Przeciwciała monoklonalne w diagnostyce

Przeciwciała monoklonalne w
diagnostyce
Immunodiagnostyka
Problemy:
• Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne –
cechy charakterystyczne i różnice, w
kontekście zastosowań w diagnostyce
• Metody otrzymywania, modyfikacje
• Testy – techniki laboratoryjne
• Zastosowanie w diagnostyce
Immunodiagnostyka
Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne mogą być
stosowane w testach mających za zadanie:
o identyfikację
o oznaczenie ilościowe
o lokalizację
molekuł lub komórek (własnych lub obcych).
Zastosowanie w medycynie i medycynie
weterynaryjnej w dziedzinach:
• mikrobiologia
• immunologia
• hematologia i transfuzjologia
• patofizjologia
• histopatologia
• medycyna sądowa
Przeciwciała monoklonalne i
poliklonalne
Immunoglobuliny, białka wytwarzane przez w
pełni zróżnicowana limfocyty B – plazmocyty
Zdolne do swoistego wiązania z antygenem
http://www.bu.edu/research/news-events/research-magazine/2009-toc/features/research-realized/
Otrzymywanie przeciwciał polii monoklonalnych
Otrzymywanie przeciwciał
poliklonalnych
Miano
przeciwcia
ł
Wspólne
miano
Pierwszy kontakt z
antygenem
Drugi kontakt z
antygenem
Veterinary immunology. 9th edn. Edited by IR Tizard. Elsevier, St Louis, 2013
Przeciwciała poliklonalne c.d.
www.slideshare.net-
Przemysłowa produkcja przeciwciał
monoklonalnych
www.sciencephoto.com
Przeciwciała monoklonalne (MAbs)
• Wytwarzane przez nieróżnicujące się,
stanowiące jeden klon limfocyty B
• Rozpoznają tylko jedną determinantę
antygenową
• Produkcja jest znacznie bardziej skomplikowana
i droższa
• Stosowane, gdy wymagana jest wysoka
specyficzność i powtarzalność reakcji z
antygenem
Zalety MAbs
• Można ich używać w bardzo niskich stężeniach
• Umożliwiają odróżnienie minimalnie różniących się
antygenów (zmiana jednego aminokwasu)
• Pozwalają na wykrywanie modyfikacji antygenu
(utlenianie, fosforylacja itp.)
• Umożliwiają odróżnienie izoenzymu czy proenzymu od
enzymu, białka prawidłowego od nowotworowego,
szczepów bakterii czy mutacji wirusów
Wady stosowania MAbs w
diagnostyce
• Niska zachłanność (awidność, siła wiązania
poliwalentnego antygenu z kilkoma paratopami
przeciwciała)
• Stąd ograniczone zastosowanie w immunoprecypitacji i
aglutynacji
• Mogą rozpoznawać dwa antygeny na których jest obecny
ten sam epitop
Przeciwciała monoklonalne w
diagnostyce
• Najczęściej stosowane są przeciwciała mysie
• Stosowane do identyfikacji cząsteczek docelowych
i ekspresji białek w tkankach lub na poziomie
komórki
• Stosowane do wykrywania i określania stężeń leków,
hormonów, enzymów – nawet w bardzo niskich
stężeniach.
• Usprawniają diagnostykę chorób zakaźnych
Immunokoniugaty
Funkcje efektorowe MAbs można
wzmacniać przez wiązanie z:
• Radioizotopami
przydatne w diagnostyce
• Enzymami
• Fluorochromami
• Lekami
• Toksynami
Antibody conjugates can be generated by:
targeting natural amino acids (1)
interchain disulfides (2),
ngineered cysteines (3),
non-natural amino acids (4),
the carbohydrate moiety (5),
the N-terminus of heavy and light chain (6)
engineered tags (7).
Strong protein-protein interaction, i.e., Fc-binding domains
(FcBD) can be used to form non-covalent antibody
conjugates (8).
Additionally, the nucleotide binding site (NBS) is a valuable
antibody modification site for photoaffinity labeling (9) and
antibodies with catalytic activity (10) can be exploited to
form bioconjugates where the coupled pharmacophore,
e.g., a peptide assumes the targeting function and the
antibody acts as a cargo molecule.
Antibody Conjugates: From Heterogeneous Populations to Defined Reagents Patrick Dennler 1, Eliane Fischer 1 and Roger Schibli 1,2,*
Toxins2011, 3(7), 848-883; doi:10.3390/toxins3070848
Koniugaty z fluorochromami
Fluorochromy - przykłady
pochodne fluoresceiny (np. FITC), Cy2,
AlexaFluor 488
pochodne rodaminy (np. TRITC), Cy3, Texas
Red, AlexaFluor 555
pochodne kumaryny (np. AMCA), AlexaFluor
405
Cy5, AlexaFluor 647 – emisja
w widmie podczerwieni
Koniugat MAb z fluorochromem
Schematic diagram of conjugation. Latex was
conjugated with glutaraldehyde and antibody by
forming amide bonds in biocarbonate buffer (pH
8.5) (a-d).
