Ćwiczenie 4

Ćwiczenie 4
CHARAKTERYSTYKI SPEKTRALNE
UTLENIONEJ I ZREDUKOWANEJ FORMY CYTOCHROMU C
REAKTYWNE FORMY TLENU
DEGRADACJA NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH
TWORZENIE ANIONORODNIKA PONADTLENKOWEGO W REAKCJI KATALIZOWANEJ PRZEZ
OKSYDAZĘ KSANTYNOWĄ ORAZ JEGO WYKRYWANIE I USUWANIE
1
ZMIANY WIDMOWE CYTOCHROMU c
Kwas askorbinowy może redukować cyt c (Fe+3), czemu towarzyszą zmiany spektralne. W widmie zredukowanego
cytochromu c pojawiają się dwa dodatkowe szczyty absorpcji przy 520 nm i 550 nm (ryc. 1). Nie obserwuje się
natomiast w obecności tlenu ponownego, spontanicznego utleniania cytochromu c. Może to nastąpić tylko
w obecności oksydazy cytochromowej lub w obecności sztucznego akceptora elektronów, takiego jak K 3[Fe(CN)6],
pod wpływem którego zanika absorpcja przy 520 nm i 550 nm w widmie cytochromu c.
Ryc. 1. Widma absorpcyjne cytochromu c
REDUKCJA I UTLENIANIE CYTOCHROMU C
Kwas askorbinowy może redukować cytochrom c (Fe3+) do cytochromu c (Fe2+) ze względu na wartość
standardowego potencjału redoks. Natomiast heksacyjanożelazian (III) potasu posiada możliwość utlenienia
cytochromu c.
Wykonanie
Do probówki. odmierzyć 1 ml 40 mg % roztworu cytochromu c i 1 ml 0,1 M buforu fosforanowego pH 7,0.
Zmierzyć absorbancję w zakresie od 450 do 600 nm. Dodać 0,1 ml 10 mM roztworu kwasu askorbinowego i po
10 min ponownie zmierzyć absorbancję w powyższym zakresie długości fal. Następnie dodać 0,1 ml 50 mM
roztworu K3[Fe(CN)6] i po 5 minutach ponownie dokonać pomiaru widma absorpcyjnego w powyższym zakresie
fal (450-600 nm).
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Na podstawie widm absorpcyjnych wyznacz maksimum absorbancji formy utlenionej i zredukowanej
cytochromu c. Napisz reakcję cytochromu c z askorbinianem i jonami [Fe(CN)6]3-.
2
REAKTYWNE FORMY TLENU
WPROWADZENIE
W biologicznych reakcjach utleniania-redukcji, które przebiegają z udziałem flawoprotein, jako produkt uboczny
jednoelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego, może powstać anionorodnik ponadtlenkowy (O2ˉ˙). Nukleotyd
flawinowy może podczas tych reakcji, przyjmować jeden elektron (rodnik semichinonowy) lub dwa elektrony
(forma zredukowana nukleotydu flawinowego):
H
Zredukowana flawina, w kolejnej reakcji utleniania-redukcji jest zdolna do przekazania, odpowiedniej cząsteczce
akceptora, jednego bądź dwu elektronów. Jeżeli akceptorem tym jest tlen cząsteczkowy, to w wyniku
jednoelektronowej reakcji powstaje anionorodnik ponadtlenkowy:
 O2
O2  e
Natomiast dwuelektronowa redukcja tlenu prowadzi do powstania nadtlenku wodoru:
O 2  2e  2H 
 H 2O2
Zarówno anionorodnik ponadtlenkowy, jak i nadtlenek wodoru ulegają reakcjom dysproporcjonowania
(dysmutacji):
O 2  O 2  2H 
 H2O2  O2
H 2O2  H 2O2
 2H 2 O  O 2 .
Reakcja dysmutacji nadtlenku wodoru katalizowana jest przez katalazę. Ten zawierający układ hemowy
enzym katalizuje reakcję usuwania nadtlenku wodoru powstającego podczas utleniania zredukowanych
flawoprotein. Występuje on w niemal we wszystkich tkankach zwierzęcych – przede wszystkim
w wątrobie, erytrocytach i nerkach.
3
DEGRADACJA NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH
Końcowym produktem degradacji nukleotydów purynowych w organizmach ssaków jest kwas moczowy.
Jednym z enzymów prowadzących do jego powstania jest oksydaza ksantynowa [EC 1.2.3.2]. Enzym ten katalizuje
reakcję utleniania hipoksantyny do ksantyny, a następnie kwasu moczowego. Występuje w wątrobie i śluzówce
jelita. W cząsteczce oksydazy ksantynowej, poza dwiema cząsteczkami FAD, znajdują się dwa jony molibdenu
(VI) i osiem jonów żelaza tworzących centra żelazo-siarkowe. W trakcie reakcji katalizowanej przez ten enzym
funkcjonuje łańcuch transportu elektronów z utlenianego substratu na tlen:
