Ćwiczenie 4

Kierunek: TECHNOLOGIA ZYWNOŚCI I ŻYWIENIE CZOWIEKA
IV rok studiów, studia niestacjonarne
Ćwiczenia: GOSPODARKA ENERGETYCZNA, WODNA I ŚCIEKOWA
MIKROBIOLOGIA
Ćwiczenie 2.
Temat: Charakterystyka mikroorganizmów wodnych
Czas trwania: 1, 5 godz.
Część teoretyczna
1) Grupy organizmów wodnych
2) Charakterystyka mikroorganizmów wodnych (bakterie i grzyby)
Część praktyczna
1) Izolacja, hodowla i identyfikacja różnych grup fizjologicznych bakterii wodnych
2) Obserwacje mikroskopowe grzyba patogennego Candida albicans wyhodowanego na
podłożu sztucznym zestalonym agarem
Materiał: woda rzeczna i mul z dna rzeki, kliniczne hodowle grzyba drożdżopodobnego
Candida albicans;
1) Izolacja, hodowla i identyfikacja różnych grup fizjologicznych bakterii wodnych
A. Wykrywanie bakterii amonifikacyjnych
Azot występuje w wodach zanieczyszczonych i ściekach m.in. w postaci białka.
Bakterie amonifikacyjne są grupą drobnoustrojów heterotroficznych, mających
zdolność enzymatycznego rozkładu organicznych związków azotu, zwłaszcza
aminokwasów, z wytworzeniem amoniaku (dezaminacja).
Ich działalność w wodach powierzchniowych lub urządzeniach do biologicznego
oczyszczania ścieków świadczy o zachodzącej mineralizacji organicznych
połączeń azotowych.
Wykonanie oznaczenia:
1. Jałową pipetą (1cm3) zaszczepić nierozcieńczoną badaną wodą
probówki z pożywką dla amonifikatorów, w której jedynym źródłem
azotu jest pepton.
2. Po posiewie, w każdej probówce należy umieścić jałowy papierek
wskaźnikowy nasycony odczynnikiem Krupa.
3. Po włożeniu papierków zabezpieczyć korki z waty kapturkami z folii
aluminiowej i recepturkami.
4. Inkubować w temp. 26˚C przez 7 dni.
5. Aby stwierdzić obecność wytworzonego amoniaku, będącego
dowodem rozwoju bakterii amonifikacyjnych, bierze się pod uwagę
zmianę barwy papierka wskaźnikowego na kolor różowy lub
intensywnie czerwony oraz zmętnienie pożywki.
1
Kierunek: TECHNOLOGIA ZYWNOŚCI I ŻYWIENIE CZOWIEKA
IV rok studiów, studia niestacjonarne
Ćwiczenia: GOSPODARKA ENERGETYCZNA, WODNA I ŚCIEKOWA
MIKROBIOLOGIA
B. Wykrywanie bakterii denitryfikacyjnych
Bakterie denitryfikacyjne wykorzystują azotany jako akceptory wodoru
i elektronów, dzięki czemu redukują je enzymatycznie do azotynów, amoniaku, a
nawet wolnego azotu. Należą one do bezwzględnych lub względnie beztlenowych
heterotrofów. Przedstawicielami tej grupy są m.in. Thiobacillus denitryficans,
Pseudomonas fluorescens oraz Micrococcus denitryficans.
Azotany (NO3 –) są bezpośrednio użyteczne jako pożywka dla roślin wodnych.
Wysoki ich poziom może podwyższyć stopień eutrofizacji wody.
Wykonanie oznaczenia:
1. Przed wykonaniem posiewu należy rozpuścić zestalone w probówkach
podłoża bulionowe z azotanami i ułożyć w pólskosy.
2. Po zastygnięciu podłoża dokonać posiewu i inkubować w temp. 28˚C przez
7 dni.
3. Po okresie inkubacji na powierzchnię badanej hodowli nanieść 0,2-0,3 cm3
odczynnika Griessa
4. Czerwone zabarwienie występuje w ciągu 1-5 min. Oznacza wynik dodatni
i świadczy o obecności azotynów. Ujemny wynik testu nie zawsze
dowodzi nieobecności bakterii denitryfikacyjnych, gdyż redukcja
azotanów mogła już doprowadzić do powstania amoniaku lub nawet azotu
elementarnego. Potwierdzeniem takiego przypuszczenia jest zanik
azotanów dodanych do pożywki.
5. W celu sprawdzenia dalszej obecności lub braku azotanów, należy z
prób, w których stwierdzono ujemny wynik testu, przenieść do czystej,
porcelanowej parowniczki nieco zawartości probówki i dodać odrobinę
sproszkowanego cynku, Pojawienie się czerwonego zabarwienia świadczy
o obecności w pożywce nierozłożonych azotanów (potwierdzenie wyniku
ujemnego). Brak zabarwienia świadczy o wyniku dodatnim.
C. Wykrywanie bakterii asymilujących wolny azot
Bakterie asymilujące wolny azot są grupą heterotrofów wykorzystujących różne
substraty organiczne jako źródła węgla i energii: cukry, wyższe alkohole, skrobię
i kwasy organiczne. Źródłem azotu jest azot atmosferyczny, w związku, z czym
rosną one na pożywkach bezazotanowych. Bakterie te są przeważnie
bezwzględnymi tlenowcami. Przedstawicielami są m.in. Azotobacter i Azomonas
agilis.
Wody zawierające azot mogą być wykorzystywane do nawożenia.
Wykonanie oznaczenia:
1. Posiewać nierozcieńczone próbki (1 cm3) do probówek zawierających po
10 ml płynnego podłoża z mannitolem.
2. Inkubować w temp. 28-30˚C przez 7 dni.
3. Wyniki odczytywać na podstawie zmętnienia.
2
Kierunek: TECHNOLOGIA ZYWNOŚCI I ŻYWIENIE CZOWIEKA
IV rok studiów, studia niestacjonarne
Ćwiczenia: GOSPODARKA ENERGETYCZNA, WODNA I ŚCIEKOWA
MIKROBIOLOGIA
2) Obserwacje
mikroskopowe
grzyba
patogennego
wyhodowanego na podłożu sztucznym zestalonym agarem
Candida
albicans
Materiał: kliniczne hodowle grzyba drożdżopodobnego Candida albicans (wyrosłe na
podłożu wg Sabourauda);
Wykonanie oznaczenia:
1. W przypadku C. albicans wykonać barwienie fioletem krystalicznym. Na
odtłuszczonym szkiełku podstawowym wykonać rozmaz hodowli
badanych drobnoustrojów.
2. Preparat wysuszyć w powietrzu i utrwalić przeciągając szkiełko w
płomieniu palnika.
3. Powierzchnie preparatu zalać barwnikiem na 2 minuty. Po zlaniu fioletu
preparat płukać bieżącą wodą. Preparat po wysuszeniu bibułą oglądać pod
immersją.
Ocenę preparatu C. albicans przeprowadzić przy zastosowaniu
obiektywu immersyjnego mikroskopu.
Opisać wynik barwienia oraz morfologię komórek grzyba.
3