Cel dwiczenia: optymalizacja warunków transformacji E. coli za

Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
Uzyskiwanie transgenicznych bakterii: transformacja E. coli metodą elektroporacji.
Cel dwiczenia: optymalizacja warunków transformacji E. coli za pomocą elektroporacji
Materiał: elektrokompetentne komórki E. coli (szczep DH5α) przechowywane w postaci
stocków glicerolowych.
Wykonanie dwiczenia:
1. Zawiesinę elektrokompetentnych komórek rozmrozid na lodzie. Umieścid w lodzie kuwetę
do elektroporacji (szczelina grubości 1 mm) w celu jej schłodzenia.
2. Przenieśd 40 μl zawiesiny bakterii do kuwety elektroporacyjnej tak, aby cała zawiesina
znajdowała się na dnie kuwety. Unikad tworzenia pęcherzyków powietrza. Trzymad w lodzie.
3. Dodad 100 ng plazmidowego DNA.
4. Ustawid parametry elektroporacji wg poniższej tabeli:
grupa 1
0.9 kV
grupa 2
1.1 kV
napięcie
[kV]
Warunki wspólne (dla wszystkich grup):
Mode: 2.5kV/RESISTANCE High Voltage
Resistance: R5 (129 ohm)
grupa 3
1.3 kV
grupa 4
1.6 kV
grupa 5
1.7 kV
grupa 6
Kontrola
(-)
5. Wytrzed kuwetę elektroporacyjną do sucha (!!!), umieścid w komorze elektroporatora i
zabezpieczyd przez dokręcenie.
6. Przyłożyd impuls (przycisk PULSE).
7. Niezwłocznie dodad 1 ml pożywki LB (bez ampicyliny!) ogrzanej do temp. 37° C.
8. Przenieśd bakterie do probówek 1.5 lub 2.0 ml.
9. Inkubowad w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez 1 godz.
10. Dla kontroli doświadczenia należy użyd jednej porcji (40 μl) bakterii
elektrokompetentnych bez podawania impulsu elektrycznego. Postępowad identycznie jak
z bakteriami poddawanymi elektroporacji
11. Wysiad bakterie na płytki z zestaloną pożywką LB z dodatkiem czynnika selekcyjnego
(ampicyliny) – do posiewu pobrad po 1 i/lub 10 μl hodowli rozcieoczonej 1:100 i natychmiast
rozprowadzid równomiernie po całej płytce Petriego za pomocą głaszczki.
12. Szalki inkubowad w cieplarce 37° C przez 24 h do uzyskania wzrostu transformantów.
Wyniki:
Określid ilośd kolonii uzyskanych przy danych warunkach napięcia. Wyznaczyd warunki
optymalne elektroporacji.
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………..
1
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
Protokół przygotowania komórek elektrokompetentnych:
1. Przygotowad 1 litr hodowli E. coli na podłożu LB (inkubowad z wytrząsaniem przez noc do
OD600=0,5-1,0, co odpowiada ~1010 komórek/ml).
2. Schłodzid hodowlę w lodzie. Zwirowad (4000 g, 15’, 4°C), osad komórek rozbid i zawiesid w
1 objętości (1 litr) zimnej sterylnej wody.
3. Ponownie zwirowad hodowlę i zawiesid w 0,5 objętości zimnej wody. Powtórzyd płukanie.
4. Zwirowad hodowlę i zawiesid w 0,02 objętości zimnej wody.
5. Zwirowad hodowlę i zawiesid w 0,002-0,003 objętości zimnej wody z dodatkiem 10%
glicerolu. Rozporcjowad zawiesinę po 40 μl do jałowych probówek i przechowywad w temp. 80°C.
2