Oczyszczanie, trawienie i elektroforeza agarozowa DNA

ĆWICZENIE 11
Oczyszczanie, trawienie i elektroforeza agarozowa DNA plazmidowego
pBR322.
Materiały:
2 grzebienie silikonowe
tacka do wylewania żelu
aparat do elektroforezy
zasilacz prądu stałego
pipety automatyczne
mikrowrówka
kolba
zestaw do izolacji GF-1 Plasmid DNA Extraction Kit
endonukleaza restrykcyjna MspI
Odczynniki i bufory stosowane do elektroforezy agarozowej DNA:
ƒ
ƒ
ƒ
Agaroza do analitycznej elektroforezy kwasów nukleinowych
Woda 2x destylowana
Roztwór podstawowy bromku etydyny: 10 mg/ml
ƒ
Bufor TAE do elektroforezy agarozowej (50x stężony, skład na 1000 ml):
Tris
242 g
bezwodny kwas octowy
57.1 ml
KCl
500 mM
EDTA (pH 8.0) (roztwór 0.5 M)
100 ml
ƒ
Bufor TBE do elektroforezy agarozowej (10x stężony, skład na 1000 ml):
Tris
108 g
55 g
H3BO3
EDTA (pH 8.0) (roztwór 0.5 M)
40 ml
ƒ
Barwnik EndoRStop (5x stężony) - bufor do nanoszenia próbek na żel
Tris-HCl (pH 8.0)
100 mM
glicerol
30%
SDS
0.5%
EDTA (pH 8.0)
100 mM
błękit bromofenolowy
0.02%
ksylen cyjanu
0.02%
INSTRUKCJA DO WYKONANIA ĆWICZENIA:
A. Oczyszczanie DNA plazmidowego pBR322 za pomocą zestawu do izolacji GF-1
Plasmid DNA Extraction Kit.
1. Zwirować 1.5-5 ml nocnej (12-16 h) hodowli bakteryjnej przy ok. 6000 x g przez 2
minuty w probówce typu Eppendorf.
2. Dokładnie zawiesić osad bakteryjny w 250 µl buforu do zawieszania S1 poprzez
ostrożne pipetowanie. Przenieść zawiesinę do czystej probówki typu Eppndorf.
3. Dodać 250 µl buforu lizującego S2. Powoli mieszać zawartość, poprzez ostrożne
kilkukrotne (4-6 razy) odwracanie probówki, aż do uzyskania jednolitej zawiesiny.
Inkubować w temperaturze pokojowej lub w lodzie nie dłużej niż 5 min.
Uwaga 1: Zbyt intensywne mieszanie zawiesiny komórek z buforem lizującym powoduje
nieodwracalną denaturację części plazmidowego DNA oraz zanieczyszczenie plazmidu
fragmentami chromosomalnego DNA.
4. Dodać 400 µl buforu NB. Dokładnie i powoli mieszać zawartość probówki poprzez
kilkukrotne odwracanie (6-10 razy), aż do momentu pojawienia się białego
precypitatu.
5. Wirować w mikrowirówce przez 10 min z prędkością ok. 14000 – 16000 x g.
6. Wlać supernatant do minikolumny, znajdującej się w probówce odbierającej. Starać
się nie przenieść białego precypitatu. Narysować za pomocą markera kropkę na
powierzchni minikolumny, ułatwiającą późniejsze identyczne umiejscowienie
minikolumny w mikrowirówce podczas kolejnych etapów wirowania.
7. Wirować przez 1 min z prędkością 10000 x g.
8. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i powtórnie umieścić minikolumnę w probówce.
9. Dodać 700 µl buforu płuczącego Wash Buffer i wirować przez 1 min z prędkością
10000 x g.
10. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i powtórnie umieścić minikolumnę w probówce.
11. Wirować przez 1 min z prędkością 10000 x g w celu usunięcia resztek buforu
płuczącego.
12. Minikolumnę umieścić w nowej probówce typu Eppendorf 1.5-2 ml. Dodać 50-100 µl
buforu elucyjnego Elution Buffer.
Uwaga 1: Dodanie buforu eluującego centralnie na powierzchnię membrany zapewnia
uzyskanie maksymalnej wydajności odzysku DNA. Należy unikać dotykania ścianek
minikolumn mikropipetą, aby nie przenosić śladów DNA pomiędzy kolejnymi
minikolumnami.
13. Minikolumnę pozostawić na 1 min w temperaturze pokojowej.
14. Wirować minikolumnę przez 1 min z prędkością 10000 x g.
15. Usunąć minikolumnę, zamknąć probówkę. DNA jest gotowe do dalszych
analiz/manipulacji, może być przechowywane w 4oC lub zamrożone w -20oC.
