MultiMix - Agilent

MultiMix™
Dual-Colour Reagent
Anti-Human CD45/FITC
Anti-Human CD14/RPE
Nr kat. FR700
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
FR700 jest przeznaczony do stosowania w cytometrii przepływowej. CD45 jest najpowszechniej występującą
glikoproteiną na powierzchni leukocytów, a jej ekspresję wykazują wyłącznie komórki układu krwiotwórczego
oraz ich komórki macierzyste (1). Przeciwciało przeciw antygenowi CD14 odgrywa ważną rolę w szczegółowej
analizie limfocytów T ze względu na wykluczanie monocytów CD14-dodatnich (2, 3). Połączenie antygenów
CD45 i CD14 umożliwia równoczesne dalsze różnicowanie leukocytów na limfocyty, monocyty i granulocyty.
Interpretację wyników powinien przeprowadzić pracownik uprawniony do wykonywania takich badań w oparciu
o historię choroby pacjenta oraz inne testy diagnostyczne.
Odczynnik dostarczony
FR700 składa się z dwóch następujących, starannie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych:
Przeciwciało Monoclonal Mouse Anti-Human CD45, Clone T29/33, skoniugowane z izomerem 1 izotiocyjanianu
fluoresceiny (FITC).
Przeciwciało Monoclonal Mouse Anti-Human CD14, Clone TÜK4, skoniugowane z R-fikoerytryną (RPE).
Oba koniugaty FR700 zostały wyprodukowane z izotypów kappa oczyszczonych mysich przeciwciał
monoklonalnych IgG1(CD45) i IgG2a (CD14). FR700 jest dostarczany w postaci płynnej w buforze zawierającym
1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3 o pH 7,2. Każda fiolka zawiera 50 testów (10 µL
koniugatu przeznaczone jest dla maksymalnie 106 leukocytów z normalnej ludzkiej krwi obwodowej).
Swoistość
Przeciwciałon
r kat.
Fluorochrom
Nr kat. odczynnika
kontrolnego
FR700
FITC i RPE
X0949
Przeciwciało Anti-CD45, T29/33, włączono do programu Trzecich i Czwartych Międzynarodowych Warsztatów i
Konferencji: Ludzkie antygeny różnicowania leukocytów (International Workshops and Conferences on Human
Leucocyte Differentiation Antigens). Na Trzecich Warsztatach przeciwciało zaliczono do grupy przeciwciał
antygenu CD45, reagujących ze wszystkimi znanymi izotypami rodziny CD45, zwanej również rodziną
wspólnych antygenów leukocytowych (4). Na Czwartych Warsztatach wykazano ekspresję CD45 w szeregu
krwiotwórczych linii komórkowych oraz jego brak w niekrwiotwórczych liniach komórkowych. Co istotne,
komórki szpiczaka oraz plazmatyczna linia komórkowa U-266 wykazywały ekspresję CD45 na bardzo niskim
poziomie (5).
Przeciwciało Anti-CD14, TÜK4, włączono do programu Czwartych, Piątych i Szóstych Międzynarodowych
Warsztatów i Konferencji: Ludzkie antygeny różnicowania leukocytów (International Workshops and
Conferences on Leucocyte Differentiation Antigens), a badania przeprowadzone przez liczne laboratoria
potwierdziły jego reaktywność z antygenem CD14 (6-8).
Przeciwciało Anti-CD14, TÜK4, wchodzi w silne reakcje z monocytami krwi obwodowej i wykazuje wysoką
reaktywność na granulocyty. Reaguje również z makrofagami okołonaczyniowymi. Przeciwciało znakuje 50%
komórek Langerhansa w zawiesinach komórek naskórka i dlatego jest charakteryzowane jako słabo reaktywne
(8).
Środki ostrożności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stężeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, może reagować
z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych
azydków metali. Po usunięciu spłukać dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w
kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych należy stosować
prawidłowe procedury postępowania.
Przechowywanie
Przechowywać w ciemnym miejscu w temp. 2-8°C. Nie używać po dacie ważności podanej na etykiecie fiolki.
Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane powyżej, użytkownik musi zweryfikować
takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na utratę stabilności produktu. Dlatego jednocześnie z
badaniem próbek pacjenta należy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. Jeśli wystąpi nieoczekiwany
wzór barwienia, którego nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, że
przyczyną może być problem z przeciwciałem, należy niezwłocznie skontaktować się z działem pomocy
technicznej naszej firmy.
Wykonanie odczynu
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej
o wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 10 µL FR700 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
3.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub przez 15–30 minut
w temperaturze pokojowej (20–25°C).
(106752-003)
FR700/PL/OKJ/11.03.05 p. 1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · Nr CVR 33 21 13 17
4.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
5.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
6.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
7.
Dodać do probówki 2 mL PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę komórek za pomocą mieszadła
wibracyjnego.
8.
Powtórzyć etap 6.
9.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
10.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności i
temperaturze 2–8°C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie wykonywania
odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne w
celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą
się zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone
indywidualnie w każdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do izotypów i fluorochromów sprzężonego przeciwciała. Zalecanym dwubarwnym odczynnikiem
kontrolnym dla FR700 jest odczynnik Dako o numerze kat. X0949.
Etapy 4 i 5: Jeśli używany jest inny odczynnik do lizy komórek, należy przy jego doborze kierować się
poniższymi zaleceniami. Należy zauważyć, że jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza (np.
Dako EasyLyse™, nr kat. S2364) PBS w kroku 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba że próbka
zostanie przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 10: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej ilości komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca
ekspresji antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru.
Piśmiennictwo
(106752-003)
1.
Leong AS-Y, Cooper K, Leong FJW-M. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. Londyn:
Oxford University Press; 2003. str. 121-4.
2.
Centers for disease control. Guidelines for the performance of CD4+ T-cell determinations in persons
with human immunodeficiency virus infection. MMWR 1992;41 (Nr RR-8);001. Data publikacji przez CDC
05/08/1992.
3.
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Document. Clinical applications of flow
cytometry: Quality assurance and immunophenotyping of peripheral blood lymphocytes. H42-T
1992;12:1-76.
4.
Cobbold S, Hale G, Waldmann H. Non-lineage, LFA-1, and leucocyte common antigens: new and
previously defined clusters. In: McMichael AJ, Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch
FM, et al., editors. Leukocyte typing III. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd
International Workshop and Conference; 1986, Sep 21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo:
Oxford University Press; 1987. p. 788-803.
5.
Schwinzer R. N7. Cluster report: CD45/CD45R. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt
RE, Stein H, et al., editors. Leukocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th
International Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo:
Oxford University Press; 1989. p. 628-34.
6.
Goyert SM, Haziot A, Jiao D, Katz IR, Kruger C, Ross J, Schütt C. M4. CD14 cluster workshop report. In:
Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, Ritz J, et al., editors.
Leucocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the Fifth International Workshop
and Conference; Held in Boston, USA, 3-7 November 1993. Volume One. Oxford, New York, Tokyo:
Oxford University Press; 1995. p. 778-82.
7.
Goyert SM, Cohen L, Gangloff SC, Ashmun R, Haeffner-Cavaillon N. MC4. CD14 workshop panel report.
In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors.
Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop
and Conference; 1996, Nov 10-14; Kobe, Japonia. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997.p.
963-5.
8.
Goyert SM, Tesio L, Ashman LK, Ball E, Bazil V, Garrido F, Hogg N, Horejsi V, et al. M3.1. Report on the
CD14 cluster workshop. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, von dem
Borne AEG, editors. Leucocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th
International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens; 1989, February
21-25, Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1989. p. 789-94.
FR700/PL/OKJ/11.03.05 p. 2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · Nr CVR 33 21 13 17
Objaśnienie symboli
(106752-003)
Numer katalogowy
Zakres temperatur
Urządzenie medyczne do
diagnostyki in vitro
Nr serii
Przed użyciem zapoznać się z
instrukcjami
Termin ważności
Producent
FR700/PL/OKJ/11.03.05 p. 3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · Nr CVR 33 21 13 17