Końcowym produktem redukcji tlenu jest przede wszystkim nadtlenek wodoru. Stąd zasadniczy przebieg reakcji
katalizowanej przez oksydazę ksantynową zapisuje się w formie:
Jednak kilka procent tlenu ulega redukcji jednoelektronowej. Powstaje wtedy, jako produkt uboczny, anionorodnik
ponadtlenkowy: EnzFADH 2  O2
 EnzFADH   O2  H  .
Niedobór molibdenu w diecie może doprowadzić do obniżenia aktywności oksydazy ksantynowej
w wątrobie. Częściej jednak opisywane są schorzenia wynikające z nadmiernej syntezy kwasu moczowego lub
upośledzenia wydalania tego związku. Stężenie kwasu moczowego w osoczu krwi kobiet wynosi 150-360 moli/l,
w osoczu krwi mężczyzn 200-480 moli/l. Nadmierne wytwarzanie kwasu moczowego w wątrobie może
powodować chorobę atakującą stawy i nerki, zwaną skazą lub dną moczanową, albo podagrą. W tym schorzeniu
stężenie moczanu w osoczu i moczu wzrasta. Kryształy soli moczanowych osadzają się w stawach i nerkach.
W leczeniu dny moczanowej, dla zahamowania aktywności oksydazy ksantynowej, stosuje się analog hipoksantyny
– allopurynol. Jest on substratem reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową, lecz produkt jego utlenienia,
alloksantyna, wiąże się bardzo silnie z centrum katalitycznym enzymu, hamując jego aktywność. Jest to przykład
„samobójczego" działania produktu katalizowanej przez hamowany enzym reakcji.
4
EKSPERYMENTALNE TWORZENIE, WYKRYWANIE I USUWANIE
ANIONORODNIKA PONADTLENKOWEGO
Tworzenie anionorodnika ponadtlenkowego
W przedstawionym poniżej modelu doświadczalnym anionorodnik ponadtlenkowy powstaje w trakcie utlenienia
ksantyny tlenem cząsteczkowym, w reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową. Reakcja ta hamowana jest
przez allopurynol.
Wykrywanie anionorodnika ponadtlenkowego
Obecność i stężenie anionorodnika ponadtlenkowego w roztworze można określić na podstawie ilości
zredukowanej formy cytochromu c (FeII), która powstaje w reakcji:
O2  cytochromc (FeIII)  O 2  cytochrom c (FeII)
Redukcji cytochromu c towarzyszą zmiany widma absorpcyjnego w zakresie 500-560 nm. Postać zredukowana
cytochromu c charakteryzuje się silną absorbancją przy długości fali 550 nm. Natomiast, stężenie formy
zredukowanej cytochromu c zależy od stężenia anionorodnika ponadtlenkowego, który jest dawcą elektronów
w przedstawionej powyżej reakcji. Dlatego, pośrednio, na podstawie pomiaru absorbancji w 550 nm, można
określić stężenie anionorodnika ponadtlenkowego w roztworze.
Jednym z produktów reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową jest nadtlenek wodoru. Powstaje on
również jako produkt spontanicznie przebiegającej reakcji dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego. W naszym
modelu doświadczalnym akceptorem elektronów przekazywanych przez anionorodnik ponadtlenkowy powinien
być cytochrom c. Jednak, zredukowana forma cytochromu c utlenia się w następnej reakcji, redukując nadtlenek
wodoru. W ten sposób, w miarę postępu reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową następuje reoksydacja
cytochromu c i zmniejsza się absorbancja przy 550 nm.
Aby zapobiec utlenianu cytochromu c, do układu wytwarzającego anionorodnik ponadtlenkowy wprowadzamy
katalazę, która usuwa nadtlenek wodoru z mieszaniny reakcyjnej. Wówczas, cytochrom c jest końcowym
akceptorem elektronów przekazywanych z anionorodnika ponadtlenkowego i na podstawie pomiaru stężenia
zredukowanej formy cytochromu c można określić zawartość anionorodnika ponadtlenkowego w badanym
roztworze.
Usuwanie anionorodnika ponadtlenkowego
Anionorodnik ponadtlenkowy w badanym układzie modelowym, usuwany jest w reakcji dysmutacji
katalizowanej przez dysmutazę ponadtlenkową.
5
PODSUMOWANIE
W przeprowadzanych doświadczeniach student obserwuje przebieg następujących reakcji:
I.

