony (oprócz streszczenia) omówiono techniki badawcze
i przedstawiono cel oraz efekty przeprowadzonych badań. Od strony 47 do 116
zaprezentowano prace będące podstawą niniejszego opracowania Doktorantki,
a uzupełnia to wszystko 135 pozycji piśmiennictwa w znacznej części
z ostatnich kilku lat.
ul. Medyczna 9
PL 30-688 Kraków
tel. +48(12) 620 54 80
1
fax +48(12) 620 54 95
e-mail:
[email protected]
Przedstawione opracowanie na stopień doktora nauk farmaceutycznych
utrzymane jest w tradycyjnym podziale materiału w podobnych opracowaniach
i zawiera takie elementy jak:

Wstęp

Omówienie technik badawczych

Cel pracy i uzasadnienie badań

Omówienie i podsumowanie wyników pracy badawczej
Ponadto zawarto kopie opublikowanych prac, dorobek naukowy mgr Karoliny
Stypułkowskiej stanowiący podstawę do starania się o stopień doktora oraz
całościowy
dorobek
naukowy
Doktorantki,
stosowne
oświadczenia
współautorów prac, z których wynika, że Doktorantka w każdej z ujętych prac
do opracowania na stopień doktora pełniła rolę wiodącą.
Z załączonych prac trzy zostały opublikowane w czasopismach
objętych listą filadelfijską o sumarycznej wartości IF=7,233, co dobrze
świadczy o ich jakości, a tylko jedna jest z listy B MNiSW. Należy również
zaznaczyć,
że
zagadnienia
związane
z
przedstawionym
do
oceny
opracowaniem w formie referatów były prezentowane na dwóch konferencjach
naukowych i jako poster na czterech.
Mgr Karolina Stypułkowska we wstępie swojego opracowania zwróciła
uwagę na to, że bezpieczeństwo stosowania leków jest ściśle powiązane z ich
jakością,
która
powinna
być
gwarantowana
przez
ustawodawstwo
i odpowiednie instytucje państwowe realizujące zapisy ustawowe tak, aby
każdy pacjent miał możliwość zażywania leków dobrej jakości, bezpiecznych
i skutecznych terapeutycznie. Wiadomo, że pacjent nie ma możliwości
samodzielnego ocenienia jakości tak specyficznych wyrobów jakimi są leki,
gdyż może się tylko opierać na zawodnej ocenie organoleptycznej.
Doktorantka zwraca uwagę na to, że w ostatnich latach leki i wyroby
medyczne stają się w coraz większym stopniu fałszowane i w wielu krajach
narasta ich nielegalna produkcja oraz dochodzi do świadomego podawania
nieprawdziwych informacji o ich składzie. Coraz większa liczba pacjentów jest
hospitalizowanych po zażyciu leków niewiadomego pochodzenia i z
nielegalnych źródeł, a nawet zgonach, które są odpowiednio udokumentowane
w szpitalach. W związku z tym groźnym zjawiskiem właściwe urzędy
administracji państwowej i agencje powinny zapewnić skuteczny mechanizm
2
kontroli, który uniemożliwi produkowanie i wprowadzenie do obrotu leków
fałszywych.
We wstępie mgr Karolina Stypułkowska omówiła wyczerpująco
aktualne problemy związane z antybiotykoterapią i antybiotykoopornością,
która stanowi zagrożenia dla zdrowia publicznego oraz jest jednym
z najpoważniejszych globalnych problemów zdrowia publicznego na Świecie,
stanowiąc ogromne zagrożenie dla współczesnej medycyny i farmacji. Dużym
zagrożeniem jest również stale rozwijający się rynek leków nielegalnych
i sfałszowanych. Podane przez mgr Karolinę Stypułkowską definicje
sfałszowanych i nielegalnych leków stanowią ważny element wstępu.
Doktorantka przedstawia definicje zaproponowane przez WHO, FDA oraz
definicje zawarte w Dyrektywie 2011/62/UE. Mgr Karolina Stypułkowska
zwróciła również uwagę na produkty substandardowe, które mogą być
wytworzone legalnie przez producenta, ale mimo to mogą posiadać
niezamierzone przez niego wady jakościowe i być błędnie oznakowane
w sposób nieumyślny przez co są traktowane jako fałszywe.
Na uwagę zasługuje dokładne omówienie przez Doktorantkę grupy
antybiotyków aminoglikozydowych, które były przedmiotem Jej badań. Należy
podkreślić, ze względu na naturalny charakter syntezy, że aminoglikozydy
stanowią zwykle mieszaniny kilku składników o bardzo zbliżonej budowie
chemicznej. W tej mieszaninie jeden ze składników jest dominujący
i traktowany jako substancja czynna i tym samym nadaje nazwę całemu
kompleksowi,