Theranostics 2014; 4(12):1239-1249. doi:10.7150/thno.10255
Fluorescence absorption
and emission spectra
Koniugaty z radioizotopami
a. monoclonal antibody conjugated directly to radionuclide.
b. antibody-streptavidin (Ab-SA) conjugates, followed by radiolabelled DOTA-biotin. The
tetrameric streptavidin molecule can bind four radio-DOTA-biotin moieties, amplifying tumourtargeted radioactivity.
c. Bispecific antibody pre-targeting for RIT using radiolabelled bivalent haptens and affinity
enhancement system.
d. Pre-targeting using antibodies conjugated to an antisense phosphorodiamidate morpholino
oligomer (MORF) oligonucleotide followed by administration of a radiolabelled
http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n6/fig_tab/nrc3925_F4.html
complementary c-MORF oligomer.
Koniugaty z enzymami
Stosowane enzymy
peroksydaza chrzanowa (HRP)
alkaliczna fosfataza (AP)
oksydaza glukozowa (Aspergillus niger)
b-galaktozydaza (E. coli)
Chromogeny
alkaliczna fosfataza
new fuchsin
fast red
peroksydaza chrzanowa
3,3’diaminobenzydyna (DAB)
3amino-9etylokarbazol (AEC)
4chloro-1naftol (CN)
Nature Biotechnology 23, 1147 - 1157 (2005)
Testy diagnostyczne z zastosowaniem
MAb
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Testy radioimmunologiczne
Western blotting
Cytometria przepływowa
Immunohistochemia
Mikromacierze białkowe
Immunoprecypitacja
Immunodyfuzja
Immunoelektroforeza
Immunofiksacja
Aglutynacja
Test komplementacji
Wybór testu dla celu molekularnego
Immunoprecipitacja
• Precypitacja tyko przy
właściwej proporcji
antygen-przeciwciało
• Pozwala na ilościowe
oznaczanie przeciwciał
• Stosowany np. w
diagnostyce chorób
zakaźnych
Immunodyfuzja
Testy aglutynacji
Aglutynacja –”wykłaczanie” (clumping)
Test aglutynacji lateksowej
okrągłe cząstki opłaszczone przeciwciałem
(antygenem) zlepiają się (aglutynują) w
obecności antygenu (przeciwciała), a efekt
jest widoczny gołym okiem lub przy użyciu
nefelometru (jak podczas hemaglutynacji
niezgodnych grupowo krwinek)
Test komplementacji
Nowoczesne metody diagnostyczne, immunodiagnostyka, dr hab. B. Krawczyk
Test immunoenzymatyczny
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA)
•
Metoda wykrywania antygenów patogennych we krwi i
innych płynach ustrojowych
•
Umożliwia analizę dużej liczby próbek w tym samym czasie
•
Metoda diagnostyki serologicznej
•
Test bardzo czuły
•
Metoda relatywnie prosta
•
Można ją zautomatyzować
•
Istnieje kilkadziesiąt odmian
Wykonanie
• Testy ELISA standardowo wykonywane są na polistyrenowych
lub pleksiglasowych, 96-dołkowych płytkach
• Płytkę opłaszcza się odpowiednim antygenem lub
przeciwciałem.
• Reakcję antygen-przeciwciało uwidacznia enzymatyczna
reakcja barwna.
• Najczęściej stosowane enzymy to:.
- fosfataza alkaliczna (przekształca bezbarwny fosforan
p-nitrofenolu w żółty p-nitrofenol),
- peroksydaza chrzanowa (daje niebieskie zabarwienie
w obecności tetrametylobenzydyny),
- oksydaza glukozowa (z kwasem 5-aminosalicylowym daje
kolor brunatny).
• Zmiana barwy roztworu mierzona jest spektrofotometrycznie.
Najczęściej stosowane wersje testu Elisa
bezpośredni
pośredni
„sandwich”
Wszystkie wersje wymagają wyznaczonego enzymem
przeciwciała
https://www.thermofisher.com/
Test ELISA bezpośredni
.
1-opłaszczanie płytki antygenem.
2-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (połączonym z
enzymem).
3-inkubacja z odpowiednim substratem powodująca reakcję
http://metlab.pl/ELISA_(ang._enzyme-linked_immunosorbent_assay)_p28.html
Test ELISA- pośredni
1-opłaszczanie płytki antygenem.
