7.2. Biosynteza białek

238
Podstawy biochemii
7.2. Biosynteza białek
Biosynteza białka jest jednym z najważniejszych zjawisk współczesnej biologii.
Podczas gdy w przyrodzie nieożywionej nowe drogi uzyskiwania energii mogą być
odnajdywane dzięki postępowi fizyki nuklearnej, odpowiedź na pytanie o sterowanie podstawowymi procesami organizmów żywych można uzyskać badając naturę
chemiczną i biologiczne funkcje białek.
Intensywność biosyntezy białek charakteryzuje średnia szybkość syntezy łańcuchów polipeptydowych, wynosząca w komórkach bakterii 16-17 reszt aminokwasowych w ciągu jednej sekundy, 7-8 w komórkach drożdży i 5-7 w komórkach
ssaków. Synteza cząsteczki globiny w retikulocytach królika trwa 20 sekund, podczas gdy cząsteczki owoalbuminy jajowodu kury i białek wątroby szczura 80 sekund. W ciągu 1 minuty w retikulocycie królika syntetyzowanych jest 5⋅104 cząsteczek globiny, w komórce jajowodu kury – 6 ⋅105 cząsteczek owoalbuminy, podczas gdy komórki gruczołowe jedwabnika są w stanie wyprodukować w tym samym czasie 38⋅1011 cząsteczek fibroiny.
Przełomowym momentem w wyjaśnieniu mechanizmu biosyntezy białka było
ustalenie roli jaką w procesie syntezy łańcuchów polipeptydowych pełnią poszczególne rodzaje kwasów rybonukleinowych (RNA). Na każdym etapie ciągu procesów prowadzących do syntezy białek udział cząsteczek RNA polega na przekazywaniu informacji o strukturze nowo syntetyzowanych cząsteczek białkowych. Matrycowy mechanizm biosyntezy polimerów białkowych, gwarantujący bezbłędne
odtwarzanie informacji o ich pierwotnej strukturze zakodowanej w cząsteczce
kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), stanowi specyficzną właściwość żywej
materii. Jest przykładem prawidłowości towarzyszących powstaniu i rozwoju biologicznych form żywej materii. Mniej efektywny mechanizm zwykłej chemicznej
syntezy, podstawą której są chaotyczne zderzenia molekuł, zostaje tu zmieniony
w ukierunkowaną syntezę o wydajności miliard razy przewyższającej syntezę
w systemach nieuporządkowanych.
Doniosłe znaczenie w odpowiedzi na pytanie o mechanizm biosyntezy białek
miało wyjaśnienie miejsca jej lokalizacji w aparacie rybosomowym komórki
i skonstruowanie systemów bezkomórkowych, gdzie jedyną strukturą, na której
przebiegała biosynteza białka, były rybosomy. Wyjaśnienie ich budowy i funkcji
przyniosło nieocenioną informację na temat biosyntezy białka i molekularnych
mechanizmów jej przebiegu.
Mechanizm biosyntezy białka. Ogólny schemat biosyntezy białka przedstawia
rys. 7.5. Obejmuje on trzy etapy przygotowawcze związane z transportem materii,
energii i informacji do rybosomu oraz etap czwarty, w którym na podstawie kolejności nukleotydów mRNA odczytywana jest sekwencja łańcucha aminokwasów.
Rozdział 7. Przemiana białek
239
Rys. 7.5. Uproszczony schemat matrycowej biosyntezy białek (objaśnienie w tekście)
Proces transkrypcji, czyli przepisywania informacji o kolejności ułożenia reszt
aminokwasowych w cząsteczce syntetyzowanego białka, omówiony był wcześniej
(prawa górna część rysunku). Informacja o kolejności ułożenia reszt aminokwasowych w syntetyzowanym białku zakodowana jest w aparacie genetycznym komórki w postaci sekwencji nukleotydów cząsteczki DNA. Wraz z jej przepisaniem
(transkrypcja) na sekwencję rybonukleotydów w cząsteczce informacyjnego RNA
(mRNA) transportowana zostaje do rybosomu, gdzie ulega przetłumaczeniu (translacja) na kolejne aminokwasy nowo powstającego łańcucha białkowego. Procesy
związane z transportem substancji (18 proteinogenicznych aminokwasów i 2 amidy) i energii niezbędnej dla syntezy wiązań peptydowych (lewa górna część rysunku) oraz proces syntezy łańcuchów polipeptydowych na aktywnym translacyjnie
rybosomie (środkowa część rysunku) zostały omówione w dalszych rozdziałach.
Aktywacja i transport aminokwasów do rybosomów. Synteza wiązania peptydowego z wolnych aminokwasów przebiega z pochłonięciem energii w ilości ok.
12 kJ/mol, co wskazuje na powiązania biosyntezy białka z procesami utleniania lub
rozpadu związków zawierających wiązania makroergiczne. W roku 1955 M. Hogland jako pierwszy przedstawił schemat dwustopniowej reakcji enzymatycznego
procesu aktywacji aminokwasów.
