OZNACZANIE TRYPSYNY METODĄ FORMOLOWĄ

ĆW. NR 1
BADANIE WŁAŚCIWOŚCI ENZYMATYCZNYCH TRYPSYNY
OZNACZENIE SZYBKOŚCI REAKCJI TRAWIENIA ŻELATYNY PRZEZ TRYPSYNĘ
Zasada metody:
W miarę postępowania hydrolizy białka przez trypsynę pojawia się w roztworze coraz więcej
grup karboksylowych, które po uprzednim zablokowaniu grup aminowych przez formaldehyd
można oznaczyć ilościowo, miareczkując wodorotlenkiem sodowym wobec fenoloftaleiny
(miareczkowanie metodą Sörensena). Ilość zasady zużytej do miareczkowania jest więc miarą
stopnia zhydrolizowania białka.
Wykonanie:
Przygotować 5 kolb stożkowych (erlenmajerek). Do każdej z nich odmierzyć po 5 cm3
formaldehydu i dodać po 2 krople fenoloftaleiny. Do oddzielnej kolby odmierzyć 12 cm3
żelatyny, oraz 3 cm3 soku trzustkowego, całość wymieszać i natychmiast pobrać 2.5 cm3 tej
mieszaniny i przenieść do pierwszej kolby z formaldehydem. Zawartość kolby miareczkować
0.02 M roztworem NaOH wobec fenoloftaleiny jako wskaźnika. Resztę mieszaniny (żelatyna +
sok trzustkowy) zaraz po pobraniu 2.5 cm3 umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
Zanotować czas pobrania i oznaczyć go jako czas zero (T0). Po 5 minutach (od czasu zero)
pobrać 2.5 cm3 mieszaniny i przenieść do kolejnej kolby z formaldehydem, miareczkować
NaOH wobec fenoloftaleiny. Czynność powtarzać po 15, 30 i 45 minutach od czasu T0.
Zanotować otrzymane wyniki.
Obliczenia:
Ilość zużytego do miareczkowania wodorotlenku sodowego przeliczyć na ilość mikromoli
wiązanych protonów grup karboksylowych, przyjmując założenie, że 1 cm3 0.02M roztworu
NaOH odpowiada 20 μmolom grup COOH. Sporządzić wykres zależności między ilością
uwalnianych grup karboksylowych w mikromolach, a czasem inkubacji. Oznaczyć szybkość
początkową reakcji w μmol/min. korzystając ze sporządzonego wykresu.
Piśmiennictwo:
“Biochemia Harpera” Murray R.K, Granner D.K, Mayes P.A, Rodwell V.W; PZWL Warszawa wydanie III-V
“Ćwiczenia z biochemii” praca zbiorowa pod redakcją Kłyszejko-Stefanowicz L; PWN Warszawa 1999
„Fizjologia człowieka w zarysie” Traczyk W.Z; PZWL Warszawa wydanie IV-VII.
BADANIE WŁAŚCIWOŚCI ENZYMATYCZNYCH TRYPSYNY
OZNACZANIE TRYPSYNY METODĄ FORMOLOWĄ
Zasada metody:
W środowisku zasadowym trypsyna hydrolizuje żelatynę. Uwolnione grupy
α-karboksylowe w otrzymanych peptydach oznacza się formolową metodą Sörensena.
Grupa karboksylowa zablokowana przez grupę amoniową nie może być bezpośrednio
miareczkowana zasadami. W obecności formaldehydu grupa amoniowa reaguje z aldehydem,
dając metylenową pochodną peptydu. W wyniku tej reakcji grupa amoniowa traci swoje
podstawowe własności, natomiast grupa karboksylowa zostaje odblokowana i może być
miareczkowana.
Wykonanie:
Do 2 kolb odmierzyć po 25 cm3 roztworu żelatyny. Do jednej kolby dodać 0.5 cm3 soku
trzustkowego. Do obu wprowadzić po 2 krople roztworu fenoloftaleiny i dodać ługu sodowego
do powstania różowego zabarwienia. Kolby wstawić do łaźni wodnej o temp. 37°C na 45 minut.
Do 2 innych kolb odmierzyć po 2.5 cm3 formaldehydu i 2.5 cm3 etanolu, oraz po 1 kropli
roztworu fenoloftaleiny. Do tych samych kolb dodać kilka kropli NaOH do powstania różowego
zabarwienia.
Wobec odbarwienia się zawartości kolb ogrzewanych w łaźni wodnej, należy dodać do nich
NaOH do powstania różowego zabarwienia.
Po przewidzianym czasie inkubacji w 37°C zmieszać zawartość kolb z żelatyną z
zobojętnionym roztworem formaldehydu. Zabarwienie różowe znika. Miareczkować 0.1 M
roztworem NaOH do powstania zabarwienia, będącego wynikiem reakcji wskaźnika ze
środowiskiem zasadowym.
Obliczenie:
Od ilości roztworu ługu sodowego zużytego do miareczkowania kolby z sokiem trzustkowym (po
zmieszaniu z formaldehydem) należy odjąć ilość cm3 NaOH zużytą na miareczkowanie
zawartości kolby kontrolnej bez soku trzustkowego. Różnica, która wyraża się w cm3 roztworu
NaOH jest miarą stopnia zhydrolizowania żelatyny przez trypsynę.
Piśmiennictwo:
“Biochemia Harpera” Murray R.K, Granner D.K, Mayes P.A, Rodwell V.W; PZWL Warszawa wydanie III-V
“Ćwiczenia z biochemii” praca zbiorowa pod redakcją Kłyszejko-Stefanowicz L; PWN Warszawa 1999
„Fizjologia człowieka w zarysie” Traczyk W.Z; PZWL Warszawa wydanie IV-VII.