LightCycler SeptiFast Test MG

LightCycler ® SeptiFast Test MG
Do stosowania z urządzeniem LightCycler® 2.0
(numer seryjny 1415001 oraz numery późniejsze)
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
DO STOSOWANIA Z:
LightCycler® SeptiFast Kit MG
54 Tests
SeptiFast Lys Kit MG
100 Tests
SeptiFast Prep Kit MG
10 Tests
SeptiFast Software Set
REF : 04 469 046 001
REF : 04 404 432 001
REF : 04 404 459 001
REF : 04 705 220 001
PRZEZNACZENIE
Test LightCycler® SeptiFast MG jest testem opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego in vitro, służącym do detekcji i identyfikacji
bakteryjnego i grzybiczego DNA mikroorganizmów wymienionych na liście głównej SeptiFast (SeptiFast Master List, SML); test przeprowadza
się za pomocą urządzenia LightCycler® 2.0 z ludzkiej krwi pobranej na K-EDTA.
Omawiany test stosuje się w odniesieniu do obrazu klinicznego uznanych analiz mikrobiologicznych i/lub innych wskaźników laboratoryjnych
jako pomoc w postępowaniu u osób, u których podejrzewa się posocznicę i inne bakteryjne/grzybicze zakażenia krwi.
PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU
Posocznica, wywoływana najczęściej przez bakteriemię i/lub fungemię, jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności
w szpitalach. Odpowiednie stosowanie antybiotyków oraz szybkie rozpoczęcie leczenia są czynnikami decydującymi o zmniejszeniu
zachorowalności i śmiertelności związanej z posocznicą.
Odsetek pacjentów leczonych początkowo niewłaściwymi antybiotykami w oddziałach intensywnej opieki medycznej jest znaczny i waha się
od 11% do 46% (1,2,3). W szpitalach potrzeba zwykle co najmniej 48 godzin, aby wykorzystując posiewy krwi, zidentyfikować patogen(y)
grzybiczy(e)/bakteryjny(e) i określić jego (ich) wrażliwość na leki (1).
Szybkie wykrycie patogenu za pomocą diagnostyki molekularnej może ułatwić szybkie rozpoznanie bakteriemii/fungemii i wcześniejsze
rozpoczęcie odpowiedniej antybiotykoterapii, równocześnie zmniejszając nadużywanie niewłaściwych antybiotyków o szerokim spektrum (4,5).
Test LightCycler® SeptiFast MG zaprojektowano do wykrywania mikroorganizmów odpowiedzialnych za mniej więcej 90% wszystkich
zakażeń krwi (1,6). Podczas gdy metody mikrobiologiczne wykrywają żywe mikroorganizmy, niniejszy test wykrywa zarówno żywe, jak
i martwe mikroorganizmy oraz wolny DNA drobnoustrojów. Wykrywane gatunki wymieniono na liście głównej SeptiFast (SML) w tabeli 1.
Gatunki te z powodzeniem wykrywano przy użyciu testu LightCycler® SeptiFast MG podczas badań wewnętrznych i/lub prób klinicznych.
Niektóre z tych gatunków to te, które najczęściej są leczone niewłaściwie: Enterococcus spp., E. coli, Candida spp., Klebsiella spp. (6).
Dodatkowo w przypadku niektórych wykrywanych gatunków z listy SML istotna jest ich wczesna identyfikacja, ponieważ wywołują one
zakażenia najtrudniejsze do leczenia: Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp., Enterococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp. (6).
W pojedynczej próbce można wykryć więcej niż jeden gatunek.
Z tego powodu wynik badania PCR w czasie rzeczywistym jest dodatkowym narzędziem ułatwiającym wczesną ocenę kliniczną.
Tabela 1: Lista główna SeptiFast (SML)
Gram (–)
Gram (+)
Grzyby
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Candida albicans
Klebsiella (pneumoniae/oxytoca)
CoNS1
Candida tropicalis
Serratia marcescens
Streptococcus pneumoniae
Candida parapsilosis
Enterobacter (cloacae/aerogenes)
Streptococcus spp.2
Candida glabrata
Proteus mirabilis
Enterococcus faecium
Candida krusei
Pseudomonas aeruginosa
Enterococcus faecalis
Aspergillus fumigatus
Acinetobacter baumannii3
Stenotrophomonas maltophilia
1
2
3
Koagulazoujemne Staphylococci (gatunki, które reprezentują grupę CoNS, wymieniono w tabeli 8).
Gatunki, które reprezentują grupę Streptococcus spp., wymieniono w tabeli 8.
Gatunki często określane jako A. calcoaceticus-A. baumannii (Acb complex) nie są wykrywane (8).
1
ZASADY PROCEDURY
Test LightCycler® SeptiFast MG oparty jest na 3 głównych procesach:
• przygotowanie próbki z mechaniczną lizą i oczyszczeniem DNA,
• amplifikacja PCR (w czasie rzeczywistym) docelowego DNA w 3 równoległych reakcjach (bakterie Gram-dodatnie, bakterie
Gram-ujemne i grzyby) oraz wykrywanie za pomocą swoistych sond do hybrydyzacji,
• automatyczna identyfikacja gatunków i kontroli.
Przygotowanie próbki
Mechaniczna liza próbek jest przeprowadzana za pomocą zestawu SeptiFast Lys Kit MG oraz urządzenia MagNA Lyser. Za pomocą
zestawu SeptiFast Prep Kit MG poddane lizie próbki są inkubowane w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do
lizy, który uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony DNA przed DNAzami we krwi. Do każdej próbki jest dodawana określona objętość
kontroli wewnętrznej (IC – Internal Control) wraz z odczynnikiem lizującym. IC składa się z syntetycznych cząsteczek dwuniciowego DNA
z miejscami wiązania primerów, identycznymi jak te w docelowych gatunkach. IC zawiera unikatowe regiony wiążące sondę H,
które umożliwiają odróżnienie amplifikowanej IC od amplikonów swoistych dla docelowych organizmów. Po dodaniu buforu wiążącego
mieszanina jest przenoszona do kolumny wirującej z zawierającym włókno szklane wkładem filtrującym. Ludzki genomowy DNA
i bakteryjny/grzybiczy docelowy DNA wiążą się z powierzchnią włókna szklanego. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne
zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w dwóch etapach przepłukiwania. Po zakończeniu przepłukiwania
zaadsorbowane kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu w podwyższonej temperaturze. Eluaty są poddawane analizie PCR.
Amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym oraz detekcja
Wybór sekwencji docelowej
Jako region docelowy do różnicowania gatunków bakterii i grzybów wybrano region wewnętrznej wstawki transkrybowanej (ITS – internal
transcribed spacer). Zapewnia on wyższą czułość analityczną niż pojedyncze kopie genów, ponieważ w genomach bakterii i grzybów jest kilka
operonów. Co więcej, ITS jest bardziej swoisty gatunkowo niż rybosomalne RNA; z tego względu najlepiej nadaje się do różnicowania
gatunków. Znajduje się on między sekwencjami 16S i 23S rybosomalnego DNA wszystkich bakterii Gram (+) i Gram (–) oraz między
sekwencjami 18S i 5,8S rybosomalnego DNA wszystkich grzybów.
Amplifikacja
Przed amplifikacją PCR ryzyko skażenia amplikonów można zmniejszyć, używając enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylaza). Enzym ten
rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę, ale nie niszczy łańcuchów DNA zawierających dezoksytymidynę.
Przetwarzane próbki są dodawane do mieszaniny amplifikacyjnej zawierającej polimerazę Taq aktywowaną w wysokiej temperaturze
w kapilarach LightCycler® MG (100 µl), w których zachodzi amplifikacja PCR. Każda sekwencja docelowa określonych gatunków jest
amplifikowana przy użyciu ogólnych lub swoistych primerów. Mieszanina docelowych kwasów DNA jest jednocześnie amplifikowana
w kontrolach odczynników (RC – reagent control).
Wykrywanie produktów reakcji PCR w czasie rzeczywistym za pomocą sond H
Amplikon jest wykrywany z wykorzystaniem fluorescencji, za pomocą określonej pary sond H . Oznaczone barwnikiem
fluorescencyjnym sondy H hybrydyzują z wewnętrzną sekwencją amplifikowanego fragmentu podczas fazy hybrydyzacji cyklu
amplifikacji. Urządzenie LightCycler® 2.0 mierzy emitowaną fluorescencję w jednym z czterech różnych kanałów detekcji.
Po zakończeniu amplifikacji jest przeprowadzana analiza krzywej topnienia. Temperatura topnienia TM zależy od długości, sekwencji i stopnia
homologii między sondą a docelowym DNA. Sondy zaprojektowano w taki sposób, aby różnicować gatunki wykrywane w jednym kanale za
pomocą ich wartości TM.
Automatyczna identyfikacja gatunków i kontroli
Temperatury topnienia (TM) próbek i kontroli są analizowane przez oprogramowanie przeznaczone do identyfikacji (SeptiFast Identification
Software), a następnie jest tworzony raport. Małe stężenia koagulazoujemnych gronkowców (Staphylococci; CoNS) i paciorkowców
(Streptococci), będące odzwierciedleniem skażenia procedury, nie są pokazywane jako wynik.
Jeśli uzyskano pozytywny wynik na obecność Staphylococcus aureus, należy rozważyć przeprowadzenie w dalszej kolejności badania
w kierunku oporności mecA. Szczegóły znajdują się w ulotce dołączonej do opakowania zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
(P/N: 04 488 814 001).