W pierwszym etapie wskutek wzajemnego oddziaływania aminokwasów
z ATP powstaje aminoacyloadenylan i wydziela się pirofosforan. Hydrolityczny
240
Podstawy biochemii
rozpad pirofosforanu przy udziale pirofosfatazy zapewnia nieodwracalność reakcji
powstawania aminoacyloadenylanu. Drugi etap polega na przeniesieniu aminokwasu z powstałego uprzednio aminoacyladenylanu na resztę adenozyny akceptorowego tRNA:
Łańcuch
2
CH
NH2
NH2
N
N
OH
H 2N
CH
CO
O~ P
R
N
N
CH2
O
O
N
H
OH
OH
H
N
N
+
O
H
N
CH2
O
H
H
OH
OH
H
H
Aminoacylodenylan
Enzym aktywujący
(Syntetaza aminoacylo-tRNA)
H
tRNA
Łańcuch
2
CH
NH2
NH2
N
OH
HO
P
N
O
CH2
O
+
CH2
H
H
OH
N
O
H
H
H
H
OH
N
N
N
O
H
N
N
H2N
CH
CO~O
H
OH
R
Kwas adenilowy
Aminoacylo-tRNA
Aminoacyloadenylan jest mieszanym bezwodnikiem aminokwasu i reszty kwasu
fosforowego adenozyno-5`-fosforanu. Swobodne aminoacyloadenylany jako bezwodniki w środowisku zbliżonym do obojętnego (pH = 7,4) wyjątkowo łatwo wchodzą w reakcje z aminokwasami nawet przy bardzo małym stężeniu (10-3 mol/l). Reakcja przebiega bez udziału enzymów, a jej wynikiem jest powstawanie wiązań peptydowych. Z podobną szybkością acylują wolne, dostępne grupy aminowe cząsteczki
białka. W tym samym czasie związane z enzymem aminoacyloadenylany są nieaktywne i w związku z tym nie mogą być wykorzystane w syntezie białka.
Specyficzność reakcji aktywowania aminokwasów, według przedstawionego
schematu, jest zbliżona do bezwzględnej i można ją traktować jako super specyficzną. W reakcji tej aktywowane są tylko naturalne L-izomery aminokwasów, podczas gdy izomery D nie biorą w niej udziału. Jakkolwiek niektóre homologi L-aminokwasów aktywowane są w równym stopniu co wzorcowe białkowe L-aminokwasy.
Rozdział 7. Przemiana białek
241
Aktywacja katalityczna każdego proteinogenicznego aminokwasu realizowana
jest za pośrednictwem enzymu specyficznego tylko dla danego aminokwasu. Enzymy te zostały wykryte u przedstawicieli wielu gatunków zwierząt, roślin (w tym
też wodorostów) i mikroorganizmów, co świadczy o ich szerokim rozpowszechnieniu wśród żywych organizmów. Konserwatywność ich występowania wskazuje
na istotną rolę jaką spełniają w biosyntezie białek. Enzymy aktywujące izolowane
są w niskiej temperaturze z nadosadowej frakcji (pH 5) podczas ultrawirowania
rozcieńczonego homogenatu komórek przy 105.000 g w ciągu jednej godziny.
Zawartą w nadsączu mieszaninę enzymów aktywujących aminokwasy wytrąca się
kwasem octowym (pH 5,3), dlatego też pierwotnie określano je jako pH-5 enzymy.
Zgodnie z aktualnie obowiązującym nazewnictwem są to syntetazy aminoacylotRNA (ARSazy).
Badania ostatnich lat dowodzą, że syntetazy aminoacylo-tRNA występują
w komórkach w postaci makrocząsteczkowych kompleksów, tzw. kodosomów. Przy
stałej sedymentacji 26-29S i M ~1,4 megaDa kompleksy te łączą w sobie kilka
ARSaz (specyficznych m.in. dla ala, gly, glu, leu i ser lub dla liz, met, arg, liz i try)
oraz enzymy które je modyfikują i regulują ich aktywność. Są to m.in. kinazy białkowe, metylotransferazy, transferazy ADP-rybozylowe, fosfoproteinofosforanazy.
Enzymy aktywujące aminokwasy są małostabilne i łatwo ulegają denaturacji
tracąc przy tym aktywność. Do ich inaktywacji prowadzi działanie na komórki
ultradźwiękami, a nawet krótkotrwałe przechowywanie. Dla ich prawidłowego
działania konieczna jest obecność w środowisku reakcyjnym jonów Mg2+, ponieważ wiązanie ATP przebiega z udziałem imidazolowego rodnika histydyny aktywowanego przez jon magnezu.