a pozostałe składniki kompleksu traktowane są
jako
zanieczyszczenia. Mgr Karolina Stypułkowska przedstawiła również różnice
w budowie chemicznej poszczególnych aminoglikozydów. Wynika z tego, ze
różna konfiguracja stereochemiczna podstawników ma wpływ na rozdział tych
związków z zastosowaniem technikach chromatograficznych z racji ich
polarności i charakteru zasadowego. Omówiła również mechanizm działania
aminoglikozydów oraz ich znaczenie kliniczne. Doktorantka wskazała także na
fakt, że monografie aminoglikozydów są dość „ubogie”. Niektóre z nich (np.
monografia dibekacyny, kanamycyny, gentamicyny) zawierają jedynie
odniesienie do monografii ogólnej antybiotyków. W niektórych monografiach
proponowane są metody HPLC-UV z procesem derywatyzacji dla oznaczenia
aktywności API (np. monografia amikacyny). Rzadko stosuje się metodę TLC,
3
która umożliwia jedynie na podstawie porównania wielkości plam barwnych
na płytce pomiędzy roztworem wzorcowym a próbą badaną (np. monografia
netilmicyny). Mgr Karolina Stypułkowska zwraca uwagę na to, że USP nie dla
wszystkich
aminoglikozydów
wymaga
testu
oznaczania
zawartości
zanieczyszczeń, nawet dla produktów jałowych, co jest trudne do
wytłumaczenia, bo produkty lecznicze zawierające aminoglikozydy podawane
są nie tylko zewnętrznie, ale też w postaci iniekcji. W przypadku tych drugich,
wysoka zawartość zanieczyszczeń wpływająca na działanie produktu może
stanowić
zagrożenia
zdrowia
pacjenta.
Reasumując
mgr
Karolina
Stypułkowska podkreśla w swoim opracowaniu, że proponowane przez
Farmakope Europejską (Ph. Eur.) metody do oznaczania antybiotyków
aminoglikozydowych HPLC-PAD są bardzo pracochłonne i sprawiają duże
problemy analityczne, o których szeroko pisze. Podaje również definicję
„zanieczyszczenia” i omawia przyczyny ich powstawania oraz trudności w
oznaczaniu podawane w monografiach. Ze względu na to, że nie ma
uniwersalnej metody, która umożliwiłaby wykrycie i rozdzielenie wszystkich
zanieczyszczeń badanych antybiotyków, a także ich ilościowe oznaczenie są
proponowane nowe rozwiązania, do których należą metody, w których stosuje
się detekcję wyładowań koronowych w połączeniu z metodą HPLC – metodę
tę wybrano jako główną technikę analityczną w doświadczalnej części
rozprawy.
W rozdziale drugim mgr Karolina Stypułkowska omawia szczegółowo
metody analizy instrumentalnej, które stosowała w oznaczaniu antybiotyków
aminoglikozydowych i ich zanieczyszczeń. Jedną ze stosowanych metod była
spektrometria mas. Doktorantka omówiła w tym fragmencie pracy budowę
i zasadę działania tandemowego spektrometru mas ESI-MS/MS-TOF
przedstawiając jego schemat oraz przykładowe widmo masowe (+MS)
i fragmentacyjne (+MS2) zarejestrowane dla związku o wartości m/z 323,19
z wykorzystaniem spektrometru mas maXis 4G. Jak wykazano tandemowa
spektrometria mas jest dobrym narzędziem do analiz przesiewowych. Do
złożonych matryc, aby zwiększyć czułość i dokładność pomiaru MS, zwykle
łączy się tę metodę z systemami chromatografii cieczowej, co umożliwia
wstępny rozdział składników mieszanin, a tym samym dokładniejszy pomiar
masy. Na uwagę zasługuje fakt, że dzięki zaawansowanej technologii jest
4
można zbierać dane z dużą szybkością, przez co jest możliwość łatwego
łączenia z techniką UHPLC. Aparaty te mogą być wykorzystane do oznaczeń
jakościowych i ilościowych, lecz warunkiem koniecznym jest posiadanie
materiałów odniesienia dla analizowanych związków.
Ważnym elementem pomiaru jest detekcja badanych antybiotyków
z zastosowaniem detektora wyładowań koronowych, który mgr Karolina
Stypułkowska wykorzystuje w swoich badaniach, a także przedstawia w swoim
opracowaniu jego budowę i zasadę działania, ilustrując odpowiednimi
rycinami. Wykazano już wcześniej, że są lepsze parametry dla CAD co do
czułości, precyzji i zakresu wyników przy oznaczaniu cukrów, saponin oraz
leków przeciwcukrzycowych.
Na cel jaki mgr Karolina Stypułkowska postawiła przed sobą
realizując temat proponowanego opracowania składały się w ocenie
Recenzenta następujące zagadnienia:

opracowanie nowych metod ilościowego oznaczania wybranych
antybiotyków
aminoglikozydowych:
gentamicynę,
neomycynę,
linkomycynę i spektynomycynę z wykorzystaniem wysokosprawnej
chromatografii
cieczowej
sprzężonej
z
detekcją
wyładowań
koronowych

opracowanie bardziej czułych, precyzyjnych, selektywnych i w pełni
walidowalnych metod analitycznych, które umożliwiałyby badanie
i
oznaczanie
niskich
stężeń
zanieczyszczeń
towarzyszących
antybiotykom aminoglikozydowym z wykorzystaniem wysokosprawnej
chromatografii
cieczowej
sprzężonej
z
detekcją
wyładowań
koronowych

zastosowanie spektrometru mas ESI-MS/MS-TOF do oznaczania
antybiotyków aminoglikozydowych i ich zanieczyszczeń

opracowanie i wdrożenie do badań metod analitycznych cechujących
się
prostotą
i
krótkim
czasem
analizy
oraz
bardzo
dobrą
powtarzalnością i odtwarzalnością wykonania, alternatywnych do
metod kompendialnych, które umożliwią otrzymywanie wyników na
porównywalnym lub niższym poziomie czułości wymaganym przez
monografie Ph. Eur. i mogących znaleźć zastosowanie w rutynowej
5
analizie, np. podczas badań kontrolnych produktów leczniczych
pobranych z rynku.

opracowanie metody HPLC – CAD do badania produktów nielegalnych
i sfałszowanych, zawierających antybiotyki aminoglikozydowe