ODCZYNNIKI
SeptiFast Lys Kit MG
P/N: 04 404 432 001 100 testów
LM (macierz lizująca)
szklane/ceramiczne kulki
100 x
SeptiFast Prep Kit MG
P/N: 04 404 459 001
[1] LB (bufor lizujący)
< 50% tiocyjanian guanidyny
bufor Tris-HCl
20% Triton X-100
10 testów
20 x 1500 µl
Produkt szkodliwy
[2] PK(proteinaza K)
2% proteinaza K
glicerol
2 x 850 µl
Produkt szkodliwy
[3] BB (bufor wiążący)
< 50% tiocyjanian guanidyny
bufor Tris-HCl
20% Triton X-100
10 x 1000 µl
Produkt szkodliwy
2
SeptiFast Prep Kit MG
P/N: 04 404 459 001
[4] IRB (bufor usuwający inhibicję)
< 50% chlorowodorek guanidyny
bufor Tris-HCl
< 40% etanol
10 testów
10 x 1800 µl
Produkt szkodliwy
[5] WB (bufor płuczący)
< 0,2% chlorek sodu
bufor Tris-HCl
< 80% etanol
10 x 1600 µl
Produkt wysoce
łatwopalny
[6] EB (bufor do elucji)
bufor Tris-HCl
10 x 400 µl
BET (probówki do ekstrahowania krwi)
1 x 50
FC (kolumny filtracyjne)
2x5
LightCycler® SeptiFast Kit MG
P/N: 04 469 046 001
54 testy
[1a] RM 1a (mieszanina reakcyjna 1a)
3 U/µl polimeraza FastStart Taq
< 0,1% enzym AmpErase (uracylo-N-glikozylaza)
3 x 27 µl
[1b] RM 1b (mieszanina reakcyjna 1b)
< 1% Brij
< 0,1% roztwór magnezu
< 0,1% dNTP
bufor Tris-HCl
3 x 620 µl
[2] DM G+ (mieszanina detekcyjna dla bakterii Gram-dodatnich)
< 0,001% primer, sondy dla bakterii G+
< 1% Brij
bufor Tris-HCl
3 x 126 µl
[3] DM G– (mieszanina detekcyjna dla bakterii Gram-ujemnych)
< 0,001% primer, sondy dla bakterii G–
< 1% Brij
bufor Tris-HCl
3 x 126 µl
[4] DM F (mieszanina detekcyjna dla grzybów)
< 0,001% primer, sondy dla grzybów
< 1% Brij
bufor Tris-HCl
3 x 126 µl
[5] RC G+ (kontrola odczynników dla bakterii Gram-dodatnich)
< 0,001% kontrolny matrycowy DNA dla bakterii G+
EDTA
bufor Tris-HCl
1 x 330 µl
[6] RC G– (kontrola odczynników dla bakterii Gram-ujemnych)
< 0,001% kontrolny matrycowy DNA dla bakterii G–
EDTA
bufor Tris-HCl
1 x 330 µl
[7] RC F (kontrola odczynników dla grzybów)
< 0,001% kontrolny matrycowy DNA dla grzybów
EDTA
bufor Tris-HCl
1 x 330 µl
[8] IC (kontrola wewnętrzna)
5 x 100 µl
< 0,001% DNA w matrycy kontroli procedury dla bakterii G+, G–
i dla grzybów
EDTA
bufor Tris-HCl
[9] NC (kontrola ujemna)
< 35% glikol polietylenowy 10000
bufor Tris-HCl
10 x 1600 µl
SeptiFast Software Set v1.1
P/N: 04 705 220 001
Oprogramowanie SeptiFast Identification Software v1.1
Makropolecenie SeptiFast Macro v1.0
SeptiFast mecA Macro v1.0
SeptiFast MCC Macro v1.0
Pliki testujące SeptiFast Proof Files v1.1
3
1x
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
Ogólne ostrzeżenia i środki ostrożności
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Niniejszy test jest przeznaczony wyłącznie do stosowania z krwią ludzką pobraną do probówki zawierającej K-EDTA.
Nie pipetuj ustami.
Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami i odczynnikami z zestawów, stosuj
jednorazowe rękawice bez talku, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyj ręce po pracy z próbkami
i odczynnikami testowymi.
Nie łącz odczynników pochodzących z różnych serii.
Nie mieszaj odczynników z różnych zestawów, z wyjątkiem wymaganych do przygotowania mieszaniny głównej Master Mix.
Wyrzuć wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi i lokalnymi.
Nie używać zestawu po upływie daty ważności.
Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS – Material Safety Data Sheets) są dostępne na żądanie u miejscowego
przedstawiciela firmy Roche.
Z próbkami należy obchodzić się tak, jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak
określone w dokumentach Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (8) oraz w CLSI Document M29-A (9). Wszystkie
powierzchnie robocze i rękawiczki dokładnie oczyść i odkaź za pomocą odczynnika odkażającego do DNA (np. LTK-008™). Upewnij
się, że rękawiczki są odporne na działanie odczynnika odkażającego do DNA.
Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Unikaj
kontaktu wspomnianych odczynników ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą
ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania wspomnianych odczynników
należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą.
Unikaj kontaktu buforu do lizy (LB) i buforu wiążącego (BB) ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu,
natychmiast spłucz dużą objętością wody, w przeciwnym razie powstać mogą oparzenia. Przed wytarciem rozcieńcz rozlane
odczynniki wodą. Nie pozwól, by LB i BB zetknęły się z roztworem podchlorynu (wybielacza). Połączenie to może skutkować
wytworzeniem silnie trującego gazu.
Praca w laboratorium musi przebiegać w sposób jednokierunkowy – należy ją rozpocząć w obszarze przedamplifikacyjnym
i przemieszczać się jednokierunkowo w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności przedamplifikacyjne
obejmują przygotowanie odczynników i próbek. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej czynności
poprzedzającej proces amplifikacji; nie wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym
obszarze konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały
zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki
i kontroli lub pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA bądź innych źródeł docelowego DNA. Materiały i urządzenia
używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
Obecność enzymu AmpErase w mieszaninie głównej (Master Mix) zmniejsza ryzyko skażenia amplikonu. Jednakże zanieczyszczenia
materiałem pochodzącym z kontroli dodatnich oraz z dodatnich próbek klinicznych można uniknąć jedynie dzięki stosowaniu zasad
dobrej praktyki laboratoryjnej i starannemu przestrzeganiu procedur opisanych w niniejszej ulotce, dołączonej do opakowania zestawu.
Szczegółowe ostrzeżenia i środki ostrożności dotyczące używania testu LightCycler® SeptiFast MG
DNA mikroorganizmów docelowych dla testu LightCycler® SeptiFast MG jest obecne w środowisku. Aby uniknąć uzyskania wyników fałszywie
dodatnich uzyskanych w następstwie wykrycia DNA pochodzącego z otoczenia (skażenie DNA), należy zapewnić przebieg procedury
w warunkach wolnych od skażającego DNA. W szczególności źródłem skażenia DNA może być użytkownik, ponieważ ludzka skóra i górne drogi
oddechowe są zasiedlone przez różne mikroorganizmy, które są także organizmami docelowymi dla testu LightCycler® SeptiFast MG
[np. Streptococci i koagulazoujemne Staphylococci (CoNS)]. Zalecane jest przestrzeganie poniższych zasad w celu uniknięcia skażenia DNA.
Odczynniki i materiały jednorazowe testu LightCycler® SeptiFast MG
• Odczynniki i materiały jednorazowe testu LightCycler® SeptiFast MG mają jakość MG.
• Produkty MG zaprojektowano do stosowania podczas detekcji z bardzo dużą czułością kwasu nukleinowego bakterii i grzybów. W celu
eliminacji zanieczyszczeń DNA, które mogłyby interferować z takimi oznaczeniami, opracowano zastrzeżone technologie produkcji.
• Unikaj otwierania i zamykania fiolek z odczynnikami, gdy nie jest to konieczne.
Odzież ochronna i rękawiczki
• Podczas całej procedury używaj rękawiczek bez talku.
• Unikaj ekspozycji skóry; noś rękawiczki zachodzące na rękawy fartucha laboratoryjnego.
• W przypadku skażenia rękawiczek natychmiast je zmień lub wyczyść odczynnikiem odkażającym do DNA (np. LTK-008™; rękawiczki
muszą być odporne na ten odczynnik).
• Nie dotykaj części dłoniowej i palców rękawiczek podczas ich zakładania.
Konserwacja wyciągu z przepływem laminarnym
• Po każdym przygotowaniu próbek czyść powierzchnie robocze wyciągu z przepływem laminarnym za pomocą odczynnika
odkażającego do DNA.
UWAGA: Upewnij się, że sprzęt jest odporny na działanie odczynnika odkażającego do DNA.
• Czyść wszystkie powierzchnie wewnątrz wyciągu z przepływem laminarnym (tj. jego ściany, przestrzenie pod płytką dolną, płytkę
podłogową) w regularnych odstępach czasu.
• Upewnij się, że w wyciągu z przepływem laminarnym nie ma próbek z DNA (jeśli jest on używany przez kilku użytkowników).
• Włącz lampę UV i strumień powietrza na co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem pracy.
• Wyłącz lampę UV podczas przystępowania do pracy.
Konserwacja stacji roboczej PCR
• Po każdym skonfigurowaniu reakcji PCR czyść powierzchnie przestrzeni roboczej stacji roboczej PCR za pomocą odczynnika
odkażającego do DNA.