Większość z ponad 50 wyizolowanych i oczyszczonych ARSaz posiada masy cząsteczkowe bliskie 100.000 Da, chociaż w wyjątkowych przypadkach sięgają one powyżej 200.000 Da (syntetazy glicylo- i fenyloalanino-tRNA). W przeważającej części
ARSazy są dimerami lub tetrametrami (sporadycznie trimerami) i tylko, u niektórych,
takich jak: arginylowe, alanilowe, aspartylowe, walinowe i izoleucynowe stanowią
jeden łańcuch polipeptydowy złożony z ok. 1000 reszt aminokwasowych. Charakterystyczne jest, że podjednostki ARSaz o strukturze dimerycznej wykazują równoległą
aktywność. Uwolnienie syntetyzowanego aminoacylo-tRNA z jednej z nich przebiega
w momencie, gdy do drugiej w ślad za ATP i aminokwasem przyłącza się tRNA. Tak
więc każda podjednostka w cząsteczce ARSazy posiada trzy strukturalnie odmienne
centra wiązania substratów, przy czym ulokowanie się każdego substratu ułatwia
zaakceptowanie następnego. W związku z tym w procesie aminoacylowania tRNA
łatwo powstają potrójne kompleksy typu enzym-substrat. Najsłabiej z ARSazami
wiążą się ATP (KS = 10-4 M), średnio dziesięć razy lepiej – aminokwasy (KS = 10-5 M)
i najmocniej – tRNA (KS = 10-8 M). ARSazy są jednymi z najmniej stabilnych enzymów o aktywności wynoszącej od kilkudziesięciu do kilkuset obrotów na minutę.
242
Podstawy biochemii
Mechanizm działania ARSaz poznany został na podstawie badań struktury ich
aktywnego centrum oraz kinetyki przyspieszanych minireakcji aktywacji aminokwasów. Początkowo do ARSazy zostaje przyłączona cząsteczka ATP adenylująca
resztę histydyny centrum aktywnego. Reakcja ta zachodzi z wydzielaniem cząsteczki kwasu pirofosforowego:
NH2
N
E
CH2
+
HO
NH
N
OH
OH
OH
P~O
P ~O
P
O
O
O
N
N
O
CH2
N
O
H
H
OH
OH
H
ARSaza
H
ATP
NH2
N
E
OH
CH2
N~P
N
N
N
O
CH2
+
O
H
O
OH
N
H
H
OH
P
O
H
Adenilowana ARSaza
HO
OH
O
P
OH
O
Kwas pirofosforowy
OH
Z adenylowaną ARSazą oddziałuje aktywowany za jej pośrednictwem aminokwas, dając w wyniku reakcji aminoacyloadenylan posiadający zdolność aminoacylowania rodników, zawierających wolny atom wodoru. W efekcie grupa aminowa zostaje przeniesiona do rodnika histydyny aktywnego centrum ARSazy, tworząc aminoacylowany enzym:
E
CH2
N ~ CO
N
CH
NH2
R
Po związaniu tRNA przez enzym grupa aminoacylowa przenoszona jest w pozycję 3’-OH końcowej adenozyny (równanie reakcji patrz wyżej). U niektórych
ARSaz aktywującą rolę reszty histydyny może pełnić grupa boczna kwasu glutaminowego.
Podczas tworzenia kompleksu enzym-substrat ARSazy i tRNA ulegają zmianom konformacyjnym, ułatwiając reakcje aminoacylowania. Jednak najistotniejszym momentem ich wzajemnego oddziaływania jest zdolność bezbłędnego wzajemnego rozpoznawania odpowiadająca specyficzności aminokwasowej. Prawdo-
Rozdział 7. Przemiana białek
243
podobnie jest ona wynikiem wielopunktowego oddziaływania enzymu i tRNA,
przy czym istotna rola w rozpoznawaniu należy do antykodonu tRNA.
Przez długi czas uważano, że wiązanie grupy aminoacylowej z cząsteczką tRNA
ma miejsce na końcowym atomie węgla adenozyny w pozycji 3’-OH. Okazało się
jednak, że funkcję tę może pełnić również grupa hydroksylowa reszty rybozy przy
węglu 2’. Zjawisko to obserwuje się podczas aktywacji fenyloalaniny, leucyny i izoleucyny specyficznymi dla nich ARSazami. Syntetazy seryno- i treonino-tRNA warunkują przyłączenie grup aminoacylowych tylko przy węglu 3’ rybozy, natomiast
enzymy specyficzne dla tyrozyny i cysteiny w pozycjach 2’ i 3’. Prawdopodobnie
grupa aminoacylowa ma zdolność wiązania zarówno węgla 2’, jak i 3’ rybozy aż do
ustalenia równowagi:
Uważa się, że możliwość zmiany miejsca aminoacylacji tRNA związana jest
z preferencją do aktywacji właściwego aminokwasu przy jednoczesnym zapobieganiu włączania ich stereo-chemicznych odpowiedników (np. waliny i treoniny).