B. Przeprowadzenie trawienia plazmidowego DNA pBR322 endonukleazą
restrykcyjną MspI.
1. Usunąć minikolumnę, zamknąć probówkę. DNA jest gotowe do dalszych
analiz/manipulacji, może być przechowywane w 4oC lub zamrożone w -20oC.
2. Przeprowadzić reakcję trawienia DNA odpowiednim enzymem restrykcyjnym
stosując 1-10 jednostek enzymu na 1 µg DNA w 30 µl mieszaniny reakcyjnej,
zachowując przy tym stężenie glicerolu na poziomie maksimum 5% w objętości
reakcji.
3. Trawienia przeprowadzić w odpowiednim buforze i temperaturze 37oC (w bloku
grzejnym) przez 1 godzinę.
4. Po zakończeniu inkubacji przerwać trawienie poprzez dodanie 3 µl buforu
EndoRStop i ogrzanie próbki w 55oC przez 5 minut. Przygotowane w ten sposób
próbki nanosić na żel agrozowy.
C. Przygotowanie żelu agarozowego w aparacie do elektroforezy horyzontalnej (DNAGdańsk).
1. Do szklanej kolby stożkowej albo okrągłodennej (250-500 ml) odważyć ilość agarozy
stosowaną do potrzebnego stężenia i objętości tacki do wylewania żelu. Należy
odważyć 1g agarozy do przygotowania 100 ml 1 % żelu.
2. Wlać do kolbki wymaganą objętość buforu do elektroforezy (1xTAE).
3. Zamieszać silnie zawartość kolbki i rozpuścić agarozę przez zagotowanie.
Najwygodniej jest użyć do tego celu kuchenki mikrofalowej, ale żel można również
ogrzewać przy pomocy zwykłego palnika laboratoryjnego lub płaszcza grzejnego.
Jeśli agaroza nie jest całkowicie rozpuszczona należy powtórzyć gotowanie.
UWAGA!
Upłynniony i rozgrzany żel agarozowy silnie kipi – oparzenia mogę być bardzo dotkliwe.
4. Schłodzić żel w temperaturze pokojowej do temperatury około 60oC.
5. Do schłodzonego żelu dodać roztworu bromku etydyny do stężenia 0.1 µg/ml i silnie
zamieszać (1µl 10 mg/ml roztworu EtBr na 100 ml żelu agarozowego).
UWAGA!
Bromek etydyny jest silnym kancerogenem. Unikać kontaktu ze skórą, przy pracy z
bromkiem etydyny używać rękawic gumowych.
6. Wylać żel na wcześniej przygotowaną i umieszczoną w lodówce tackę. Niezwłocznie
umieścić grzebień w żelu. W żelu nie powinno być żadnych pęcherzyków powietrza.
7. Po zastygnięciu żelu (około 20 minut) ostrożnie wyjąć grzebień, umieścić tackę z
żelem w naczyniu do elektroforezy i zalać żel buforem (1xTAE), tak aby żel był 2-3
mm pod powierzchnią buforu.
8. Próbki i wzorce masowe DNA zmieszać z odpowiednią ilością buforu obciążającego z
barwnikiem i nanieść na żel.
9. Rozwijać elektroforezę do uzyskania odpowiedniego rozdziału przy napięciu 120 V.
10. Obejrzeć żel na transiluminatorze UV, w przypadku niedostatecznego rozdziału
można kontynuować elektroforezę.
11. Wykonać dokumentację żelu.
D. Wyznaczanie wielkości otrzymanych fragmentów restrykcyjnych.
Za pomocą programu dostępnego na stronie http://rebase.neb.com (REBASE Tools;
Theoretical digest with all REBASE prototypes) wyznaczyć wielkości otrzymanych w
wyniku trawienia REazą MspI fragmentów restrykcyjnych DNA pBR322.
E. Wyznaczanie wielkości fragmentu PCR na podstawie wzorca DNA.
Na podstawie ustalonej według pkt. E długości fragmentów DNA wzorca (trawienia
pBR322/MspI) oszacować długość (pz) nieznanego fragmentu PCR.
SPRAWOZDANIE:
W sprawozdaniu z wykonanego ćwiczenia należy umieścić krótki wstęp teoretyczny. Podać
cel ćwiczenia i opisać poszczególne jego etapy. Przeprowadzić analizę żelu (umieścić zdjęcie
żelu wraz z opisem). Przeprowadzić dyskusję wyników i podać wnioski.
Dodatkowo w sprawozdaniu należy porównać efektywność rozdziału krótkich fragmentów
DNA w stosunku do wykonywanej w trakcie ćwiczenia 10 elektroforezy poliakrylamidowej
oraz porównać i przedyskutować sposób migracji różnych form DNA.