• Czyść wszystkie przestrzenie wewnątrz stacji roboczej PCR w regularnych odstępach czasu.
• Włącz lampę UV na co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem pracy. Upewnij się, że podczas pracy lampa UV jest wyłączona.
UWAGA: Zmieniaj lampę UV wyciągu z przepływem laminarnym i stacji roboczej PCR zgodnie ze wskazówkami producenta.
4
Postępowanie z urządzeniami i materiałami eksploatacyjnymi
• Jeżeli to możliwe, swoiste materiały eksploatacyjne i urządzenia używane do przeprowadzenia testu LightCycler® SeptiFast MG
pozostawiaj pod wyciągiem z przepływem laminarnym.
• Przed przystąpieniem do pracy poddawaj wszystkie elementy działaniu światła UV przez co najmniej 30 minut.
• Używaj wyłącznie materiałów jednorazowych wolnych od DNA (np. jakości MG; patrz część „Materiały wymagane, lecz
niedostarczane”). Wymienione materiały mogą być używane tylko jeden raz.
• Do zamykania kapilar używaj narzędzia korkującego (w celu uzyskania wskazówek dotyczących postępowania zapoznaj się
z podręcznikiem użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0).
• W przypadku pęknięcia kapilary zapoznaj się z podręcznikiem użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0 (rozdział „Konserwacja”).
Środki ostrożności podczas pipetowania
• Fiolki z odczynnikami, pudełka z końcówkami do pipet oraz pudełka z kapilarami otwieraj tylko pod wyciągiem z laminarnym
przepływem powietrza.
• Nie używaj tych samych końcówek do pipet i kapilar poza wyciągiem z przepływem laminarnym.
• Nie dotykaj krawędzi ani gwintów otwartej fiolki. Podczas pipetowania dotykaj fiolki poniżej krawędzi.
• Nie dotykaj krawędzi otwartej kapilary.
• Ustaw w logicznym porządku wszystkie elementy używane podczas pracy pod wyciągiem z przepływem laminarnym (unikaj
pipetowania „na krzyż”).
• W przypadku rozlania zakończ dany etap pracy i niezwłocznie wyczyść przestrzeń roboczą za pomocą odczynnika odkażającego do
DNA (np. LTK-008™).
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA
Zestaw SeptiFast Lys Kit MG
•
•
•
Należy przechowywać w temperaturze od 15° do 25°C.
Należy otwierać fiolki tylko jeden raz. Nie wolno stosować powtórnie.
Nie należy używać po upływie daty przydatności.
Zestaw SeptiFast Prep Kit MG
•
•
•
•
•
Należy przechowywać w temperaturze od 15° do 25°C (nie zamrażać ani nie przechowywać w lodówce).
Należy otwierać PK maksymalnie 3 razy.
Pozostałe fiolki należy otwierać tylko jeden raz i wyrzucać niezużyte odczynniki.
Nie wolno używać odczynników z różnych serii podczas jednego przebiegu procesu ekstrakcji.
Nie należy używać po upływie daty przydatności.
LightCycler® SeptiFast Kit MG
•
•
•
•
•
•
•
•
Należy przechowywać w temperaturze od –15° do –25°C.
Przechowywać z dala od światła.
Należy przechowywać mieszaniny główne Master Mix (mieszaniny [1a], [1b] i [2] lub [3] lub [4]) w temperaturze od 2° do 8°C
maksymalnie przez 3 dni.
Należy przechowywać RC (kontrolę odczynników) po użyciu w temperaturze od 2° do 8°C maksymalnie przez 10 dni lub zamrażać
w temperaturze od –15° do –25°C natychmiast po każdym użyciu.
Można otwierać RC maksymalnie 6 razy.
Pozostałe fiolki należy otwierać tylko jeden raz i wyrzucać niezużyte odczynniki.
Nie wolno używać odczynników z różnych serii podczas jednego przebiegu PCR.
Nie należy używać po upływie daty przydatności.
MATERIAŁY DOSTARCZONE
SeptiFast Lys Kit MG
P/N: 04 404 432 001 100 testów
SeptiFast Prep Kit MG
P/N: 04 404 459 001 10 testów
LightCycler® SeptiFast Kit MG
P/N: 04 469 046 001 54 testy
SeptiFast Software Set v1.1 (dostarczane tylko raz)
P/N: 04 705 220 001
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
Wymienione materiały można nabyć w firmie Roche
Urządzenie LightCycler® 2.0 z oprogramowaniem 4.05.415
03 531 414 201
Kapilary LightCycler® MG (100 µl)
03 612 066 001
Wirówka LC 2.0 na obrotowy pojemnik
03 709 582 001
Urządzenie MagNA Lyser (230 V)
03 358 976 001
Zestaw LightCycler® Multicolor Compensation Set
04 484 355 001
Blok chłodzący SeptiFast
04 555 864 001
Wymieniony sprzęt można nabyć w innych firmach
Wirówka z horyzontalnym wirnikiem na probówki 15 ml; min. wirowanie
z przyspieszeniem 4200 g (np. firmy Eppendorf)
• 1x wirówka 5810
• 2x łączniki (1 para) z częściami dla probówek 15 ml ze stożkowym dnem
• 1x wirnik horyzontalny, min. wirowanie z przyspieszeniem 4200 x g
5
VWR International
521-0076
521-0061
521-0044
Wirówka (np. firmy Eppendorf)
• 1x MiniSpin®
VWR International
521-0012
2 miksery termiczne (np. firmy Eppendorf),
• w tym 2x mikser termiczny Comfort,
• 1x blok termiczny dla 24 fiolek 2,0 ml oraz
• 1x blok termiczny dla 8 fiolek 15 ml
VWR International
460-1112
460-1116
460-1120
Mikser obrotowy dla butelek/probówek (np. firmy Stuart Scientific)
• 1x mikser obrotowy
• 1x mieszadło wibracyjne
VWR International
445-5210
444-1372
Wolne od DNA fiolki i końcówki (np. materiały jednorazowe MG Disposables,
greiner bio-one)
• Końcówki filtrujące MG 5 ml
• Końcówki filtrujące MG 1 ml
• Końcówki filtrujące MG 100 µl
• Końcówki filtrujące MG 20 µl
• Pipeta do surowicy MG 1 ml
• Probówki MG 1,5 ml
greiner bio-one
940525MG
750289MG
772289MG
774289MG
700371MG
616202MG
Odczynnik odkażający do DNA (np. firmy biodelta GmbH)
• Zestaw LTK-008™
biodelta GmbH
200-000
Pipeta 1–5 ml (np. firmy Thermo Life Sciences)
• 1x pipeta Finnpette 1–5 ml
VWR International
613-2541
Pipeta 10–1000 µl (np. firmy Eppendorf)
• 2x zakres 100–1000 µl
• 2x zakres 10–100 µl
• 1x zakres 2–20 µl (wyłącznie do wykrywania genu mecA)
VWR International
613-3650
613-3649
613-3647
Wyciąg z przepływem laminarnym (np. firmy Cleanair)
• BioSafety Cabinet EF 4E
VWR International
135-0055
Stacja robocza PCR (np. firmy Safety Cabinet Solutions Ltd.)
• Biocap Passive DNA PCR Cabinet
VWR International
135-6576
Materiał do kontroli dodatniej
• Dostarczany przez inne firmy lub przygotowywany w laboratorium
użytkownika (patrz część „Propozycja przygotowania materiałów do
kontroli dodatniej”).
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
UWAGA: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym.
Pobieranie próbek
Test LightCycler® SeptiFast MG jest przeznaczony do użytku wyłącznie z próbkami krwi z K-EDTA. Krew powinno się pobierać do jałowych
probówek zawierających K-EDTA jako antykoagulant.
Transport i przechowywanie próbek
Krew pełna musi być transportowana zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników
etiologicznych (10). Krew pełna musi być transportowana/przechowywana w temperaturze od –15° do –25°C lub od 2° do 8°C do 3 dni lub w
temperaturze od 15° do 25°C do 4 godzin.
Stabilność eluatów
Należy używać przygotowanych próbek bezpośrednio po oczyszczeniu DNA. Należy zachować jednakową objętość każdej próbki, aby móc
później przeprowadzić badanie na obecność genu mecA (jeżeli będzie to potrzebne; więcej informacji można znaleźć w zestawie LightCycler®
SeptiFast mecA Kit MG). Eluaty można przechowywać do 30 dni w temperaturze od –15° do –25°C, do 8 dni w temperaturze od 2° do 8°C
lub w temperaturze od 15° do 25°C do 4 godzin.
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
Przed rozpoczęciem przygotowania próbek i kontroli
Przygotowanie urządzenia LightCycler® 2.0 i stacji roboczej PCR
Kompensacja kolorów:
•
Używaj zestawu LightCycler® Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001). Jeżeli plik kompensacji kolorów utracił ważność,
przygotuj nowy plik. Szczegółowe informacje przedstawiono w ulotce dołączonej do opakowania zestawu LightCycler® Multicolor
Compensation Set.
Instalacja oprogramowania SeptiFast Identification Software (SIS):
Aby zainstalować aktualizacje, sprawdź, czy wraz z produktem dostarczono dodatkową informację.