Występujące w tym procesie błędy, polegające na włączaniu niespecyficznych dla
danego tRNA aminokwasów, naprawiają ARSazay hydrolizując niespecyficzne
aminoacyloadenylany.
W związku z tym w procesie aktywacji zawsze realizowane jest selektywne
przyłączenie aminokwasu do specyficznej dla niego cząsteczki tRNA i tworzenie
kompleksu aminoacylo-tRNA dostarczającego do rybosomów wzbogaconych
w energię reszt aminokwasowych.
Za pomocą eksperymentów z zastosowaniem aminoacylo-tRNA o aminokwasach znakowanych izotopem 14C udowodniono, że stanowią one jedyne źródło
aminokwasów dla biosyntezy białka. W trakcie inkubacji radioaktywnych amino-
244
Podstawy biochemii
acylo-tRNA obserwowano spadek zawartości aminokwasu w badanych preparatach i proporcjonalny wzrost w syntetyzowanym białku (rys. 7.6).
P,
imp/min
300
1
200
100
2
5
10
15
20
τ, min
Rys. 7.6. Zależność promieniotwórczości próbek P (imp/min) od czasu inkubacji
τ (min) podczas reakcji syntezy białka: 1 – wzrost ilości C14-leucyny w białku; 2 – spadek ilości C14-leucyny w preparacie aminoacylo-tRNA (objaśnienie w tekście)
Aktywowany aminokwas rozpoznawany jest przez trzy kolejne nukleotydy
w antykodonowej pętli tRNA (antykodon) łącząc się z odpowiadającą mu sekwencją mRNA (kodon). Wzajemne oddziaływanie kodonów mRNA z antykodonami
aminoacylo-tRNA decyduje o kolejności uszeregowania aminokwasów w syntetyzowanym łańcuchu polipeptydowym. W eksperymencie potwierdzającym tę prawidłowość cysteinylo-tRNA ulegał redukcji do alanylo-tRNA:
H2NCH(CH2SH)CO~O−tRNAcys
Re dukcja
→
H2NCH(CH3)CO~O−tRNAcys + H2S
W układzie tym alanylo-tRNAcys zawiera resztę alaniny przyłączoną do tRNA,
który posiada antykodon cysteiny. Do syntetyzowanego białka w pozycję cysteiny
wprowadzane są reszty alaniny. Jednoznacznie wskazuje to na fakt, że cząsteczka
tRNA odpowiada za umiejscowienie złączonej z nią reszty aminoacylowej w nowo
syntetyzowanym białku. W związku z tym syntetazy aminoacylo-tRNA nazywane
były pierwotnie kodazami lub szyfrazami. Jednak na wniosek komisji do spraw
nazewnictwa enzymów zaniechano stosowania tych terminów wprowadzając w ich
miejsce ogólną nazwę syntetaz aminoacylo-tRNA.
Mechanizm syntezy łańcucha polipeptydowego. We wszystkich strukturalnych
elementach komórki (jądro, mitochondria, chloroplasty) biosynteza białek przebiega na rybosomach. Dlatego badanie struktury, właściwości oraz mechanizmu ich
oddziaływań z substancjami wyjściowymi do biosyntezy białek doprowadziło do
określeń prawidłowości w syntezie białek.
Rozdział 7. Przemiana białek
245
Budowa i właściwości rybosomów. Rybosomy są ciałkami rybonukleoproteinowymi o średnicy 0,01-0,025 nm, obecnymi głównie w cytoplazmie komórek roślin,
zwierząt oraz bakterii w ilości kilkudziesięciu tysięcy w każdej z nich. Rybosom
składa się z dwóch podjednostek: małej i dużej, z których każda jest kompleksem
rybosomowych RNA (rRNA) i wielu białek rybosomowych. Jednym ze sposobów
odróżnienia rybosomów od ich podjednostek jest umieszczenie próbki w probówce
rotora i odwirowanie jej z dużą szybkością. Powoduje to rozdzielenie frakcji mikrosomowej, jądrowej i mitochondrialnej.
Szybkość sedymentacji jakiejkolwiek cząsteczki jest wprost proporcjonalna do
sił grawitacyjnych (sił odśrodkowych działających podczas wirowania). Stała sedymentacji zależy wyłącznie od kształtu, wielkości oraz gęstości cząstki i jest niezależna od siły odśrodkowej. Stałą sedymentacji mierzy się zwykle w jednostkach
Swedberga (S).
