1 Lek. Katarzyna Wojciechowska Zakład Genetyki Klinicznej I

Komentarze

Transkrypt

1 Lek. Katarzyna Wojciechowska Zakład Genetyki Klinicznej I
Lek. Katarzyna Wojciechowska
Zakład Genetyki Klinicznej
I Wydział Lekarski
Uniwersytet Medyczny w Lublinie
„Transdukcja sygnałów szlakiem MyD88-zależnym w limfocytach B białaczki
limfocytowej przewlekłej”
Przewlekła białaczka limfocytowa B komórkowa (B-CLL)
jest najczęściej
występującą białaczką u osób po 55 roku życia oraz jednym z najczęstszych nowotworów
układu krwiotwórczego. B-CLL jest chorobą heterogenną, charakteryzującą się dużą
różnorodnością postaci klinicznych, genotypowych i rokowniczych. Klonalny rozrost
komórek prowadzi do ich akumulacji w krwi obwodowej, szpiku kostnym, w węzłach
chłonnych i śledzionie. Patogeneza choroby nie jest precyzyjnie zdefiniowana. Limfocyty B
w krwi obwodowej pacjentów ze zdiagnozowaną B-CLL mają niski poziom
powierzchniowych Ig oraz charakterystyczny fenotyp powierzchniowy: CD5+, CD 23+,
CD19+, CD20+. Wiadomo również, iż stan kliniczny pacjenta, czas podwajania ilości
limfocytów, mutacja w genie IgVH, ekspresja CD38 oraz ZAP-70 w komórkach
białaczkowych mają wpływ na prognozę przebiegu choroby. Jakkolwiek etiologia B-CLL jest
jeszcze nieznana, wielu badaczy podkreśla, iż proces stymulacji antygenowej może być
głównym inicjatorem rozwoju tego nowotworu.
Układ immunologiczny człowieka rozpoznaje antygeny dzięki receptorom PRRs
(pattern recognition receptors), które występują na lub w komórkach odporności wrodzonej
np. limfocytach T i B, makrofagach, komórkach dendrytycznych, komórkach nabłonkowych
układu pokarmowego i oddechowego. Jedną z najważniejszych grup PRR receptorów są TLR
receptory (Toll-like receptors). Stanowią one podstawowy i najważniejszy mechanizm
odpowiedzi nieswoistej umożliwiający zapoczątkowanie odpowiedzi swoistej. TLRs
rozpoznają różnego rodzaju struktury patogenów, m.in. peptydoglikan bakterii Gramm
dodatnich, lipopolisacharyd (LPS) bakterii Gramm ujemnych, niemetylowany CpG DNA,
kwasy nukleinowe. Większość receptorów Toll-podobnych występuje na powierzchni
komórki (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 i TLR10). Te z nich, które mają zdolność
rozpoznawania kwasów nukleinowych t.j.: TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 rozmieszczone są
wewnątrz komórki w endosomach.
Po rozpoznaniu struktury patogenu TLRs przewodzą sygnał aktywacji reakcji
zapalnej. W wewnątrzkomórkowe szlaki transdukcji sygnałów zaangażowanych jest wiele
różnych białek. Prawie wszystkie TLRs, z wyłączeniem TLR3, w szlaku sygnałowym
wykorzystują białko MyD88. Białko to przyłącza się bezpośrednio do TLR5, 7, 8, 9 i 11,
natomiast do połączenia z TLR2 i 4 niezbędne jest uczestnictwo białka adaptorowego TIRAP.
Następnie do MyD88 przyłączają się kolejno białka IRAK1 i IRAK4, które po fosforylacji
aktywują białko TRAF6. TRAF6 pobudza białko TAK1 należące do dużej rodziny kinaz
MAP3K. Konsekwencją tych reakcji jest uwolnienie i uaktywnienie czynnika NF-κB, który
przemieszcza się do jądra komórkowego, gdzie indukuje ekspresję genów dla cytokin
zapalnych oraz aktywacja czynnika transkrypcyjnego AP-1, który indukuje ekspresję genów
1
cytokin prozapalnych (głównie IL-6). Dochodzi również do aktywacji czynnika regulującego
syntezę interferonu IRF7 i produkcji interferonu α i β. Aktywacja ekspresji mediatorów
zapalnych może odbywać się również szlakiem MyD88- niezależnym. TLR3 wykorzystuje
białko adaptorowe TRIF, natomiast TLR4 oprócz białka TRIF dodatkowo pośrednio białko
TRAM. TRIF aktywuje kinazy bezpośrednio fosforylujące czynniki IRF3 oraz IRF7
indukujące ekspresję interferonu typu I- IFNβ.
Materiał badawczy stanowią wyizolowane z krwi obwodowej pacjentów ze
zdiagnozowaną przewlekłą białaczką limfocytową, limfocyty B. Dokonywana jest ocena
kliniczna chorych według kryteriów WHO. Oznaczany jest immunofenotyp powierzchni
limfocytów z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych, przeprowadzany metodą
cytometrii przepływowej. Limfocyty prawidłowe i białaczkowe stymulowane są in vitro LPSem i SAC. Izolowane są czyste subpopulacje CD19+ limfocytów stymulowanych i
niestymulowanych w sorterze. Dokonuje się izolacji RNA z uzyskanych czystych
subpopulacji komórkowych zmodyfikowaną met. Chomczyńskiego. Następnie otrzymane
RNA jest przepisywane na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji (Reverse Transcription
PCR). Analiza ekspresji wybranych genów wtórnych przekaźników sygnałów (TLR2, TLR4,
TRAF6, MAPK, AP1) wykonywana jest metodą Real-Time PCR (reakcja PCR z analizą
przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym). Wykorzystywane metody badawcze należą
do jednych z najnowocześniejszych i używanych w najlepszych laboratoriach, co sprawia, iż
praca jest bardzo nowatorska.
Tematyka pracy doktorskiej przedstawia bardzo oryginalną propozycję możliwego
mechanizmu transformacji nowotworowej limfocytów B. Celem pracy jest zbadanie i ocena
ekspresji genów szlaku transdukcji sygnału w limfocytach B przewlekłej białaczki Bkomórkowej. Porównanie elementów tego szlaku z ich prawidłowymi odpowiednikami być
może pozwoli na znalezienie defektu, którego konsekwencją jest zaburzenie odporności w BCLL. Etiopatogeneza B-CLL nie jest znana stąd ważne jest poszukiwanie przyczyn na wielu
płaszczyznach funkcjonowania limfocytów B. Wykrycie ewentualnego defektu w tym szlaku
mogłoby się przyczynić do dalszych badań nad skutecznym usuwaniem tych
nieprawidłowości i przywrócenie prawidłowej funkcji komórek B. Uzyskane wyniki badań
mogłyby przyczynić się do udzielenia odpowiedzi na pytanie dotyczące mechanizmu
transformacji nowotworowej.
2