1. Zaloguj się w stacji danych LightCycler® jako administrator.
2. Włóż płytę CD z oprogramowaniem SeptiFast Software Set do czytnika stacji danych LightCycler®.
3. Aby przeprowadzić pierwszą instalację: Jeżeli dotychczas nie zainstalowano oprogramowania szkieletowego Microsoft .NET 1.1,
zostaniesz poproszony o jego zainstalowanie na początku konfigurowania programu SIS. Oprogramowanie szkieletowe Microsoft
.NET 1.1 musi być zainstalowane. W przeciwnym przypadku oprogramowanie SIS nie będzie działać prawidłowo.
4. Aby rozpocząć instalację oprogramowania SIS, naciśnij przycisk <OK>; następnie postępuj zgodnie ze wskazówkami kreatora
instalacji.
6
5. Wybierz opcję <just me>, jeżeli tylko jeden użytkownik będzie korzystał ze stacji danych LightCycler®; wybierz opcję <everyone>,
jeżeli ze stacji danych LightCycler® będzie korzystać więcej niż jedna osoba.
6. W oknie <Setup succeeded> zatwierdź dokonane czynności, naciskając przycisk <OK> (oprogramowanie SIS można uruchomić,
klikając odpowiednią ikonę na pulpicie).
7. Folder danych przeznaczony dla plików *.ixo: <C:\Export to SIS>, jest tworzony automatycznie.
Sprawdzanie, czy oprogramowanie SIS zainstalowano prawidłowo (do pracy z testem LightCycler® SeptiFast MG i zestawem LightCycler® SeptiFast mecA
Kit MG:
1. Wszystkie pliki testujące są automatycznie kopiowane z płyty CD z oprogramowaniem SeptiFast Software Set do folderu <C:\Export
to SIS>.
2. Kliknij dwukrotnie ikonę SIS na pulpicie, następnie naciśnij przycisk <Start>.
3. Wybierz plik testujący z folderu <C:\Export to SIS> (odpowiednio SeptiFast Proof 1.0.ixo lub SeptiFast mecA Proof 1.0).
4. Wybierz „NO” jako odpowiedź na pytanie, czy raport LightCycler® zawiera oznaczenie <User Developed or Modified Test Method>.
5. Plik zostanie automatycznie zanalizowany, a dane zostaną wyświetlone.
6. Wydrukuj raport.
7. Otwórz i wydrukuj właściwe pliki PDF (odpowiednio SeptiFast Proof v1.1.pdf lub SeptiFast mecA Proof v1.1.pdf).
8. Wydrukowany raport i wydrukowany plik proof.pdf muszą być ze sobą zgodne. Jeśli tak nie jest, proszę skontaktować się
z miejscowym przedstawicielem firmy Roche.
9. Wykonaj czynności z punktów 3–8 dla drugiego pliku testującego.
Odinstalowywanie programu SIS:
1.
2.
3.
4.
5.
Zaloguj się w stacji danych LightCycler® jako administrator.
Kliknij <Start> na pasku zadań stacji danych LightCycler®.
Wybierz pozycje <Settings – Control Panel – Add/Remove Programs>.
Pojawi się lista aktualnie zainstalowanych programów; kliknij pozycję <SIS>.
Wybierz <Remove> i potwierdź, klikając <Yes>.
Instalowanie makropoleceń SeptiFast Macro:
1. Zainstaluj makropolecenia z płyty CD z oprogramowaniem SeptiFast Software Set.
2. Informacje na temat instalowania makropoleceń znajdują się w podręczniku użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0 („do stosowania
w diagnostyce in vitro”).
Przygotowanie wyciągu z przepływem laminarnym oraz stacji roboczej PCR
1. Dokładnie wyczyść i odkaź wyciąg z przepływem laminarnym oraz stację roboczą PCR (np. za pomocą LTK-008™).
2. Włącz na co najmniej 30 minut: lampę UV i przepływ powietrza w wyciągu z przepływem laminarnym, lampę UV w stacji roboczej PCR.
3. Wyłącz lampę UV podczas przystępowania do pracy.
4. Otwórz zestaw LightCycler® SeptiFast Kit MG i wyjmij:
• 1 fiolkę IC oraz 1 fiolkę NC; pozostaw je do rozmrożenia w temperaturze od 2° do 8°C w statywie do przygotowywania próbki (element
niedostarczony);
• 1 fiolkę RM 1a, RM 1b, DM G+, DM G–, DM F, RC G+, RC G–, RC F; fiolki pozostaw do rozmrożenia w bloku chłodzącym SeptiFast
w temperaturze od 2° do 8°C podczas przygotowywania próbek.
5. Włącz: mikser termiczny 1 (dla probówek 15 ml) i nastaw go na 56°C; mikser termiczny 2 (dla probówek 1,5 ml) i nastaw go na 70°C.
6. Włóż odpowiednią liczbę fiolek z EB (1 fiolka na próbkę/NC) do miksera termicznego 2 (70°C).
7. Umieść probówki z krwią lub fiolki z próbkami w mikserze obrotowym do butelek i mieszaj przez 30 minut. Przetwarzaj natychmiast.
Przygotowanie próbki i kontroli
UWAGA: Wszystkie etapy postępowania wykonuj pod wyciągiem z przepływem laminarnym.
Propozycja przygotowania materiałów do kontroli dodatniej
• Po rozpoczęciu procedury przygotowania próbek należy wykonać wszystkie etapy.
• Materiały do kontroli dodatniej można zakupić w innych firmach.
• Jeżeli materiały te są przygotowywane w laboratorium użytkownika, należy wybrać dobrze opisane izolaty kliniczne (opierając się na
lokalnej częstości występowania i znaczeniu klinicznym). Wyizolowane kolonie powinny zostać ponownie zawieszone i dodane do
ujemnej próbki krwi, aby uzyskać stężenie ok. 300 CFU/ml.
• Jako kontroli dodatniej można użyć materiału ATCC 33592 (metycylinoopornego S. aureus), który umożliwia zastosowanie eluatu jako kontroli
dodatniej dla testu LightCycler® SeptiFast MG oraz dla zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG (P/N: 04 488 814 001).
• Szczep hodowano przez 18–24 godzin w temperaturze od 28° do 37°C na agarze z krwią (krew owcza 5%) i ponownie zawieszono
w buforze, uzyskując roztwór równoważny 0,5 wzorcowi McFarlanda (~1,5 x 108 CFU/ml). Zawiesinę tę następnie dodaje się do
ujemnej próbki krwi, aby osiągnąć ostateczne stężenie 300 CFU/ml.
Procedura lizy wstępnej z użyciem zestawu SeptiFast Lys Kit MG
UWAGA: Dokładnie przeczytaj podręcznik użytkownika urządzenia MagNA Lyser.
1. Użyj jednej odpowiednio oznaczonej fiolki LM na każdą próbkę lub NC.
2. Otwórz fiolkę i przenieś 1500 µl próbki krwi lub NC.
3. Zamknij szczelnie probówkę.
UWAGA: Nie podpisuj probówek na szczycie korka.
4. Dokonaj wstępnej lizy próbek w urządzeniu MagNA Lyser (70 sekund przy prędkości 7000 obr./min).
5. Pozostaw fiolki poza urządzeniem na 10 minut. Nie wiruj w wirówce!
Przygotowanie próbki z użyciem zestawu SeptiFast Prep Kit MG
UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być przejrzystymi roztworami. Jeżeli powstały osady, ogrzej roztwór (maks. do 37°C).
Delikatnie wstrząśnij, aż osady rozpuszczą się.
1. Dodaj 150 µl PK do BET 1.
2. Dodaj 1 ml poddanej wstępnej lizie próbki lub NC do BET 1. Unikaj pipetowania stałej macierzy lizującej lub piany.
3. Zamknij i mieszaj przez chwilę na mieszadle wibracyjnym.
4. Dodaj 10 µl IC. Do każdej próbki lub NC używaj nowej końcówki do pipety.
7
5. Dodaj zawartość 2 fiolek LB, zamknij korkiem i natychmiast dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym.
6. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 56°C, delikatnie mieszając (np. za pomocą miksera termicznego firmy Eppendorf przy
prędkości 500 obr./min).
UWAGA: Całość cieczy w BET 1 musi być pokryta przez urządzenie inkubujące.
7. Dodaj zawartość 1 fiolki BB, zamknij korkiem i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym.
8. Połóż FC na BET 2. Nie dotykaj wewnętrznej strony i otworu FC.
9. Odpipetuj połowę mieszaniny przygotowawczej próbki z BET 1 na filtr FC (ok. 2,7 ml).
10. Zamknij korkiem i odwiruj układ BET 2-FC przez 1 minutę z przyspieszeniem 1900 x g.
11. Odpipetuj pozostałą mieszaninę przygotowawczą próbki z BET 1 na filtr FC (ok. 2,7 ml). Do każdej próbki lub NC używaj nowej
końcówki do pipety.
12. Zamknij korkiem i odwiruj układ BET 2-FC przez 3 minut z przyspieszeniem 1900 x g.
13. Połóż FC na BET 3. Wyrzuć BET 2 z zawartością.
14. Dodaj zwartość jednej fiolki IRB na filtr FC w BET 3.
15. Zamknij korkiem i odwiruj układ BET 3-FC przez 2 minut z przyspieszeniem 4200 x g.
16. Dodaj zwartość jednej fiolki WB na filtr FC w BET 3.
17. Zamknij korkiem i odwiruj układ BET 3-FC przez 10 minut z przyspieszeniem 4200 x g.
18. Połóż FC na BET 4. Wyrzuć BET 3 z zawartością.
19. Odwiruj BET 4 przez 1 minutę z przyspieszeniem 4200 x g.
20. Połóż FC na BET 5. Wyrzuć BET 4.
21. Odpipetuj 300 µl wstępnie ogrzanego EB (70°C) na środek FC.
22. Zamknij korkiem i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
23. Odwiruj przez 2 minuty z przyspieszeniem 4200 x g.
24. Wyrzuć FC. Przenieś eluat do fiolek 1,5 ml (np. pipetą do surowicy firmy greiner bio-one). Unikaj kontaktu ze ścianą probówki.