Elipsoidalno-kulisty kształt i rybonukleoproteinowa budowa rybosomów wyodrębnionych z różnych źródeł są podobne, ale na podstawie stałej sedymentacji dzieli się je na dwie klasy: 70S i 80S. Pierwsze z nich zbudowane z podjednostek o stałej sedymentacji 50S i 30S występują w organizmach prokariotycznych, a także
w jądrach, mitochondriach i chloroplastach eukariotów. Rybosomy o stałej sedymentacji 80S, złożone z podjednostek 60S i 40S, zlokalizowane są w cytoplazmie
zwierząt i roślin wyższych. Charakteryzują się stabilnością w środowisku zawierającym jony Mg2+w stężeniu do 0,001M. Wraz ze wzrostem stężenia Mg2+ do
0,01M ulegają dimeryzacji lub agregacji. Przy zmniejszeniu stężenia Mg2+ do
0,0001M dysocjują na podjednostki 70(80)S ⇔ 30(40)S + 50(60)S. Proces dysocjacji i powtórnej asocjacji podjednostek rybosomów kontrolują poliaminy poprzez
zmianę stężenia innych dwuwartościowych kationów.
Rybosomy są zbudowane w niemalże równych ilościach z RNA i białka, ale
proporcje obu składników zmieniają się w zależności od ich rodzaju (tabela 7.1)
z tendencją do zwiększenia zawartości określonego białka.
Tabela 7.1. Skład rybosomów
Rodzaj rybosomu
Subcząstki rybosomu
RNA
Ilość białek
Masy cząsteczkowe białek w tys. Da
Proporcje RNA/białko, %
70S
80S
30S
50S
40S
60S
16S
21
12-65
37/63
23S i 5S
34
9-31
36/64
18S
31
10-44
54/46
28S, 5S i 5,8S
41
10-54
41/59
Oprócz białek i kwasów nukleinowych w składzie rybosomów wykrywane są
także w śladowych ilościach jony Mg2+i Co2+ , di- i poliaminy, kationy (Fe3+, Zn2+,
Al3+, Ba2+, Sr2+, Ni2+, Cr2+, NH4+) oraz latentna rybonukleoza.
W komórkach rybosomy ulegają hydratacji. Przyjmuje się, że na 1 g suchej masy rybosomów z retikulocytów przypada około 2,7 g wody hydratacyjnej. Dowodzi
246
Podstawy biochemii
to wyjątkowo wysokiej „porowatości” tych struktur. Białko i RNA w cząsteczkach
rybosomów połączone są słabymi wiązaniami, które ulegają zerwaniu w roztworach soli odpowiadających stężeniu od 0,5 do 1M. Analogiczna dysocjacja ma
miejsce podczas elektroforezy w środowisku zasadowym (pH 12). Oddziaływanie
białek z kwasami nukleinowymi rybosomów ma charakter elektrostatyczny. Wysoka sumaryczna zawartość aminokwasów kwaśnych o wysokim ładunku dodatnim (12% lizyny, 11% argininy i 3% histydyny) przy jednoczesnym dużym udziale
naładowanych ujemnie reszt fosforanowych sprzyja tworzeniu wymaganej ilości
wiązań jonowych.
Mechanizm biosyntezy peptydów. Enzymatyczny mechanizm biosyntezy peptydów zaproponowany został przez F. Lipmana i współpracowników (1968). Kolejne
badania wykazały, że co najmniej 5 antybiotyków pochodzenia peptydowego, tj.
gramicydyna, tyrocydyna, bacytracyna, cyklosporyna i mykobacylina, syntetyzowane są bez udziału kwasów nukleinowych i tRNA, przy czym zachowany jest
prawidłowy układ aminokwasów wyznaczających pierwszorzędową strukturę tych
oligopeptydów.
Biosynteza gramicydyny S przebiega z udziałem kompleksu enzymatycznego,
składającego się z dwóch frakcji białkowych o masach cząsteczek 280.000
i 100.000 D. Uzyskuje się je drogą rozdziału ekstraktu białkowego Bacillus brevis,
stosując filtrację żelową na sefadeksie G-200. Łączenie obu frakcji w obecności
aminokwasów, ATP i jonów Mg2+ umożliwia syntezę in vitro cyklicznego dekapeptydu – gramicydtny S (rys. 7.7).