2-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (o wysokim powinowactwie
do antygenu).
3-inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym.
4-inkubacja z odpowiednim substratem.
http://metlab.pl/ELISA_(ang._enzyme-linked_immunosorbent_assay)_p28.html
"Sandwich" ELISA
1-opłaszczanie płytki antygenem-przeciwciałem.
2-inkubacja z z badanym białkiem.
3-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (o wysokim powinowactwie
do badanego białka).
4-inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym.
5-inkubacja
z odpowiednim substratem powodująca reakcję.
http://metlab.pl/ELISA_(ang._enzyme-linked_immunosorbent_assay)_p28.html
Kompetycyjny test ELISA
 W kompetycyjnych (rywalizacyjnych) testach ELISA (c-ELISA, z ang.
competitive ELISA) wykorzystuje się współzawodnictwo o miejsca wiązania
na antygenie mieszaniny różnych przeciwciał. W schemacie doświadczenia
wyróżnia się metodę pośrednią oraz bezpośrednią (z wykorzystaniem
wyznakowanych enzymem przeciwciał pierwszorzędowych).
Western blotting
 Metoda złożona
 Bardzo specyficzna
 Wykorzystywana jako ostateczne potwierdzenie diagnozy:
• w diagnostyce chorób bakteryjnych, jak borelioza wywoływana
przez krętka Borelia burgdorferi, gruźlica wywoływana przez prątki
Mycobacterium tuberculosis,
• w diagnostyce zakażeń wirusami, jak np. HIV, koronawirus wywołujący
SARS czy wirus HSV będący czynnikiem etiologicznym opryszczki ,
• w diagnostyce niektórych chorób pasożytniczych, jak wągrzyca
spowodowana przez larwy tasiemca uzbrojonego,
•
w diagnostyce chorób genetycznych, jak pewne formy niedokrwistości
Fanconiego.
• Dane literaturowe wskazują, że możliwe jest również zastosowanie tej
techniki w diagnostyce nowotworów.
Western blotting
1. Rozdrobnienie próbki do uzyskania
zawiesiny białek
2. Rozdział białek - elektroforetyczny w
żelu poliakrylamidowym
3. Rozdzielone białka są przenoszone na
trwałe podłoże (np. nitroceluloza)
4. Błona zanurzona w roztworze
zawierającym określone „czyste”
przeciwciała
5. Odpłukanie niezwiązanych z antygenem
przeciwciał
6. Zanurzenie błony w roztworze
zawierającym skoniugowane np. z
enzymem przeciwciała rozpoznające
fragmenty Fc przeciwciał związanych z
antygenem
7. W przypadku znakowania enzymem
używa się substratów dających barwny,
nierozpuszczalny produkt osadzający się
na membranie lub luminescencję.
https://www.thermofisher.com
Western blot –bezpośrednia metoda
1.
2.
3.
4.
5.
Rozdrobnienie próbki do uzyskania
zawiesiny białek
Rozdział białek - elektroforetyczny w
żelu poliakrylamidowym
Rozdzielone białka są przenoszone
na trwałe podłoże (np. nitroceluloza)
Błona zanurzona w roztworze
zawierającym określone przeciwciała
skoniugowane np. z enzymem
W przypadku znakowania enzymem
używa się substratów dających
barwny, nierozpuszczalny produkt
osadzający się na membranie lub
luminescencję.
Cytometria przepływowa
 Metoda wykrywania antygenów powierzchniowych przez
immunofenotypowanie
 Wykorzystane MAbs wyznakowane fluorochromami
(FITC, PE)
 Przeciwciała rozpoznają epitopy np. komórek krwi
 Zawiesinę komórek analizuje się ilościowo przy użyciu
cytometru przepływowego
Cytometr „zasysa” komórki układające się w
liniowy strumień
Wiązka laserowa wzbudza fluorescencję
Detektor określa wielkość i ziarnistość
komórek wyznakowanych przeciwciałami
e-biotechnologia. pl
Immunofenotypowanie
Cytometria przepływowa
 Zastosowanie
 W hematologii: umożliwia określenie fenotypu komórek
białaczkowych lub chłoniaków
 W chorobach zakaźnych: np. określa zaawansowanie AIDS
 W diagnostyce niedoborów immunologicznych
 Możliwe jest wykrywanie antygenów wewnątrzkomórkowych
- po permeabilizowaniu komórek
Immunohistochemia
Metody immunohistochemiczne
• dzięki wykorzystaniu swoistych przeciwciał
pozwalają na identyfikację w materiale
histologicznym specyficznych białek
(antygeny)
• dzięki czułym metodom detekcji umożliwiają
rozpoznanie bardzo małych ilości antygenu
Immunohistochemiczna metoda identyfikacji
komórek CD133+ w glioblastoma
yadda.icm.edu.pl
Immunohistochemia
• Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem
zlokalizowanym w komórce czy tkance możliwe jest jedynie pod
warunkiem odpowiedniego znakowania przeciwciała
• Przeciwciała mogą być znakowane:
• Fluorochromami – metoda immunofluorescencji, barwniki
fluorescencyjne, preparat ogląda się w mikroskopie
fluorescencyjnym (czerwień teksańska TR - czerwona
fluorescencja)
• Enzymami – metody immunoenzymatyczne, preparat ogląda się
w mikroskopie świetlnym lub elektronowym (peroksydaza,
fosfataza zasadowa)
• Metalami – preparat ogląda się w mikroskopie elektronowym ferrytyna (białko zawierające żelazo), koloidalne złoto
(mikroskopijne ziarenka metalicznego złota, widoczne w
mikroskopie w postaci kontrastowych czarnych punktów)
Immunohistochemia c.d.