Przygotowanie odczynników przy użyciu zestawu LightCycler® SeptiFast Kit MG
UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie wszystkich etapów postępowania w stacji roboczej PCR w innym pomieszczeniu niż to,
w którym przygotowywano próbki.
1. Wyjmij blok chłodzący SeptiFast z fiolkami zawierającymi odczynniki z lodówki, odkaź odczynnikiem do odkażania DNA (np.
LTK-008™) i przenieś do stacji roboczej PCR.
2. Mieszaj przez chwilę rozmrożone odczynniki (z wyjątkiem RM 1a) na mieszadle wibracyjnym i odwiruj wszystkie odczynniki (jeżeli
powstały osady, przez 5 minut rozgrzewaj roztwór do temperatury 37°C i mieszaj delikatnie, aż osady rozpuszczą się).
3. Umieść fiolki z rozmrożonymi odczynnikami i fiolki z eluatami we wskazanych położeniach w bloku chłodzącym SeptiFast.
4. Otwórz fiolki RM 1b, RM 1a, DM G+, DM G– i DM F.
5. Odpipetuj 600 µl RM 1b do RM 1a, wymieszaj delikatnie, pipetując w górę i w dół.
6. Odpipetuj 200 µl mieszaniny reakcyjnej z 1a do każdej fiolki DM G+, DM G– i DM F, aby stworzyć mieszaninę główną Master Mix
MM G(+), MM G(–) i MM F; wymieszaj delikatnie, pipetując w górę i w dół.
Przygotowanie reakcji PCR
1. Włóż wymaganą liczbę kapilar do bloku chłodzącego SeptiFast, 3 kapilary na RC (pozycje 1, 2, 3), 3 kapilary na eluaty NC (pozycje
4, 5, 6), 3 kapilary na każdy eluat próbki (pozycje 7 i kolejne).
2. Odpipetuj po 50 µl odczynnika MM G(+) do każdej kapilary w górnym rzędzie.
3. Odpipetuj po 50 µl odczynnika MM G(–) do każdej kapilary w środkowym rzędzie.
4. Odpipetuj po 50 µl odczynnika MM F do każdej kapilary w środkowym rzędzie.
5. Otwórz fiolkę z eluatem pierwszej próbki. Rozpocznij od fiolki po prawej stronie bloku chłodzącego SeptiFast.
6. Odpipetuj po 50 µl eluatu próbki do każdej z trzech kapilar powyżej, zawierających odczynniki MM G(+), MM G(–) i MM F.
UWAGA: Po każdym pipetowaniu zmień końcówkę.
7. Zamknij te trzy kapilary za pomocą urządzenia korkującego (część urządzenia LightCycler® 2.0; więcej informacji na temat jego
używania znajduje się w podręczniku użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0).
8. Postępuj z elauatami pozostałych próbek tak, jak to opisano w punktach 5–7. Na końcu odpipetuj eluat NC do kapilar w pozycjach 4, 5 i 6.
9. Otwórz odczynnik RC G+.
10. Odpipetuj 50 µl do kapilary w pozycji 1.
11. Zamknij kapilarę, następnie zamknij odczynnik RC G+.
12. Odpipetuj odczynniki RC G– i RC F odpowiednio do kapilar w pozycjach 2 i 3 tak, jak to opisano w punktach 9–11.
13. Przenieś wszystkie kapilary zgodnie z ich numerami do obrotowego pojemnika na próbki LightCycler®.
14. Odwiruj obrotowy pojemnik na próbki LightCycler® za pomocą wirówki LC 2.0.
15. Umieść obrotowy pojemnik na próbki LightCycler® w urządzeniu LightCycler® 2.0.
Przechowywanie niezużytych odczynników i eluatów.
1. Opatrz etykietką wszystkie niezużyte mieszaniny główne Master Mix MM G(+), MM G(–) i MM F; na etykietkach określ liczbę
pozostałych do wykonania reakcji i umieść datę. Umieść fiolki w równoważnych pozycjach bloku chłodzącego SeptiFast.
2. Mieszanina główna Master Mix MM może być przechowywana w temperaturze od 2° do 8°C do 3 dni. W celu przeprowadzenia
kolejnego przebiegu można dopełnić objętość mieszaniny głównej Master Mix (MM) świeżą MM, aby powstała wymagana objętość
roztworu roboczego. Tak powstały roztwór musi zostać natychmiast użyty.
3. Opatrz eluaty próbek i NC etykietkami z numerem przebiegu oraz datą i przechowuj zgodnie z zaleceniami.
4. Wyrzuć wszystkie puste fiolki na odczynniki.
Ładowanie i obsługa urządzenia LightCycler® 2.0
UWAGA: Zaleca się, aby w pokoju, w którym pracuje urządzenie LightCycler® 2.0, nie oczyszczano DNA ani nie przygotowywano
roztworów roboczych.
1. Uruchom makropolecenie SeptiFast Macro „SeptiFast_1.0_04469046001” lub nowsze (więcej informacji znajduje się w podręczniku
użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0 w rozdziale „Uruchamianie makropolecenia Roche Macro”).
8
UWAGA: Jeżeli użytkownik jest wylogowany, nie rozpoczynaj przebiegu testowego. Rozpocznij nowy przebieg z nową nazwą.
UWAGA: Nie używaj pola <assay lot number>. Jeżeli chcesz dodać numer serii oznaczenia do wykonywanego przebiegu, umieść tę
informację w odpowiednim polu w edytorze próbki.
2. Zapisz przebieg testowy z nazwą umożliwiającą jednoznaczną identyfikację (np. nazwisko użytkownika i data).
3. Zmniejsz liczbę próbek domyślnej listy załadunkowej, jeżeli wymaganych jest mniej niż 7 próbek. Wykasuj wszystkie 3 kapilary jednej
próbki z listy, nie tylko 1 lub 2 z 3 równoległych oznaczeń. Jeżeli przypadkowo wykasowano zbyt dużo kapilar, nie dodawaj ich, lecz
rozpocznij procedurę od nowa.
4. Można wpisać szczegółowe dane pacjenta w <nawiasach> zamiast używać ustawień standardowych [np. G(+) <Nazwisko_01>
zamiast G(+) <próbka 1>]. Tekst musi być identyczny w 3 równoległych oznaczeniach z listy próbki, aby zapewnić właściwe
rozpoznawanie przez oprogramowanie SIS. Można również pozostawić ustawienia standardowe i użyć opcji <Run Note>, aby
wpisywać dane wówczas, gdy jest to potrzebne.
5. Po dodaniu wszystkich informacji dotyczących próbki kontynuuj pracę z kreatorem zestawu i uruchom urządzenie LightCycler® 2.0.
UWAGA: Nie zmieniaj pierwszych członów nazw G(+), G(–), F.
Nie zmieniaj nazw kontroli odczynników [np. G(+) #RC#] i kontroli ujemnych [np. G(+) #NC#].
6. Po zakończonym przebiegu testowym sprawdź poziom płynu w kapilarach (wyniki dla danej kapilary będą nieważne, jeżeli objętość jej
zawartości jest zmienna).
Wykrywanie największej wartości oraz automatyczna identyfikacja gatunku
Ogólne objaśnienie modułów analizy
UWAGA: Nie rozpoczynaj analizy danych podczas pracy urządzenia LightCycler® 2.0.
• Ręczne określanie TM wymaga 12 modułów określania TM (3 oznaczenia, 4 kanały). Moduły bezwzględnego oznaczania ilościowego
nie wymagają żadnej obsługi ręcznej.
• Ręczne określanie TM może zostać przeprowadzone dla nie więcej niż 6 największych wartości przy użyciu pasków TM.
• Paski TM każdego modułu analizy są wstępnie definiowane w makropoleceniu SeptiFast Macro.
• W oknie największej wartości temperatury topnienia przedstawiono wszystkie krzywe wybranych wykresów.
• Można zaznaczyć lub usunąć zaznaczenie pasków TM, które nie mają oznaczenia.
• Wartości początkowe każdego modułu analizy są wstępnie definiowane w makropoleceniu SeptiFast Macro.
• Nie zmieniaj ani nie usuwaj oznaczenia wartości początkowych. Jeśli doszło do przypadkowej zmiany, wpisz prawidłowe wartości z
tabeli 3: Wartości początkowe.
• Jeżeli aktywowana jest więcej niż jedna kapilara, ustawienia pierwszej kapilary są wyświetlone w polu wyboru.
• Przesunięcie pasków ma wpływ na wszystkie aktywowane kapilary.
UWAGA: Nie zmieniaj następujących ustawień: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>,
<Peak Area> lub <Peak Width>.
• Można wybrać ustawianie parametru <Display – Peak Height>.
• Największe wartości są definiowane jako wartości najbardziej odbiegające w górę od wartości początkowej. Ustawienia „Shoulders”
(ramiona) nie stanowią największych wartości.
• Wyjątkami są odczynnik RC G-, kanał 610 (np. Rysunek 1, Wykres 2) oraz 670 a także odczynnik RC F i kanał 705.
• Na wykresie 1 dwie lewe największe wartości są wartościami najbardziej odbiegającymi w górę i muszą zostać zaznaczone suwakami.