Lekka frakcja białkowa (100.000 D) izomeryzuje i aktywuje D-fenyloalaninę,
natomiast ciężka (280.000 D) aktywuje 4 pozostałe L-aminokwasy. Enzymatyczna
aktywacja aminokwasów zachodzi poprzez utworzenie aminoacyloadenylanów
wymienionych aminokwasów (wg reakcji między wolnymi aminokwasami i ATP
z wydzieleniem pirofosforanu) (etap pierwszy). W drugim etapie zachodzi przeniesienie grup aminoacylowych z aminoacyloadenylanów na grupę SH reszty cysteiny
obecnej w łańcuchu polipeptydowym tego samego enzymu, z utworzeniem tioestrów aminokwasów. Frakcja lekka, zawierająca D-fenyloalaninę z aktywowaną
grupą COOH, po połączeniu z frakcją ciężką, zawierającą aktywowane aminokwasy (L-prolinę, L-walinę, L-ornitynę i L-leucynę), inicjuje biosyntezę wiązań peptydowych między wymienionymi aminokwasami w kolejności odpowiadającej ich
ułożeniu w cząsteczce gramicydyny S. Bezpośrednie przeniesienie reszty
D-fenyloalaniny na grupę aminową reszty L-proliny, połączonej wiązaniem tioestrowym z podjednostką ciężkiej frakcji białkowej, realizowane jest za pośrednictwem białka aminoacylującego (BAA), które występuje w kompleksie enzymatycznym. Posiada ono masę cząsteczkową równą około 20.000 D i zawiera pantoteinę jako grupę prostetyczną:
Rozdział 7. Przemiana białek
BAA
CO
OH
CH O
P
NH
O
247
CH3
O
CH2
C
CH
CO
NH
CH2
CH2
CO
NH
CH2
CH2
SH
CH3 OH
Początkowo reszta D-fenyloalaniny przeniesiona zostaje na grupę SH pantoteiny, a następnie na grupę NH2 L-proliny. W ten sposób powstaje pierwsze wiązanie
peptydowe w budowanej cząsteczce gramicydyny. W kolejnej fazie reszta dipeptydu D-Phe-L-Pro przenoszona jest z wiązania tioestrowego (wraz z podjednostką
ciężkiej frakcji białkowej) na grupę SH pantoteiny BAA i z niej na grupę NH2 reszty waliny. Reakcja powtarzana jest do momentu, w którym zostanie zsyntetyzowany pentapeptyd D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu (zob. rys. 7.6). Ponieważ w tym samym
czasie na ułożonym obok identycznym kompleksie enzymatycznym syntetyzowany
jest dodatkowy pentapeptyd, po zakończeniu tego procesu ulegają one połączeniu
według schematu „głowa do ogona” i tworzą cząsteczkę cyklicznego dekapeptydu
gramicydyny S (rys. 7.7).
Podobnie przebiega biosynteza tyrocydyny, kolejnego antybiotyku o budowie
peptydowej
D-Phe – Pro – Phe –D-Phe – Asn
|
|
Leu – Orn – Val – Tyr – Gln
Kompleks enzymatyczny syntetyzuje cykliczny dekapeptyd, tworząc kolejno 10
wiązań peptydowych. W skład kompleksu wchodzą trzy frakcje białkowe:
1) M = 100.000 D (izomeryzuje i aktywizuje D-fenyloalaninę); 2) M = 230.000 D
(aktywuje L-prolinę); 3) M = 460.000 D (aktywuje D-fenyloalaninę, asparginę, glutaminę, tyrozynę, walinę, ornitynę, leucynę, a także izomeryzuje fenyloalaninę).
Ostatnio udowodniono, że z udziałem kompleksu enzymatycznego przebiega
biosynteza mykobacyliny, cyklicznego peptydu złożonego z 13 aminokwasów oraz
bacytracyny A i cyklosporyny A, które zbudowane są z 11 aminokwasów.
Opisany powyżej pozarybosomowy system syntezy charakterystyczny dla wyżej wymienionych krótkich peptydów jest prawdopodobnie pierwotny ewolucyjnie
w porównaniu z mechanizmem biosyntezy białek, zlokalizowanym na rybosomach,
w którym podstawową rolę odgrywa proces translacji.
Kod genetyczny jest zestawem reguł, które określają sposób, w jaki sekwencja
nukleotydów w mRNA zostaje przetłumaczona na sekwencję aminokwasów w polipeptydzie.
W jaki sposób informacja zapisana w postaci czterech zasad, wchodzących
w skład mRNA (A – adenina, G – guanina, C – cytozyna i U – uracyl), może być
tłumaczona na sekwencję łańcuchów polipeptydowych składających się z 20 aminokwasów?
248
Podstawy biochemii
Rys. 7.7. Enzymatyczny mechanizm biosyntezy fragmentu cząsteczki gramicydyny S
(objaśnienie w tekście)
Jeśli każdej kombinacji nukleotydów w mRNA przypisać zdolność kodowania
jednego aminokwasu w łańcuchu białkowym, to kodon w postaci dupletu (2 nukleotydów) dawałby tylko 42 możliwych kombinacji nukleotydowych stanowiących
informację zaledwie o 16 aminokwasach (liczba par nukleotydów jest mniejsza od
liczby aminokwasów budujących białka). Kodony w postaci kwadrypletów
(44 możliwych kombinacji) mocno przewyższałyby liczbę aminokwasów. Tak więc
układ trzech nukleotydów (tryplet), dający 43 możliwych kombinacji, pozwala na
utworzenie 64 kodonów zdolnych zapisać informacje o sekwencji wszystkich syntetyzowanych białek.