Powstawanie anionorodnika ponadtlenkowego ( O 2 ) jako produktu ubocznego reakcji katalizowanej przez
oksydazę ksantynową:
II.
Hamowanie „samobójcze" oksydazy ksantynowej przez allopurynol:
III.
Reakcja dysmutacji nadtlenku wodoru katalizowana przez katalazę:
IV.
Reakcja dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego katalizowana przez dysmutazę ponadtlenkową
(SOD):
V.
VI.
Reakcja redukcji cytochromu c (FeIII) przez anionorodnik ponadtlenkowy:
Reakcja utlenienia cytochromu c (FeII) przez nadtlenek wodoru:
6
WYKONANIE
Wytwarzanie i usuwanie anionorodnika ponadtlenkowego
1. W czterech probówkach przygotować, zgodnie z tabelą, roztwory badane.
Numer roztworu badanego Roztwór D [ml] Roztwór A [ml] Roztwór F [ml] Roztwór I [ml] Roztwór H [ml]
1
1,8
0,2
-
-
-
2
1,8
0,1
-
-
0,1
3
1,8
-
-
0,1
0,1
4
1,8
-
0,1
-
0,1
A. 50 mM bufor fosforanowy pH 7,6, zawierający 0,1 mM EDTA (związek kompleksujący jony metali).
D. Mieszanina ksantyny i utlenionej formy cytochromu c sporządzona przez zmieszanie roztworów B i C
w proporcji 1:10.
Roztwór B:
1 mg ksantyny rozpuszczony w 10 ml 1 mM NaOH.
Roztwór C:
2,5 mg cytochromu c rozpuszczone w 10 ml roztworu A.
E. Roztwór oksydazy ksantynowej.
F. Allopurynol (1 mg/ml 1 mM NaOH).
H. Roztwór katalazy.
I. Roztwór dysmutazy ponadtlenkowej.
2. Wstawić kuwetę z odnośnikiem (próba ślepa – 2 ml roztworu A) i wykonać pomiar absorbancji przy długości
fali 550 nm.
3. Wstawić kuwetę 1 (zawierającą roztwór badany 1) do komory pomiarowej spektrofotometru, następnie dodać
0,1 ml (100 l) roztworu oksydazy ksantynowej (E) i mierzyć absorbancję co 30 s przez 7 min.
4. Wstawić kuwetę 2 (zawierającą roztwór badany 2) do komory pomiarowej spektrofotometru. Następnie do
roztworu w kuwecie 2 dodać 0,1 ml (100 l) roztworu oksydazy ksantynowej (E) i mierzyć co 30 s przez 7 min
absorbancję.
5. Wstawić kuwetę 3 (zawierającą roztwór badany 3) do komory pomiarowej spektrofotometru. Następnie, do
roztworu w kuwecie 3 dodać 0,1 ml (100 l) roztworu oksydazy ksantynowej (E) i mierzyć co 30 s przez 7 min
absorbancję.
6. Wstawić kuwetę 4 (zawierającą roztwór badany 4) do komory pomiarowej spektrofotometru. Następnie do
roztworu w kuwecie 4 dodać 0,1 ml (100 l) roztworu oksydazy ksantynowej (E) i mierzyć co 30 s przez 7 min
absorbancję.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
1. Przedstawić zasadę zastosowanej w doświadczeniu metody detekcji anionorodnika ponadtlenkowego.
2. Porównać przebieg krzywych obrazujących ilość anionorodnika ponadtlenkowego w każdym układzie
badawczym.
3. Przedstawić wzorami reakcje, które zachodzą w każdym z analizowanych roztworów.
4. Podać przykłady reakcji metabolicznych, w których produktem ubocznym jest anionorodnik ponadtlenkowy.
7
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Degradacja nukleozydów purynowych w organizmie człowieka (wzorami).

Wzór i pełna nazwa FMN, FMNH2, FAD i FADH2

Rodzaje nukleotydów i nukleozydów purynowych (wzorami i nazwami).

Dna moczanowa – przyczyny i leczenie.

2. Reaktywne formy tlenu (RFT): tlen singletowy; anionorodnik ponadtlenkowy ( O 2 ) i jego forma
uprotonowana - rodnik wodoronadtlenkowy (HO2); nadtlenek wodoru (H2O2); rodnik wodorotlenowy (OH).

Powstawanie RFT w organizmach żywych.

Mechanizmy obrony biologicznej przed reaktywnymi formami tlenu.
Literatura
1. Bańkowski E. Biochemia: podręcznik dla studentów uczelni medycznych, Elsevier Urban & Partner ,
Wrocław
2. Granner D.K., Mayes P.A., Biochemia Harpera, Wydawnictwo Lekarskie PZWL
3. Bartosz G. Druga twarz tlenu - wolne rodniki w przyrodzie, Wydawnictwo Naukowe PWN
8