• Na wykresie 2 jedna z największych wartości (np. druga) jest pokazana jako ramię, ale musi być także zaznaczona.
• Na wykresach 3 i 4 brakuje jednej z największych wartości. Aktywować należy tylko dwa suwaki (zamiast trzech).
Rysunek 1: RC G–, kanał 610
Wykres 1
•
Wykres 2
Wykres 3
Wykres 4
Suwaki TM muszą zostać wybrane we właściwych zakresach TM (patrz tabela 2).
Tabela 2: Zakresy TM dla ważnych największych wartości
CH 610
•
CH 640
CH 670
CH 705
Niska TM
[°C]
Wysoka TM
[°C]
Niska TM
[°C]
Wysoka TM
[°C]
Niska TM
[°C]
Wysoka TM
[°C]
Niska TM Wysoka TM
[°C]
[°C]
G(+)
48
53
49
64
49
59
45
65
G(–)
52
66
55
69
48
65
57
62
F
56
61
44
58
49
62
51
62
Wartości początkowe są wstępnie zdefiniowane zgodnie z poniższą tabelą. Nie mogą one być zmieniane. (Jeżeli doszło do ich
przypadkowej zmiany, wpisz poprzednie wartości zgodnie z tabelą; w przeciwnym razie przebieg testowy zostanie oznaczony).
9
Tabela 3: Wartości początkowe
CH 610
CH 640
CH 670
G(+)
0,159
0,027
0,061
CH 705
0,027
G(–)
0,234
0,001
0,236
0,065
F
0,196
0,033
0,111
0,059
Dostosowywanie pasków TM
1. Po zakończeniu przebiegu kreator badania informuje: <Analyses have been created>.
2. Zminimalizuj okno (nie naciskaj przycisku <Finish>).
3. Upewnij się, że wartości TM i wartości początkowe są widoczne.
4. Kliknij na module analizy [np. Określanie TM G(+) 610].
5. Uaktywnij wszystkie pozycje oznaczenia, aby uzyskać ogólny przegląd [np. G(+)].
6. Kliknij tylko pozycję G(+) #RC#.
7. Dostosuj paski TM do wartości najbardziej odbiegającej w górę od wartości początkowej; uwzględnij tylko ważny zakres TM (patrz
tabela 2: Zakresy TM dla ważnych największych wartości).
Jeżeli powyżej wartości początkowej nie ma żadnej największej wartości, pasek TM musi zostać usunięty (dezaktywuj pole wyboru
w odpowiednim oknie). W procesie określania TM dla konkretnej kapilary ostatecznie pozostać muszą tylko największe wartości
z paskami TM. W niektórych przypadkach małe stężenia E. faecium (G+, CH 705, TM 51,8–55,9) i C. albicans (F, CH 640, TM 53,4–57,5)
mogą wyglądać jak ramiona największych wartości odpowiednich kontroli wewnętrznych (G+, CH 705, TM 45,5–49,6; F, CH 640, TM 44,8–
48,0). Zaznacz te ramiona paskami TM w pozycji TM 53,9 (G+, CH 705) oraz TM 55,5 (F, CH 640).
8. Uaktywnij następną pozycję [np. G(+) #NC#] wraz z G(+) #RC#, aby otrzymać ogólny przegląd. (Automatyczne skalowanie spowoduje
dostosowanie do największej wartości).
9. Aktywuj tylko wybraną pozycję [np. G(+) #NC#]. (Automatyczne skalowanie spowoduje dostosowanie do największych wartości tła
kontroli ujemnej. Wartość początkowa może nie być już widoczna).
10. Kontynuuj wykrywanie największych wartości tak, jak to opisano w punktach 5–7.
11. Po zakończeniu analizy jednego oznaczenia [np. określanie TM G(+) 610] przejdź do następnego oznaczenia tak, jak to opisano
w punktach 4–10.
Kończenie określania TM
1. Ustaw kreator badania na środku ekranu monitora i naciśnij przycisk <Finish>.
2. Raport jest tworzony automatycznie i musi zostać wydrukowany.
3. Przebieg testowy zostanie automatycznie zapisany.
4. Eksportuj plik *.ixo do folderu <C:\Export to SIS>.
5. Sprawdź, czy w raporcie występują oznaczenia, a także czy została wyświetlona informacja <run state: complete>.
6. Jeżeli są obecne oznaczenia lub inne komunikaty dotyczące stanu przebiegu, przebieg testowy jest nieważny i wszystkie próbki muszą
zostać zbadane ponownie.
Automatyczna identyfikacja największej wartości za pomocą oprogramowania SeptiFast Identification Software (SIS)
1. Kliknij dwukrotnie ikonę SIS na pulpicie, następnie naciśnij przycisk <Start>.
2. Wybierz przebieg z katalogu <C:\Export to SIS> i załaduj plik *.ixo.
3. Wybierz „Yes” lub „No”, aby określić, czy raport LightCycler® zawiera oznaczenie <User Developed or Modified Test Method>.
4. Plik *.ixo zostanie automatycznie poddany analizie, a dane będą wyświetlone w raporcie.
5. Wydrukuj raport SIS.
WYNIKI
Interpretacja wyników
Oprogramowanie SeptiFast Identification Software (SIS) może tworzyć OZNACZENIA i KOMENTARZE, takie jak RUN FLAGS, ASSAY FLAGS i
FLAGS w oknie SPECIMEN (patrz niżej). Użytkownik musi sprawdzić wydruk(i) przebiegu, aby ustalić, czy w jakimkolwiek oknie występują FLAGS
lub COMMENTS.
Rysunek 2: Okno Specimen
Specimen
SeptiFast
sample 1
Assay
Data
Result
G(+)
<CH..., TM..., PH..., CP...>
<species>
G(–)
\
F
\
Flags
Comment
Dodatkowe informacje można uzyskać w polach COMMENT dla RUN FLAGs i ASSAY FLAGs.
Wyniki próbki
Nazwy <species> w polu RESULT wskazują, że w próbce wykryto istotny mikroorganizm. Surowe dane na temat odnośnych największych
wartości przedstawiono w polu DATA; zawierają one kanał (CH), temperaturę topnienia (TM), największą wartość (PH) oraz punkt przecięcia (CP 1).
Symbol \ w polu RESULT oznacza, że nie wykryto oznaczanego składnika w zakresie zdefiniowanych kryteriów dla gatunków z listy SML.
1
WARTOŚĆ CP jest wyświetlana tylko dla kanałów G(+) 610 i 640.
Wykrywanie genu mecA
Jeśli uzyskano pozytywny wynik na obecność Staphylococcus aureus, należy rozważyć przeprowadzenie w dalszej kolejności badania
w kierunku oporności mecA. Szczegóły znajdują się w ulotce dołączonej do opakowania zestawu LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG
(P/N: 04 488 814 001).
10
Walidacja przebiegu testowego
Walidacja przebiegu testowego jest przeprowadzana przy użyciu oprogramowania SeptiFast Identification Software (SIS). Nieważne przebiegi
są wyświetlane automatycznie i oznaczane za pomocą
. Cały przebieg testowy musi zostać powtórzony.
Komentarze do oznaczeń oraz odpowiadające im interpretacje wymieniono poniżej.
Tabela 4: Oznaczenia dotyczące walidacji przebiegu testowego
Comments1
Interpretacja
ASSAY FLAG
NC: IC not detected
W NC nie wykryto ani docelowego mikroorganizmu, ani IC.
ASSAY FLAG
NC: < CH …, TM …, PH …, CP2 …>,< species > W NC wykryto gatunek.
ASSAY FLAG
NC: more amplicons detected
Dodatkowe oznaczenie, jeżeli w NC wykryto więcej niż 3 amplikony.
ASSAY FLAG
RC: No amplicon: <species>
Nie wykryto jednego lub więcej amplikonów w RC.
ASSAY FLAG
RC: more amplicons not detected
Dodatkowe oznaczenie, jeżeli w RC nie wykryto więcej niż 3
amplikonów.
SPECIMEN FLAG
IC not detected
Nie wykryto ani docelowej sekwencji, ani IC.
1
Błędy systemowe wymieniono w części „Rozwiązywanie problemów”.
2
Wartość CP jest wyświetlana tylko dla kanałów G(+) 610 i 640.
KONTROLA JAKOŚCI
Jedno powtórzenie NC i jedno każdej spośród 3 RC musi zostać włączone do każdego z 3 równoległych oznaczeń [G(+), G(–), F] w każdym
przebiegu testowym. Wartości NC i RC muszą być umieszczone w określonych pozycjach, tak jak to opisano w części „Przygotowanie reakcji PCR”.
Zaleca się poddanie wszystkim procedurom przetwarzania próbek własnego materiału dodatniego jako kontroli dodatniej (zgodnie z opisem
w części „Materiały wymagane, lecz niedostarczane”). Przy użyciu oprogramowania SIS określa się wynik kontroli wewnętrznej (IC), kontroli
ujemnej (NC) i kontroli odczynników (RC). Jeżeli kontrole nie spełniają określonych wymogów, wyniki wszystkich próbek zostaną oznaczone
w polu okna SPECIMEN. Sprawdź, czy w oknie SPECIMEN na wydruku przebiegu znajdują się oznaczenia i komentarze, aby upewnić się, że
przebieg jest ważny.