Rozdział 7. Przemiana białek
Dupletowy kod
(42 = 16)
AA UU GG CC
AU UA GA CA
AG UG GU CU
AC UC GC CG
Trypletowy kod
(43 = 64)
AAA UUU GGG CCC
AAU UUA GGA CCA
UAA AUU AGG ACC
AUA UAU GAG CAC
AAG UUG GGU CCU
GAA GUU UGG UCC
AGA UGU GUG CUC
AAC UUC GGU CCG
CAA CUU CGG GCC
ACA UCU GCG CGC
AUG UAG GUA CUA
AGU UGA GUA CUA
AGC UAC GAC CAG
ACG UCA GCA CGA
AUC UGC GUC CUG
ACU UCG GCU CGU
249
Kwadrypletowy kod
(44 = 256)
AAAA UUUU GGGG CCCC
AAAU UUUA GGGA CCCA
itd.
Trypletowy charakter kodu genetycznego został udowodniony eksperymentalnie poprzez ustalenie składu jakościowego reszt nukleotydowych, wchodzących
w skład kodonów stanowiących informację o aminokwasach włączanych w łańcuch białkowy. Decydującą rolę w złamaniu kodu genetycznego odegrały doświadczenia Nirenberga (1961), polegające na syntezie polimerów nukleotydowych w układach pozakomórkowych, złożonych z cząsteczek kwasu poliurydynowego (poli U), rybosomów (pozbawionych mRNA), tRNA, syntetaz aminoacylotRNA, aminokwasów znakowanych izotopami 14C lub 15N oraz z ATP, GTP i jonów Mg2+, Mn2+. W układzie tym możliwe okazało się otrzymanie reszt fenyloalaniny. Dalsze badania z zastosowaniem syntetycznych matryc homo- i heteropolirybonukleinowych, otrzymanych za pomocą polinukleotydofosforylazy, umożliwiły
zakończenie prac zmierzających do ustalenia składu kodonów zawierających informację o wszystkich aminokwasach.
Kolejną kwestią wymagającą wyjaśnienia było przypisanie każdemu kodonowi
odpowiadającej mu sekwencji peptydowej, czyli określenie, jaka kolejność nukleotydów (np. ACU, CAU, UAC, AUC, CUA lub UCA) koduje dany aminokwas.
Odpowiedź na powyższe pytanie dały wyniki eksperymentów prowadzonych w laboratorium G. Korany, gdzie użyto syntetycznych m-RNA, zawierających trinukleotydy o znanych sekwencjach i wprowadzano je w pozakomórkowy układ syntetyzujący białko.
W rezultacie w końcu 1965 r. otrzymano pełne informacje na temat budowy kodu
genetycznego. Z tabeli 7.2 wynika, że 61 z 64 kodonów zawiera informacje o 20
aminokwasach budujących białka. Trzy pozostałe, tzn. UAA (ochre), UAG (amber)
i UGA (opal) nie kodują żadnego aminokwasu. Zwane są one kodonami terminacji
250
Podstawy biochemii
i rozpoznawane przez białkowe czynniki terminacyjne odpowiadają za zakończenie
syntezy łańcucha polipeptydowego.
Tabela 7.2. Kod genetyczny
Pierwsza
litera
kodonu
U
C
Druga litera kodonu
U
C
A
Phe
Phe
Leu
Leu
Ser
Ser
Ser
Ser
Tyr
Typ
Leu
Leu
Leu
Leu
Pro
Pro
Pro
Pro
Gis
Gis
Gln
Gln
G
Cys
Cys
Trzecia
litera
kodonu
Try
U
C
A
G
Arg
Arg
Arg
Arg
U
C
A
G
Pierwsza
litera
kodonu
A
G
Druga litera kodonu
U
Trzecia
litera
kodonu
C
A
G
Ile
Ile
Ile
Met
Tre
Tre
Tre
Tre
Asn
Asn
Liz
Liz
Ser
Ser
Arg
Arg
U
C
A
G
Val
Val
Val
Val
Ala
Ala
Ala
Ala
Asp
Asp
Glu
Glu
Gli
Gli
Gli
Gli
U
C
A
G
Szczegółowe prace prowadzone nad zapisem informacji genetycznej pozwoliły
na ustalenie, że kod genetyczny ma charakter trójkowy, ciągły, niezachodzący,
zdegenerowany i uniwersalny.
Trójkowy charakter kodu genetycznego potwierdzony został szeregiem eksperymentów, wśród których najistotniejsze znaczenie miało: zestawienie liczby mutacji
w genomie fagu T4 z pojawieniem się mutantów i ich rewersji do wyjściowego fenotypu po działaniu czynników mutagennych (F. Crick); określenie minimalnej długości fragmentu kwasu oligourydynowego zdolnego do związania fenyloalaniny-tRNA
(M. Nirenberg); zsyntetyzowanie matryc oligorybonukleotydowych i zbadanie ich
właściwości kodujących w układach pozakomórkowych (G. Khorana); przeanalizowanie wymiany aminokwasów w białkach homologicznych (G. Vittman).