•
•
•
•
Pobrana tkanka jest zamrożona lub utrwalana
blog.ptglab.com
Utrwalana tkanka jest zatapiana w parafinie i cięta mikrotomem
Skrawki są „przyklejane do szkiełek mikroskopowych
Przeprowadzana jest inkubacja z przeciwciałami, najczęściej
skoniugowanymi z enzymami
• Po odpłukaniu przeciwciał do preparatu dodawane są substraty
enzymów
• Strąt barwnika pozostaje w miejscu w którym znajdował się antygen
Produkt reakcji chemicznej musi spełniać dwa podstawowe warunki:


Musi być widoczny w obrazie mikroskopowym
Powinien być nierozpuszczalny w środowisku reakcji
Końcowa ocena reakcji histochemicznych odbywa się
przy użyciu wszystkich typów mikroskopów świetlnych
i elektronowych.
Wizualizacja sieci mikrotubul w komórkach nerki. Przeciwcialo I-rzędowe
wyznakowane barwnikiem Alexa 486, co umożliwia wybarwienie tubuliny, a
przeciwciało II-rzędowe wyznakowane barwnikiem Alexa 546, co umożliwia
wybarwienie aktyny.
Radioimmunmologia (RIA)
Metody radioimmunologiczne (RIA) – izotopowe, oparte na
pomiarze radioaktywności substancji znakowanej izotopem
promieniotwórczym wchodzącej w skład reakcji antygenprzeciwciało.
Znakowaniu można poddać antygen lub przeciwciało.
Używa się izotopów: 125J, 131J oraz 14C, 3H, 99Tc, inne .
Do znakowania antygenów białkowych używa się jodu a do
związków drobnocząsteczkowych – trytu lub węgla.
Radioimmunmologia (RIA)
Protokół przypomina
kompetycyjny test ELISA
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/Radioimm
unoassay.html
RIA w diagnostyce nowotworów
(scyntygrafia)
1. Arcitumomab [CEA-Scan] –
przeciwciało przeciw antygenowi
karcynoembrionalnemu (CEA)
znakowane radioaktywnym
izotopem technetu (99Tc),
stosowane do diagnostyki raka jelita
grubego i odbytu (scyntygrafia).
2. 99Tc-Bectumomab
[LymphoScan] – stosowane w
radioimmunoscyntygrafii
chłoniaków nieziarniczych typu B
(NHL, ang. Non-Hodgkin Lymphoma).
3. Tecnemab – scyntygrafia
nawrotów czerniaka
4. OncoScint – wykrywanie raka
jelita grubego i jajnika
•
•
•
•
•
-
-
Przykłady zastosowania MAbs w
diagnostyce
Wczesne wykrywanie ciąży (1-2 tydzień)
Wykrywanie infekcji wirusowych i bakteryjnych np
HIV
Herpes
Grypa
Chlamydie
Streptokokki
Identyfikacja i charakteryzacja specyficznych
antygenów nowotworowych; klasyfikacja
nowotworów
Obrazowanie; np. lokalizacja nowotworów
Test wykrywający ciążę
Test oznacza gonadotropinę kosmówkową CG za pomocą
przeciwciał (3 rodzaje)
Rapid and Quantitative Detection of Zoonotic Influenza A
Virus Infection Utilizing Coumarin-derived dendrimer-based
Fluorescent Immunochromatographic Strip Test (FICT)
Theranostics 2014; 4(12):1239-1249.
doi:10.7150/thno.10255
Diagnostyka HIV