Kontrola ujemna (NC)
Wynik kontroli ujemnej (NC) musi być ujemny, a wynik jej kontroli wewnętrznej musi być dodatni. Jeżeli kontrola ujemna spełnia powyższych
kryteriów, wyniki wszystkich próbek w badaniu zostaną oznaczone. Cały przebieg testowy musi zostać powtórzony.
Kontrole odczynników (RC)
W każdej kontroli odczynników muszą zostać wykryte docelowe amplikony RC. Jeżeli jakakolwiek kontrola odczynników nie spełnia
powyższego kryterium, wyniki wszystkich próbek w badaniu zostaną oznaczone. Cały przebieg testowy musi zostać powtórzony.
Kontrola dodatnia
Wynik kontroli dodatniej musi być dodatni. Jeżeli własne materiały dodatnie lub zewnętrzne kontrole dodatnie nie spełniają tego kryterium, to
cały przebieg jest nieważny. Oprogramowanie SIS nie wyświetla żadnego oznaczenia.
Kontrola wewnętrzna (IC)
Wynik kontroli wewnętrznej musi być dodatni dla wszystkich próbek ujemnych oraz dla kontroli ujemnej. Jeżeli kontrola wewnętrzna nie
spełnia powyższego kryterium, wynik próbki zostanie oznaczony.
W przypadku nieważnych kontroli powtórz cały proces (przygotowanie próbki i kontroli, amplifikację i wykrywanie we wszystkich 3 oznaczeniach).
Jeżeli wyniki kontroli są nadal nieważne, skontaktuj się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
11
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW
Tabela 5: Błędy systemowe wyświetlane w polu COMMENTS oznaczeń RUN FLAGS oraz na wydruku SIS
Komunikat systemowy
(wyświetlany w części
wydruku SIS przeznaczonej
dla oznaczeń)
Możliwa przyczyna
Czynność naprawcza
User Developed or Modified
Test Method
Przebieg testowy jest nieważny; możliwe
przyczyny opisano w podręczniku użytkownika
urządzenia LightCycler® 2.0. Standardowe
ustawienia makropolecenia (np. wartości
początkowe, protokół przebiegu testowego itp.)
mogą być zmienione.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® i sprawdź wartości początkowe w tabeli 3.
Zapisz i ponownie wyeksportuj plik.
CCC File Name: Multiple
CCC used!
W przynajmniej jednym module analizy są
aktywne co najmniej dwa pliki kompensacji
kolorów.
Wybierz odpowiednią kompensację kolorów i ponów
obliczenia.
Color Compensation has
expired on DD-Month-YY
Obiekt kompensacji kolorów jest starszy niż sześć Utwórz nowy obiekt kompensacji kolorów.
miesięcy.
Invalid Macro
Zastosowano złe makropolecenie.
Sprawdź, czy makropolecenie w oprogramowaniu
LightCycler® i/lub SeptiFast Software Set jest
prawidłowe.
Invalid Baseline
Wartości początkowe mogły zostać przypadkowo
zmienione.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® i sprawdź wartości początkowe w tabeli 3.
Zapisz i ponownie wyeksportuj plik.
Invalid Control Tube
Przynajmniej jedna kontrola ma nieprawidłową
nazwę.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® i sprawdź poprawność nazw kontroli
w edytorze próbki. Zmień nazwy na standardowe, zapisz
i ponownie wyeksportuj.
Missing Sample Tube
Przynajmniej jedna kapilara z próbką ma
niewłaściwą nazwę lub brakuje kapilar z
próbkami.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® i sprawdź poprawność nazw próbek
w edytorze próbki. Zmień nazwy na standardowe, zapisz
i ponownie wyeksportuj.
Invalid LightCycler® SW
Version
Do procedury zastosowano nieprawidłową wersję Otwórz oprogramowanie LightCycler® i sprawdź
oprogramowania LightCycler®.
prawidłowość numeru wersji oprogramowania.
No Manual TM Calling
Nie przeprowadzono ręcznego określania TM (w
żadnej próbce i w żadnym module analizy).
Makropolecenie zostało zakończone bez analizy.
Otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® i przeprowadź ręczne określanie TM. Zapisz
i ponownie wyeksportuj.
+ additional run flags
Wykryto więcej niż 5 oznaczeń przebiegu
testowego.
Spróbuj samodzielnie rozwiązać opisane oznaczenia,
ponownie przeprowadź analizę przebiegu testowego za
pomocą SIS.
Invalid CCC File Name
W przynajmniej jednym module analizy są
aktywne co najmniej dwa pliki kompensacji
kolorów.
Wybierz odpowiedni plik kompensacji kolorów i ponów
obliczenia.
Jeśli w raporcie SIS brakuje jednej lub więcej próbek, sprawdź czy: 1) dowolna spośród trzech kapilar z próbką została nieprawidłowo
nazwana, tj. został przypadkowo usunięty pierwszy człon swoisty dla danego oznaczenia (G+, G–, F), lub 2) jedna lub więcej kapilar z próbką
zostały nieprawidłowo nazwane albo brakuje kapilar z próbką. Aby skorygować tę sytuację, otwórz oryginalny plik *.ixo w oprogramowaniu
LightCycler® i sprawdź poprawność nazw próbek w edytorze próbki. Zmień nazwy na standardowe, zapisz i ponownie wyeksportuj.
OGRANICZENIA METODY
• Test ten został zatwierdzony wyłącznie do badania ludzkiej krwi pobranej do probówki zawierającej K-EDTA (substancję
przeciwkrzepliwą). Badanie innych rodzajów próbek może dawać wyniki nieprawidłowe, fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie.
• Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od właściwego pobrania próbki, transportu, przechowywania oraz procedur obróbki.
• Niniejszy produkt powinien być używany wyłącznie przez personel specjalnie przeszkolony do pracy z testem LightCycler® SeptiFast
MG.
• Działanie testu LightCycler® SeptiFast MG zostało dowiedzione dla próbek krwi zawierających od 1000 WBC/µl do 30 000 WBC/µl.
• Aktualna taksonomia mikroorganizmów opiera się głównie na klasyfikacji fenotypowej (właściwościach biochemicznych
i fizjologicznych); może nie być identyczna z ustaleniami genetycznymi.
• W rzadkich przypadkach duże ilości docelowego DNA Streptococcus spp. w próbce mogą przynosić wynik fałszywie ujemny.
• Pomimo tego, że primery i sondy skierowane są przeciw wysoce konserwatywnym fragmentom regionu wewnętrznej wstawki
transkrybowanej (ITS – Internal Transcribed Spacer), docelowo swoista temperatura topnienia (TM) sond H może ulec
zmianie na skutek losowej zmienności sekwencji genomu poszczególnych gatunków bakterii.
12
OCENA DZIAŁANIA W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
Substancje interferujące
Następujące substancje nie wpływają na wykrywanie bakteryjnego i grzybiczego DNA za pomocą niniejszego testu.
Tabela 6: Substancje interferujące
Nr
Nazwa handlowa
Substancja czynna
Producent
1 x Cmaks.
3 x Cmaks.
Jednostka
1
Piperacillin®
piperacylina
Hexal
4,0
12,0
mg/ml
2
Fortum®
ceftazydym
GlaxoSmithKline
0,50
1,5
mg/ml
3
Zienam®
imipenem/cilastatyna
MSD Sharp & Dohme
0,27
0,67
mg/ml
4
Tazobac®
piperacylina/tazobaktam
Wyeth Pharma
0,75
2,3
mg/ml
5
Ciprobay®
ciprofloksacyna
Bayer
33,3
100,0
µg/ml
6
Vancomycin®
wankomycyna
Lilly
83,0
250,0
µg/ml
7
Refobacin®
gentamycyna
Merck
80,0
240,0
µg/ml
8
Zyvoxid®
linezolid
Pfizer
0,10
0,30
mg/ml
9
Sobelin®
klindamycyna
Pfizer
0,30
0,90
mg/ml
10
InfectoClont®
metronidazol
Infectopharm
83,3
250,0
µg/ml
11
Diflucan®
flukonazol
Pfizer
0,13
0,39
mg/ml
µg/ml
12
Cancidas®
kaspofungina
MSD Sharp & Dohme
8,3
25,0
13
Amphotericin B®
amfoterycyna B
Bristol-Myers Squibb
20,0
60,0
µg/ml
14
Novalgin®
metamizol
Aventis Pharma
0,83
2,5
mg/ml
15
Dexahexal®
deksametazon
Hexal
1,3
4,0
µg/ml
16
ARA-cell®
cytarabina
cellpharm
63,3
190,0
µg/ml
17
Arterenol®
norepinefryna (noradrenalina)
Aventis Pharma
4,8
14,4
µg/ml
18
Aquo-Trinitrosan®
nitrogliceryna
Merck
1,3
4,0
µg/ml
19
Heparin-Natrium-5000ratiopharm®
heparyna
ratiopharm
0,83
2,5
IU/ml
Czułość analityczna
Czułość analityczną testu LightCycler® SeptiFast MG oceniano za pomocą analizy odsetka trafień każdego oznaczanego składnika
w serii rozcieńczeń 100, 30 i 3 CFU/ml we krwi pobranej od zdrowych ochotników na EDTA (patrz tabela 7). Minimalną czułość
(30 CFU/ml) uzyskano dla wszystkich gatunków, z wyjątkiem Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae oraz Streptococcus mitis (100 CFU/ml).