Wzajemne oddziaływanie trypletów nukleotydów (kodonów) w mRNA z trypletami nukleotydów (antykodonów) w tRNA, decydujące o wiązaniu odpowiedniego aminoacylo-tRNA z rybosomem, może dopuszczać sytuację, w której ten
sam aminokwas kodowany jest przez więcej niż jeden kodon. Okazuje się, że istotne znaczenie dla kodowania aminokwasu mają tylko dwie z trzech reszt nukleotydowych w kodonie (Lagerkwist, 1978), a w przypadku kodonów różniących się
tylko trzecią literą możliwe jest odczytywanie tych samych aminokwasów
(tab. 7.2). Zjawisko to wyjaśnia hipoteza tolerancji (wobble hypothesis), zgodnie
z którą pierwsza zasada w antykodonie (koniec 5’) może tworzyć niespecyficzne
wiązania z trzecią zasadą kodonu (koniec 5’), w następstwie czego jeden aminokwas może być rozpoznawany przez więcej niż jeden kodon.
Obecnie przyjmowana jest także hipoteza dwa z trzech, przedstawiająca kod
genetyczny jako kwazidupletowy (umownie – pozornie dupletowy).
Ciągłość kodu genetycznego wynika z faktu, że wszystkie kodony mRNA odczytywane są bez żadnych przerw, a ich kolejność wyznacza kolejność aminokwasów w syntetyzowanym łańcuchu polipeptydowym.
Rozdział 7. Przemiana białek
251
Niezachodzący charakter kodu genetycznego polega na tym, że żaden nukleotyd
jednego kodonu nie jest składową częścią ani poprzedzającego, ani następnego.
Zdegenerowanie kodu genetycznego określa możliwość kodowania jednego aminokwasu przez więcej niż jeden kodon. Jak wynika z tabeli 7.2, za syntezę leucyny
i argininy odpowiada sześć różnych kodonów. Większość aminokwasów kodowana
jest przez dwa lub cztery kodony, a tylko metionina i tryptofan przez pojedyncze.
Uniwersalność kodu genetycznego to jego powszechny charakter u wszystkich
organizmów żywych, jakkolwiek zmiany w porównaniu z kanonem przedstawionym w tabeli 7.2 spotykane są w mitochondriach, gdzie AUA koduje metioninę,
UGA tryptofan, a AGA i AGG są kodonami terminacyjnymi. Podobną sytuację
obserwować można u organizmów prokariotycznych, u których za inicjację syntezy łańcucha polipeptydowego odpowiadają AUG i GUG.
Do wymienionych pięciu właściwości kodu genetycznego należy dodać jeszcze
wspominaną powyżej obecność kodonów inicjacyjnych i terminacyjnych, układ
seryjny (patrz serie kodonów w tabeli 7.2), symetryczność (obrót o 180° nie narusza układu silnych i słabych zasad), zgodność składu i położenia zasad w kodonie
z polarnością i rozmieszczeniem aminokwasów, oraz jednoznaczność (jeden kodon
odpowiada jednemu aminokwasowi).
Czy zawsze kodowanie odbywa się z absolutną dokładnością i czy może zachodzić włączenie aminokwasu w łańcuch polipeptydowy niezgodnie ze strukturą kodonu? Uważa się, że określony poziom błędnego kodowania aminokwasów jest zaprogramowany ewolucyjnie. Mutacje powodujące zmiany w kodonach w mRNA, zgodnie z hipotezą tolerancji, nie muszą powodować zmian w procesie translacji („kłamstwo uświęcone szlachetnym celem”). Nieprawidłowe włączanie aminokwasów
w łańcuch polipeptydowy obserwowano w warunkach doświadczalnych podczas
syntezy peptydów w systemach pozakomórkowych. Na poli(U) podczas syntezy
fenyloalaniny włączana była również leucyna i izoleucyna oraz w mniejszej ilości
seryna, tyrozyna i walina. Przyczyną syntezowania dodatkowych aminokwasów
może być kwazidupletowość (dwa z trzech) kodu genetycznego i możliwość ograniczonej zgodności kodonu z antykodonem w procesie translacji. Poziom błędnego
kodowania wzrasta przy zwiększaniu stężenia putrescyny, sperminy, etanolu w środowisku Mg2+ oraz w warunkach obniżonego pH i temperatury inkubacji. W warunkach fizjologicznych poziom kodowania aminokwasów nieodpowiednich dla antykodonu ma zakres od 10-4 do 10-3. Konsekwencją tych zmian może być zwiększenie różnorodności syntetyzowanych białek i wzrost tolerancji komórki na przeżywanie w niekorzystnych warunkach.
Badania ostatnich lat zwracają uwagę na szczególny rodzaj syntezy białek pojawiających się w organizmie w odpowiedzi na infekcje i odpowiadające im procesy
patologiczne. Według B.A. Korduma, w takich przypadkach synteza białek może
mieć charakter samoodtwarzania się struktur przestrzennych łańcuchów polipeptydowych, przebiegając bez udziału kwasów nukleinowych i prowadząc do ich syntezy, akumulacji i aktywności w wyznaczonym procesie w wyniku samopowielenia.