1 Lek. Katarzyna Wojciechowska Zakład Genetyki Klinicznej I
Transkrypt
1 Lek. Katarzyna Wojciechowska Zakład Genetyki Klinicznej I
Lek. Katarzyna Wojciechowska Zakład Genetyki Klinicznej I Wydział Lekarski Uniwersytet Medyczny w Lublinie „Transdukcja sygnałów szlakiem MyD88-zależnym w limfocytach B białaczki limfocytowej przewlekłej” Przewlekła białaczka limfocytowa B komórkowa (B-CLL) jest najczęściej występującą białaczką u osób po 55 roku życia oraz jednym z najczęstszych nowotworów układu krwiotwórczego. B-CLL jest chorobą heterogenną, charakteryzującą się dużą różnorodnością postaci klinicznych, genotypowych i rokowniczych. Klonalny rozrost komórek prowadzi do ich akumulacji w krwi obwodowej, szpiku kostnym, w węzłach chłonnych i śledzionie. Patogeneza choroby nie jest precyzyjnie zdefiniowana. Limfocyty B w krwi obwodowej pacjentów ze zdiagnozowaną B-CLL mają niski poziom powierzchniowych Ig oraz charakterystyczny fenotyp powierzchniowy: CD5+, CD 23+, CD19+, CD20+. Wiadomo również, iż stan kliniczny pacjenta, czas podwajania ilości limfocytów, mutacja w genie IgVH, ekspresja CD38 oraz ZAP-70 w komórkach białaczkowych mają wpływ na prognozę przebiegu choroby. Jakkolwiek etiologia B-CLL jest jeszcze nieznana, wielu badaczy podkreśla, iż proces stymulacji antygenowej może być głównym inicjatorem rozwoju tego nowotworu. Układ immunologiczny człowieka rozpoznaje antygeny dzięki receptorom PRRs (pattern recognition receptors), które występują na lub w komórkach odporności wrodzonej np. limfocytach T i B, makrofagach, komórkach dendrytycznych, komórkach nabłonkowych układu pokarmowego i oddechowego. Jedną z najważniejszych grup PRR receptorów są TLR receptory (Toll-like receptors). Stanowią one podstawowy i najważniejszy mechanizm odpowiedzi nieswoistej umożliwiający zapoczątkowanie odpowiedzi swoistej. TLRs rozpoznają różnego rodzaju struktury patogenów, m.in. peptydoglikan bakterii Gramm dodatnich, lipopolisacharyd (LPS) bakterii Gramm ujemnych, niemetylowany CpG DNA, kwasy nukleinowe. Większość receptorów Toll-podobnych występuje na powierzchni komórki (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 i TLR10). Te z nich, które mają zdolność rozpoznawania kwasów nukleinowych t.j.: TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 rozmieszczone są wewnątrz komórki w endosomach. Po rozpoznaniu struktury patogenu TLRs przewodzą sygnał aktywacji reakcji zapalnej. W wewnątrzkomórkowe szlaki transdukcji sygnałów zaangażowanych jest wiele różnych białek. Prawie wszystkie TLRs, z wyłączeniem TLR3, w szlaku sygnałowym wykorzystują białko MyD88. Białko to przyłącza się bezpośrednio do TLR5, 7, 8, 9 i 11, natomiast do połączenia z TLR2 i 4 niezbędne jest uczestnictwo białka adaptorowego TIRAP. Następnie do MyD88 przyłączają się kolejno białka IRAK1 i IRAK4, które po fosforylacji aktywują białko TRAF6. TRAF6 pobudza białko TAK1 należące do dużej rodziny kinaz MAP3K. Konsekwencją tych reakcji jest uwolnienie i uaktywnienie czynnika NF-κB, który przemieszcza się do jądra komórkowego, gdzie indukuje ekspresję genów dla cytokin zapalnych oraz aktywacja czynnika transkrypcyjnego AP-1, który indukuje ekspresję genów 1 cytokin prozapalnych (głównie IL-6). Dochodzi również do aktywacji czynnika regulującego syntezę interferonu IRF7 i produkcji interferonu α i β. Aktywacja ekspresji mediatorów zapalnych może odbywać się również szlakiem MyD88- niezależnym. TLR3 wykorzystuje białko adaptorowe TRIF, natomiast TLR4 oprócz białka TRIF dodatkowo pośrednio białko TRAM. TRIF aktywuje kinazy bezpośrednio fosforylujące czynniki IRF3 oraz IRF7 indukujące ekspresję interferonu typu I- IFNβ. Materiał badawczy stanowią wyizolowane z krwi obwodowej pacjentów ze zdiagnozowaną przewlekłą białaczką limfocytową, limfocyty B. Dokonywana jest ocena kliniczna chorych według kryteriów WHO. Oznaczany jest immunofenotyp powierzchni limfocytów z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych, przeprowadzany metodą cytometrii przepływowej. Limfocyty prawidłowe i białaczkowe stymulowane są in vitro LPSem i SAC. Izolowane są czyste subpopulacje CD19+ limfocytów stymulowanych i niestymulowanych w sorterze. Dokonuje się izolacji RNA z uzyskanych czystych subpopulacji komórkowych zmodyfikowaną met. Chomczyńskiego. Następnie otrzymane RNA jest przepisywane na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji (Reverse Transcription PCR). Analiza ekspresji wybranych genów wtórnych przekaźników sygnałów (TLR2, TLR4, TRAF6, MAPK, AP1) wykonywana jest metodą Real-Time PCR (reakcja PCR z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym). Wykorzystywane metody badawcze należą do jednych z najnowocześniejszych i używanych w najlepszych laboratoriach, co sprawia, iż praca jest bardzo nowatorska. Tematyka pracy doktorskiej przedstawia bardzo oryginalną propozycję możliwego mechanizmu transformacji nowotworowej limfocytów B. Celem pracy jest zbadanie i ocena ekspresji genów szlaku transdukcji sygnału w limfocytach B przewlekłej białaczki Bkomórkowej. Porównanie elementów tego szlaku z ich prawidłowymi odpowiednikami być może pozwoli na znalezienie defektu, którego konsekwencją jest zaburzenie odporności w BCLL. Etiopatogeneza B-CLL nie jest znana stąd ważne jest poszukiwanie przyczyn na wielu płaszczyznach funkcjonowania limfocytów B. Wykrycie ewentualnego defektu w tym szlaku mogłoby się przyczynić do dalszych badań nad skutecznym usuwaniem tych nieprawidłowości i przywrócenie prawidłowej funkcji komórek B. Uzyskane wyniki badań mogłyby przyczynić się do udzielenia odpowiedzi na pytanie dotyczące mechanizmu transformacji nowotworowej. 2