zastosowanie spektrometru mas ESI-MS/MS-TOF do badania
produktów nielegalnych i sfałszowanych, zawierających antybiotyki
aminoglikozydowe
W dalszej części pracy mgr Karolina Stypułkowska omawia po kolei
swoje
cztery
monotematyczne
publikacje,
które
stanowią
podstawę
proponowanej rozprawy doktorskiej.
W pierwszej publikacji autorstwa K. Stypułkowska, A. Błażewicz, Z. Fijałek
zatytułowanej: Analiza ilościowa antybiotyków aminoglikozydowych i ich
zanieczyszczeń – wyzwania i nowe kierunki. Farmacja Polska 72 (4) (2016) 260
– 268 mgr Karolina Stypułkowska omówiła w sposób przejrzysty i obszerny
antybiotyki aminoglikozydowe podając datę ich odkrycia, sposób wytwarzania,
strukturę oraz ich szeroki zakres działania przeciwbakteryjnego. W publikacji
tej Doktorantka zwróciła również uwagę na możliwość otrzymywania
antybiotyków aminoglikozydowych na drodze półsyntetycznej, co może być
przyczyną powstawania nowych zanieczyszczeń, które będą wymagać nowych
metod oznaczania. Ponadto w sposób obszerny została przedstawiona
problematyka fałszowanych i nielegalnych leków w tym czynniki sprzyjające
fałszowaniu leków. Moim zdaniem część ta stanowi bardzo dobre
wprowadzenie do tematyki rozprawy. W kolejnych trzech publikacjach
Doktorantka
zawarła
wyniki
oznaczeń
badanych
antybiotyków
aminoglikozydowych oraz ich zanieczyszczeń. Uzyskane wyniki zostały
zwalidowane i przedstawione w bardzo ciekawy i rzetelny sposób, a co
najważniejsze
mogą
być
praktycznie
wykorzystane
do
wykrywania
sfałszowanych antybiotyków aminoglikozydowych i ich zanieczyszczeń.
W związku z powyższym jest mi niezmiernie miło stwierdzić, że
w przedstawionym do oceny opracowaniu nie zauważyłem żadnych błędów
merytorycznych, czemu też nie należy się dziwić, ponieważ otrzymałem do
oceny materiał, który już został oceniony pozytywnie przez redakcje czasopism
o zasięgu międzynarodowym i nie sposób się z tym nie zgodzić.
6
Moim zdaniem mgr Karolina Stypułkowska w swojej pracy podjęła
bardzo ważną aktualnie i perspektywicznie tematykę badania sfałszowanych
antybiotyków aminoglikozydowych i ich zanieczyszczeń. Doktorantka
wykonała bardzo interesującą i nowatorską pracę, której wyniki mogą mieć
jak już wcześniej wspomniałem duże znaczenie praktyczne. Redakcja
opracowania, zamieszczone wyniki badań eksperymentalnych, zastosowane
sposoby ich interpretacji oraz krytycznej oceny wskazują na świetne
zrozumienie
zagadnień
teoretycznych
i
potwierdzają
bardzo
dobre
przygotowanie Autorki do prowadzenia badań naukowych.
Autorka opracowania nie uniknęła drobnych błędów edytorskich np. na
stronie 21 w tytule podrozdziału nie powinno być kropki na końcu, na stronie
27 (11 linijka od góry) powinno być „ukazała się w lipcu”, a nie „ukazała
lipcu”, na stronie 31 (3 linijka od góry) powinno być „ wpływają na działanie”,
a nie „wpływają działanie”, na stronie 40 (4 linijka od góry) powinno być
„wyższość nad detektorem”, a nie wyższość na detektorem”, na stronie 42 (7
linijka od góry) powinno być „zmiana wielkości”, a nie „zmiana wielkość” i na
tej samej stronie (6 linijka od dołu) powinno być „zwiotczające mięśnie”, a nie
zwiotczające miesnie”,
na stronie 45 (11 linijka od góry) napisano „W
powyższych powodów” zamiast „Z powyższych powodów”. Ponadto w
przedstawionym celu swojego opracowania nie uniknęła niewielkich
powtórzeń z innych części rozprawy.
Według Recenzenta cel rozprawy mgr Karoliny Stypułkowskiej został
ujęty zbyt obszernie, ale z racji dużego znaczenia omawianego problemu jego
szersze uzasadnienie przemawia na korzyść Doktorantki.
Podsumowując mogę stwierdzić, że mgr Karolina Stypułkowska
wykazała się dobrą znajomością piśmiennictwa przedmiotu, bardzo dobrym
opanowaniem warsztatu pomiarowego oraz zrealizowała wszystkie założone
cele pracy, wykorzystując do jego realizacji odpowiednie narzędzia
analityczne. Wszystkie trudne elementy celu swojej rozprawy mgr Karolina
Stypułkowska w pełni zrealizowała, dlatego moim zdaniem przedstawiona do
recenzji rozprawa zatytułowana:
„Oznaczanie wybranych antybiotyków aminoglikozydowych oraz ich
zanieczyszczeń
metodą
wysokosprawnej
chromatografii
cieczowej
sprzężonej z detekcją wyładowań koronowych i spektrometrii mas” mimo
7
8