Wizualizacja i analiza procesow biologicznych

Wizualizacja i analiza procesów
biologicznych z wykorzystaniem
automatycznego mikroskopu
fluorescencyjnego LEICA DMI
6000B
PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI
(BT 206, BT 231)
Wizualizacja i analiza procesów...
BT 206, BT 231
Wizualizacja i analiza procesów biologicznych z wykorzystaniem automatycznego
mikroskopu fluorescencyjnego LEICA DMI 6000B
Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia (ang. Total Internal
Reflection Fluorescence Microscope) jest jedną z odmian mikroskopii fluorescencyjnej
pozwalającą na obrazowanie próbek tylko do określonej głębokości, zwykle do 200-250 nm w
głąb. Zasada TIRFM polega na oświetleniu próbki światłem wzbudzającym, jednak pod takim
kątem (kąt graniczny), by padające światło uległo całkowitemu wewnętrznemu odbiciu przed
wejściem do próbki, albo w szkiełku nakrywającym próbkę (typ epi-) albo w kwarcowym
pryzmacie (typ trans-).
Rys. 1. Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia
http://microscopy.duke.edu/introtomicroscopy/tirf.html
Zjawisku całkowitego wewnętrznego odbicia towarzyszy powstanie fali zanikającej (wiąże
się to z różnicą między współczynnikiem załamania światła szkła, czy kwarcu i wody, czyli
próbki – współczynnik ten dla szkła (kwarcu) jest większy), która nie ulega odbiciu, ale
penetruje środowisko (próbkę) po drugiej stronie szkiełka lub pryzmatu. Czyni to jednak tylko
na pewną określoną głębokość (fala ta zanika wykładniczo wraz z odległością), co w praktyce
oznacza zwykle około 100-250 nm. W tym obszarze głębokości próbki, fala ta może wzbudzić
obecne w próbce fluorofory, a one zaczną emitować światło (co ważne, fala zanikająca ma tę
samą długość co fala która uległa odbiciu). To emitowane światło jest następnie odbierane
przez obiektyw, przepuszczane przez odpowiednie filtry i przetwarzane jak w klasycznym
mikroskopie fluorescencyjnym. W ten sposób w TIRFM następuje bardzo selektywna
wizualizacja obszarów położonych zaraz pod szkiełkiem lub pryzmatem, ponieważ obszar
wzbudzenia powstaje tylko w zasięgu fali zanikającej, co znacznie ogranicza wpływ tła
(wnętrza komórki), zwiększając rozdzielczość uzyskanych obrazów.
2
BT 206, BT 231
Wizualizacja i analiza procesów...
BT 206, BT 231
Cel doświadczenia:
Celem ćwiczenia jest praktyczne zapoznanie się z metodą całkowitego odbicia
wewnętrznego fluorescencji (TIRF) oraz wykorzystanie jej w wizualizacji białek
cytoszkieletu komórek.
Ustawienie mikroskopu LEICA DMI 6000B do pracy:
1. Włączyć laser oraz kamerę Hamamatsu.
2. Włączyć sterownik mocy lasera (Lasos). W tym celu przełącznik ustawić w pozycji
„laser run” natomiast pokrętło regulacji mocy lasera w pozycji minimalnej.
3. Włączyć mikroskop oraz lampę fluorescencyjną i poczekać, aż stolik mikroskopowy
zinicjalizuje się.
4. Włączyć komputer oraz uruchomić program „Las AF”:
a) Kliknąć OK
b) Kliknąć NO
5. W zakładce Experiment utworzyć nowy eksperyment klikając NEW.
6. W zakładce Setup ustawić obiektyw HCX PL APO 40x 1,25 OIL.
7. Ustawić kanały (aby dodać nowy kanał kliknąć ikonę „+” poniżej FCr):
a) w świetle przechodzącym, z różnicowym kontrastem Nomarskiego (DIC) klikając
w oknie Contrast Method TL-DIC, a następnie przyporządkować mu maskę
szarą klikając na ikonę palety z pędzlem i wybierając kolor Grey
b) fluorescencyjny TRITC (wzbudzenie światło zielone, emisja swiatło czerwone) w oknie Contrast Method wybrać FLUO, ustawić w oknie Filter Cube N21, a
następnie przyporządkować mu maskę czerwoną
c) fluorescencyjny Alexa 488 (wzbudzenie światło niebieskie, emisja światło
zielone), w oknie Contrast Method wybrać FLUO, ustawić w oknie Filter Cube
L5, przyporządkować mu maskę zieloną
8. Na preparat nanieść kroplę olejku immersyjnego i umieścić na
mikroskopowym szkiełkiem nakrywkowym do dołu.
9. Ustawić ostry obraz preparatu za pomocą joystica.
10. W zakładce Setup zmieniamy obiektyw na HCX PL APO 100x 1,47 OIL.
11. Ustawiamy ostry obraz preparatu za pomocą joystica.
12. Dodac kolejny kanał klikając „+”:
stoliku
a) Kanał TIRF, w oknie Contrast Method wybrać TIRF, przyporządkowac mu
maskę zieloną
13. Następnie należy wycentrować wiązkę lasera:
a) W zakładce Acquisition rozwinąć panel TIRF oraz kliknąć Autoalign
UWAGA!!!
Sprawdzić czy wszystkie okna czarnego obudowania mikroskopu
są zamknięte!!! Nie wolno patrzeć w wiązkę światła lasera!!!
3
BT 206, BT 231
Wizualizacja i analiza procesów...
BT 206, BT 231
b) Postępować zgodnie z wyświetloną w lewym oknie instrukcją
c) Po zakończeniu Autoalign zamknąć okno
14. W tym momencie mikroskop przygotowany jest do pracy w trybie Fluo i TIRF.
Wykonanie ćwiczenia:
1. Oglądnąć otrzymany preparat w świetle przechodzącym oraz fluorescencji:
a) wybrać odpowiedni kanał
b) włączyć podgląd obrazu na monitorze (ikona LIVE)
c) w zakładce Acquisition, panelu Image wybrać odpowiednią intensywność
fluorescencji (suwak Intensity) oraz czas ekspozycji (suwak Exposure)
d) wykonać zdjęcie naciskając Single Image
2. W zakładce Experiment zaznaczyć wszystkie trzy zdjęcia (trzymając Ctr), kliknąć
prawy przycisk myszy i wybrać Overlay.
3. Włączyć kanał TIRF a następnie podgląd obrazu na monitorze (ikona LIVE).
4. Oglądnąć wybarwione struktury w zależności od głębokości badanego preparatu oraz
kierunku padania wiązki lasera:
a) W zakładce Acquisition panelu TIRF wybierać różną głębokość próbki (70 – 250
nm)
b) Za pomocą ikon ze strzałkami wybrać kierunek padania wiązki lasera
5. Wykonać zdjęcia w kanałach przechodzącym, fluorescencyjnym oraz TIRF.
6. Nałożyć i porównać otrzymane obrazy.
Po zakończonej pracy wyczyścić obiektywy z olejku immersyjnego!!!
Zagadnienia:
− Mikroskopia fluorescencyjna
− TIRF
− Podstawowe pojęcia z fizyki optycznej (odbicie i załamanie światła, całkowite,
wewnętrzne odbicie światła)
Zalecana literatura:
− http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/tirf/tirfintro.html
4
BT 206, BT 231