Tabela 7: Gatunki badane za pomocą analizy odsetka trafień
Docelowy gatunek
Liczba dodatnich/liczba
badanych
Docelowy gatunek
Stężenie [CFU/ml]
1
2
100
30
3
Acinetobacter baumannii
8/8
12/12
11/20
Aspergillus fumigatus
8/8
12/12
Candida albicans
8/8
12/12
Candida glabrata
8/8
Candida krusei
Candida parapsilosis
Liczba dodatnich/liczba
badanych
Stężenie [CFU/ml]
100
30
3
Klebsiella pneumoniae
8/8
12/12
17/20
20/20
Proteus mirabilis
8/8
12/12
16/20
12/20
Pseudomonas aeruginosa
8/8
12/12
5/20
12/12
10/20
Serratia marcescens
8/8
12/12
19/20
8/8
12/12
8/20
Staphylococcus aureus
8/8
12/12
8/20
8/8
12/12
7/20
Staphylococcus epidermidis1
8/8
1/12
0/20
Candida tropicalis
8/8
12/12
9/20
Staphylococcus haemolyticus1
8/8
0/12
0/20
Enterobacter aerogenes
8/8
12/12
16/20
Stenotrophomonas maltophilia
8/8
12/12
18/20
Enterobacter cloacae
8/8
12/12
12/20
Streptococcus pneumoniae
8/8
7/12
1/20
Enterococcus faecalis
8/8
12/12
15/20
Streptococcus agalactiae2
8/8
7/12
0/20
Enterococcus faecium
8/8
12/12
17/20
Streptococcus pyogenes2
8/8
9/12
4/20
Escherichia coli
8/8
12/12
20/20
Streptococcus mitis2
8/8
9/12
0/20
Klebsiella oxytoca
8/8
12/12
14/20
Gatunki, które reprezentują grupę CoNS na liście SML w tabeli 1.
Gatunki, które reprezentują grupę Streptococcus spp. na liście SML w tabeli 1.
13
Swoistość analityczna
Reprezentatywność
Aby udowodnić jednakowość i homogenność regionu docelowego ITS, zebrano izolaty kliniczne pochodzące z kilku regionów geograficznych
Europy (południowego, centralnego, północnego), z Japonii oraz z USA. Ogółem metodami mikrobiologicznymi i przy użyciu testu
LightCycler® SeptiFast MG zbadano 1709 izolatów [patrz tabela 1: Lista główna SeptiFast (SML)]. Zbiór z USA i z Japonii nie zawiera
gatunków Aspergillus fumigatus, Candida krusei i Staphylococcus haemolyticus. W grupach Streptococcus spp. i koagulazoujemnych
Staphylococci (CoNS) dla gatunków umieszczonych w tabeli 8 uzyskano wyniki dodatnie w teście LightCycler® SeptiFast MG. Zbiór
z Japonii nie zawiera gatunków Aspergillus fumigatus i Candida krusei.
Tabela 8: Gatunki reprezentujące grupy Streptococcus spp. i koagulazoujemnych Staphylococci
(CoNS), dla których w teście LightCycler® SeptiFast MGuzyskano wyniki dodatnie
Streptococcus spp.
Koagulazoujemne Staphylococci (CoNS)
S. agalactiae
S. hominis subsp. novobiosepticus
S. anginosus
S. pasteuri
S. bovis
S. warneri
S. constellatus
S. cohnii subsp. urealyticum
S. cristatus
S. hominis subsp. hominis
S. gordonii
S. lugdunensis
S. intermedius
S. cohnii subsp. cohnii
S. milleri
S. capitis subsp. ureolyticus
S. mitis
S. capitis subsp. capitis
S. mutans
S. caprae
S. oralis
S. saprophyticus
S. parasanguinis
S. saprophyticus subsp. saprophyticus
S. pneumoniae
S. xylosus
S. pyogenes
S. epidermidis
S. salivarius
S. haemolyticus
S. sanguinis
S. thermophilus
S. vestibularis
S. viridans
Wyniki rozbieżne otrzymano w mniej niż 1,2% wszystkich wyników.
•
•
•
•
6 spośród 143 szczepów Enterobacter (aerogenes/cloacae) miało identyczny region ITS jak Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) i zostało
zidentyfikowanych jako Klebsiella (pneumoniae/oxytoca).
Citrobacter freundii i Salmonella enterica mogą mieć identyczne regiony ITS jak, odpowiednio, Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) i
E. coli; z tego powodu będą wykrywane jako, odpowiednio, Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) i E. coli.
14 spośród 160 szczepów Streptococcus viridans miało identyczny region ITS jak Streptococcus pneumoniae; z tego powodu będą
wykrywane jako S. pneumoniae.
W rzadkich przypadkach Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) może nie zostać wykryta, jeśli mutacja w sekwencji docelowej spowoduje
zmianę temperatury topnienia.
14
Wyłączność diagnostyczna
Tabela 9: Gatunki, które miały ujemny wynik w każdym z oznaczeń
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Corynebacterium jeikeium
Aeromonas hydrophila
Cryptococcus neoformans
Mycoplasma pneumoniae
Neisseria meningitidis
Bacillus cereus
Gemella haemolysans
Pantoea agglomerans
Bacteroides fragilis
Haemophilus influenzae
Peptostreptococcus magnus
Bartonella henselae
Histoplasma capsulatum
Porphyromonas gingivalis
Bordetella pertussis
Legionella pneumophila
Prevotella denticola
Borrelia burgdorferi
Listeria monocytogenes
Propionibacterium acnes
Burkholderia cepacia
Moraxella (Branhamella) catarrhalis
Proteus vulgaris
Campylobacter jejuni
Morganella morganii
Yersinia enterocolitica
Cardiobacterium hominis
Mycobacterium fortuitum
Clostridium perfringens
Mycobacterium tuberculosis
INFORMACJA DLA NABYWCY
Zakup niniejszego produktu umożliwia nabywcy używanie go do amplifikacji i detekcji sekwencji kwasu nukleinowego w celach diagnostyki
in vitro próbek pochodzących od ludzi. Wraz z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje żadnego patentu ogólnego lub innej
licencji poza prawem do określonego, szczególnego zastosowania produktu.
PIŚMIENNICTWO
1. Kollef M, et al. Inadequate antimicrobial treatment of infections, Chest 1999, 115: 462-474.
2. Garnacho-Montero J, et al. Impact of inadequate empirical antibiotic therapy on the outcome of patients admitted to the ICU with
Sepsis, Crit Care Med. 2003, 31(12): 2742-51.
3. Byl B, et al. Impact of Infectious Disease Specialists and Microbiological Data on the Appropriateness of Antimicrobial Therapy for
Bacteremia, Clin Infect Dis 1999: 29: 60-66.
4. Suttorp N. “Changing populations and future trends in the management of serious infections” from: AIM website (www.infectionacademy.org).
5. Peterson LR, et al. Towards targeted prescribing: will the cure for antimicrobial resistance be specific, directed therapy through
improved diagnostic testing?, J Antimicrob Chemother 2004, 53: 902-5.
6. Harbarth S, et al. Inappropriate initial antimicrobial therapy and its effect on survival in a clinical trial of immunomodulating therapy for
severe sepsis, Am J Med. 2003, 115: 529-535.
7. Houang, E.T.S., et al. Significance of Genomic DNA Group Delineation in Comparative Studies of Antimicrobial Susceptibility of
Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother, Apr. 2003, p. 1472-1475.
8. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number
(CDC) 93-8395.
9. Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids
and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997.
10. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
15
"
Distributed by
Wyprodukowano w Niemczech dla:
Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
Roche Diagnostics
Indianapolis, IN 46256 USA
(For Technical Assistance call the
Roche Response Center
toll-free: 1-800 526 1247)
Roche Diagnostics
H7V 4A2 Laval, Quebec
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
CH-6343 Rotkreuz
Roche Diagnostics
F-38240 Meylan
Roche Diagnostics GmbH
D-68298 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics SpA
Piazza Durante 11
I-20131 Milano
Roche Diagnostics S.L.
E-08006 Barcelona
Distribuidor em Portugal:
Roche Farmacêutica Química, Lda
P-2700 Amadora
C
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy, +49 621 7590
ROCHE, LIGHTCYCLER, MGRADE, MAGNALYSER, FASTSTART, HYBPROBE, SEPTIFAST i AMPERASE są znakami towarowymi firmy
Roche.
ROCHE RESPONSE CENTER jest znakiem serwisowym firmy Roche.
Amphotericin B® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Bristol-Myers Squibb Company.
Aquo-Trinitrosan® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Merck & Co., Inc.
ARA-cell® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy cell pharma GmbH.
Arterenol® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Aventis Pharma Ltd.
Cancidas® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy MSD Sharp & Dohme GmbH.
Ciprobay® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Bayer AG.
Dexahexal® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Hexal AG.
Diflucan® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Pfizer Inc.
Fortum® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy GlaxoSmithKline.
Heparin-Natrium-5000-ratiopharm® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy ratiopharm International.
InfectoClont® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Infectopharm GmbH.
LTK-008™ jest znakiem towarowym firmy biodelta, ZTB GmbH.
MiniSpin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Eppendorf.
Novalgin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Aventis Pharma Ltd.
Piperacillin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Hexal AG.
Refobacin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Merck & Co., Inc.
Sobelin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Pfizer Inc.
Tazobac® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Wyeth Pharmaceuticals AG.
Vancomycin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Lilly Pharma Holding GmbH.
Zienam® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy MSD Sharp & Dohme GmbH.
Zyvoxid® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Pfizer Inc.
© 2007, Roche Molecular Systems, Inc. Wszystkie prawa zastrzeżone.
2/2007
(04623886001-02ENGL)
04822625001-02
16