Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains/APC, Rabbit F(ab
Transkrypt
Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains/APC, Rabbit F(ab
Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains/APC, Rabbit F(ab’)2 Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains/FITC, Rabbit F(ab’)2 Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains/RPE, Rabbit F(ab’)2 Przeznaczenie Nr kat. C0222 Nr kat. F0434 Nr kat. R0436 Do stosowania w diagnostyce in vitro. Odczynniki C0222, F0434 i R0436 są przeznaczone do stosowania w cytometrii przepływowej. W cytometrii przepływowej przeciwciała skierowane przeciwko lekkim łańcuchom kappa mogą być wykorzystane do wykazania obecności takich łańcuchów na powierzchni komórek, a tym samym mogą posłuŜyć — wraz z panelem innych przeciwciał (1–4) — do identyfikacji monoklonalności (ekspansji klonalnej) w zaburzeniach proliferacji limfocytów B. Interpretacji wyniku — z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz wyników innych metod diagnostycznych — powinien dokonać wykwalifikowany patolog. Wprowadzenie Na powierzchni większości komórek B, z wyjątkiem prekursorów komórek B oraz progenitorów prekursorów komórek B, a takŜe dojrzałych komórek plazmatycznych, obserwuje się ekspresję immunoglobulin. W kaŜdej komórce ekspresję wykazują łańcuchy lekkie tylko jednego typu. Prawidłowa krew obwodowa i węzły chłonne zawierają zarówno komórki kappa-dodatnie, jak i lambda-dodatnie, przy czym w dwóch trzecich komórek obserwuje się ekspresję łańcuchów kappa, a w jednej trzeciej — lambda (5). PoniewaŜ nowotwory limfoidalne są zazwyczaj wynikiem ekspansji klonalnej jednej komórki, we wszystkich komórkach złośliwych ma miejsce ekspresja tego samego izotypu łańcucha. Sygnałem pozwalającym podejrzewać zaburzenia proliferacji limfocytów B o charakterze nowotworowym jest często wyraźna dominacja komórek, w których zachodzi ekspresja pojedynczego typu łańcuchów (4). Opisano rzadkie przypadki chłoniaków nieziarniczych kappaujemnych lub lambda-ujemnych (4,6). Dostarczany odczynnik Koniugaty przeciwciał przeciwko łańcuchom lekkim kappa, C0222, F0434 i R0436, zostały sporządzone z wyizolowanych ze względu na powinowactwo fragmentów F(ab')2 poliklonalnych przeciwciał króliczych. Koniugaty dostarczane są w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy surowicy wołowej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. NaleŜy uŜyć 10 µl produktu, aby zabarwić do 106 leukocytów z normalnej ludzkiej krwi obwodowej. StęŜenie koniugatu g/L: patrz etykieta na fiolce. Przygotowanie Nr kat. przeciwciała Fluorochrom Odczynnik Ig nr kat. C0222 APC (allofikocyjanina) X0998 F0434 FITC (izomer 1 izotiocyjanianu fluoresceiny) X0929 R0436 RPE (R-fikoerytryna) X0930 1. Przeciwciała uŜywane do koniugacji z APC, FITC i RPE były poddawane absorpcji w fazie stałej z białkami osocza ludzkiego w celu usunięcia śladów zanieczyszczeń przeciwciałami. 2. Absorbowane przeciwciała były następnie oczyszczane metodą chromatografii powinowactwa w kolumnie z immobilizowanymi ludzkimi lekkimi łańcuchami kappa. 3. Przeciwciała izolowane ze względu na powinowactwo były rozkładane przez pepsynę, po czym izolowano fragment F(ab')2 metodą filtracji Ŝelowej. 4. Na koniec fragment F(ab')2 skoniugowano z allofikocyjaniną, izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny lub R-fikoerytryną. Immunogen Poliklonalne immunoglobulinowe łańcuchy lekkie typu kappa izolowane z puli prawidłowej ludzkiej surowicy. Swoistość Przeciwciała przeciwko łańcuchom lekkim kappa reagują z niezwiązanymi łańcuchami kappa oraz z łańcuchami kappa w nienaruszonych cząsteczkach immunoglobulin. PoniŜej opisano ustaloną swoistość przeciwciał. Aby uzyskać maksymalną czułość, przed oczyszczaniem ze względu na powinowactwo i rozkład pepsyną przeprowadzono test swoistości metodą immunoelektroforezy krzyŜowej. Immunoelektroforeza krzyŜowa: W teście przeciwciała z ludzkim osoczem pojawiają się wyłącznie osady związane z łańcuchami kappa. Barwnik: Coomassie Brilliant Blue. Cytometria przepływowa: Gdy przeciwciała przeciwko lekkim łańcuchom kappa stosowane są do lizatu pełnej krwi ludzkiej zgodnie z procedurą wykonania odczynu razem z przeciwciałami Anti-CD19/RPE, HD37 lub Anti-CD19/FITC, HD37, widoczny jest odczyn swoisty części limfocytów B CD19-dodatnich odpowiadającej oczekiwanemu poziomowi ekspresji lekkich łańcuchów kappa. Przeprowadzona metodą cytometrii przepływowej analiza zawiesiny pojedynczych komórek z utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie próbek tkankowych wykazała, Ŝe przeciwciała przeciwko lekkim łańcuchom kappa znakują reaktywne rozrostowe węzły chłonne (10/10 przypadków). W chłoniakach nieziarniczych przeciwciała znakowały 4/10 przypadków (5). W pozostałych przypadkach uzyskano wynik dodatni testu na obecność łańcuchów lekkich lambda (5/10 przypadków) lub nie stwierdzono ekspresji łańcuchów lekkich (1/10 przypadków) (4). Przeprowadzona metodą cytometrii przepływowej analiza limfocytów z krwi obwodowej wykazała, Ŝe przeciwciała przeciwko łańcuchom kappa znakują proporcjonalną ilość komórek w białaczkach limfocytowych z limfocytów B. W jednym badaniu obejmującym 121 przypadków (2) w 37 przypadkach uzyskano wynik dodatni testu ekspresji łańcuchów kappa. W innym badaniu, obejmującym 165 przypadków (3), w 97 przypadkach uzyskano wynik kappadodatni. Środki ostroŜności (112023-006) 1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. C0222/F0434/R0436/PL/LHP/2013.02 s. 1/3 Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. 3 Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować odpowiednie procedury postępowania. 4.W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne. 5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami. Przechowywanie Przechowywać w ciemności w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na opakowaniu. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na wkładce informacyjnej do opakowania, UŜytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W trakcie przechowywania niekiedy moŜe wytrącić się niewielka ilość osadu, powodując drobnoziarnisty odczyn nieswoisty. Proste odfiltrowanie koniugatu (filtr 0,22 µm z octanu celulozy) przywróci jego pierwotną wysoką jakość. Koniugatów nie naleŜy przechowywać w postaci rozcieńczonej. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z naszym działem wsparcia technicznego. Uwaga dotycząca procedury Przed wykonaniem odczynu na próbkach krwi obwodowej naleŜy poprzez odwirowanie wyizolować komórki jednojądrowe na medium separującym lub przepłukać próbkę krwi w celu usunięcia rozpuszczalnych białek surowicy. PoniewaŜ ludzkie monocyty wiąŜą immunoglobuliny surowicy za pośrednictwem ich receptorów powierzchniowych Fc, komórki takie naleŜy usunąć lub zidentyfikować. Wykonanie odczynu 1. Pobrać krew Ŝylną do probówki zawierającej środek przeciwkrzepliwy. 2. Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwkrzepliwego do probówki. 3. Dodać 2 mL buforu PBS 0,01 mol/L, pH 7,4. Delikatnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym. 4. Odwirować przez 5 minut przy 300 x g, następnie odciągnąć supernatant, pozostawiając około 50 µL cieczy. 5. Powtórzyć etapy 3 i 4 jeszcze dwukrotnie. 6. Dodać 10 µL frakcji immunoglobulin króliczych (nr kat. X0903) w charakterze odczynnika blokującego. Wymieszać delikatnie mieszadłem wibracyjnym i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 °C. 7. Dodać 10 µL przeciwciał przeciwko lekkim łańcuchom kappa skoniugowanych z fluorochromem. Delikatnie wymieszać. 8. W charakterze kontroli ujemnej uŜyć niereaktywnych fragmentów F(ab’)2 immunoglobulin króliczych, skoniugowanych z tym samym fluorochromem (patrz tabela). 9. Inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 °C. 10. Dodać do probówki 1–2 mL odczynnika powodującego lizę erytrocytów i delikatnie wymieszać. Przestrzegać czasu i temperatury inkubacji zalecanych przez producenta odczynnika. 11. Odwirować próbkę przy 300 x g przez 5 minut. 12. Zaaspirować supernatant, pozostawiając około 50 µL płynu. 13. Dodać 2 mL buforu PBS 0,01 mol/L, pH 7,4. Delikatnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym. 14. Powtórzyć etapy 11 i 12. 15. Zawiesić osad w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL 1-procentowego roztworu paraformaldehydu (środka utrwalającego) w buforze PBS 0,01 mol/L, pH 7,4. 16. Poddać analizie w cytometrze przepływowym. Zaleca się dołączenie do kaŜdego pomiaru odpowiednich dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych w celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek. NaleŜy pamiętać, Ŝe koniugaty fluorochromowe są wraŜliwe na światło, w związku z czym w trakcie wykonywania odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem. Piśmiennictwo 1. Johnson A, Olofsson T. Flow cytometric clonal excess analysis of peripheral blood, routine handling, and pitfalls in interpretation. Cytometry 1993;14:188-95. 2. Cartron G, Linassier C, Bremond JL, Desablens B, Georget MT, Fimbel B, et al. CD5 negative B-cell chronic lymphocytic leukemia: clinical and biological features of 42 cases. Leuk Lymphoma 1998;31:20916. 3. Gandini D, Lanza F, Latorraca A, Levato F, Del Senno L, Castoldi G. Immunophenotypic and genotypic characterization of B-cell chronic lymphocytic leukemia patients from Northern Italy. Haematologica 1993;78:18-24. 4. Leers MPG, Theunissen PHMH, Ramaekers FCS, Schutte B, Nap M. Clonality assessment of lymphoproliferative disorders by multiparameter flow cytometry of paraffin-embedded tissue: an additional diagnostic tool in surgical pathology. Hum Pathol 2000;31:422-7. 5. Deegan MJ. B lymphocytes and plasma cells: their development and identification. In: Keren DF, editor. Flow cytometry in clinical diagnosis. Chicago: ASCP Press; 1989. p. 139-63. 6. Kaleem Z, Zehnbauer BA, White G, Zutter MM. Lack of expression of surface immunoglobulin light chains in B-cell non-Hodgkin lymphomas. Am J Clin Pathol 2000;113:399-405. (112023-006) C0222/F0434/R0436/PL/LHP/2013.02 s. 2/3 Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 Objaśnienia symboli (112023-006) Numer katalogowy Temperatura przechowywania ZuŜyć przed Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Chronić przed słońcem (patrz sekcja nt. przechowywania) Producent Sprawdzić w instrukcji stosowania Numer serii C0222/F0434/R0436/PL/LHP/2013.02 s. 3/3 Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17