terapia genowa-nowa - Zakład Biologii Molekularnej

Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Zakład Biologii Molekularnej
Materiały do ćwiczeń z przedmiotu:
„TERAPIA GENOWA”
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Plan ćwiczeń
Ćwiczenie 1: Przygotowanie warsztatu terapii genowej
1. Kontrola jakościowa preparatów plazmidowych pAAV/LacZ, pAAV/GFP
Ćwiczenie 2: Transfer genów do komórek
1. Transfekcja komórek (HEK293; B16F10) kompleksami pAAV/LacZ:PEI oraz
pAAV/GFP:PEI
Ćwiczenie 3: Ekspresja transgenu
1. Badanie ekspresji genu wprowadzanego do komórek na plazmidzie pAAV
2. Badanie obecności sekwencji transgenu (GFP) z wykorzystaniem techniki PCR
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Ćwiczenie 1
Kontrola jakościowa preparatów plazmidowych pAAV/LacZ, pAAV/GFP:
1. Wirowanie hodowli bakteryjnej nocnej pAAV/LacZ (pAAV/GFP).
2. Izolacja plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych z wykorzystaniem
komercyjnego zestawu odczynników (Miniprep, Qiagen)
3. Cięcie enzymatyczne wyizolowanego plazmidowego DNArozdział
elektroforetyczny
Ad.1.
•
Pobrać po 2ml hodowli bakteryjnej (pAAV/LacZ; pAAV/GFP) do dalszej analizy
(miniprep);
•
•
•
Odwirować 2ml hodowli bakteryjnej: >8000 rpm, 3’ RT; odrzucić supernatant
Osad zawiesić w 250 µl buforu P1, przenieść do świeżego eppendorfa
Do probówki dodać kolejne 250 µl buforu P2, dokładnie wymieszać obracając
probówkę kilkukrotnie
Dodać 350 µl buforu N3 i wymieszać jak poprzednio
Zwirować: 13000rpm, 10min
Supernatant przenieść na kolumnę do wirowania (QIApreo spin kolumn)
Zwirować 1’, odrzucić przesącz
Przepłukać kolumnę 0,75ml buforu PE i wirować przez 1’
Odrzucić przesącz, kolejne wirowanie: 1’ 13000rpm
W celu wyeluowania pDNA kolumnę przenieść do nowego eppendorfa, delikatnie
nakroplić na nią 50 µl H2O, pozostawić na 1-5’ na blacie, zwirować (1’)
Ad.2.
•
•
•
•
•
•
•
Ad.3.
Objętość reakcyjna: 20 µl
Stężenie wyjściowe pDNA(pAAV/LacZ):
Do reakcji: 1-2 µg pDNA
Bufor reakcyjny 10X 1X
Enzym restrykcyjny:10U/µl/reakcję
Wielkość fragmentów po cięciu:
Ø
Bufor
2 µl
Cięcie
enzymatyczne
2 µl
NotI
-
1 µl
H2O
pDNA
•
•
•
Inkubacja mieszaniny reakcyjnej przez 1h, 37 oC
Przygotowanie 1,8% żelu agarozowego (2,52 g agarozy/140 ml buforu 1X TBE (Trisacetate); podgrzać w mikrofalówce do momentu uzyskania klarownego roztworu, co
jakiś czas mieszając zlewkę z płynem; dodać BrEt (5 µg/µl5 µg/ml); przelać roztwór
do saneczek elektroforetycznych, pozostawić żel do zastygnięcia)
Elektroforeza agarozowa: nałożyć po 10 µl/studzienkę mieszaniny reakcyjnej
zmieszanej z obciążnikiem (2 µl) + marker wielkości w ilości 4 µl ( na pierwszą z
brzegu studzienkę); 30-40min, 100V; po wskazanym czasie żel sprawdzić
podświetlając go promieniami UV
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Ćwiczenie 2
Transfekcja komórek (HEK293; B16F10) kompleksami pDNA:PEI
Protokół opisuje ilości na 1 (6cm) płytkę;
PEI=polietylenoimina
Wyjściowe stężenie PEI 10X (rozcieńczyć w wodzie do 1X)
Stężenia plazmidów pAAV/LacZ st.:
pAAV/LacZ st
pAAV/GFP:
współczynnik kompleksowania R= µl PEI/µg DNA (R=2)
•
•
•
•
•
Przygotować mieszaninę PEI (0,1X) z NaCl:
20 µl 1X PEI + 100 µl NaCl
Przygotować mieszaninę pDNA w NaCl;
10 µg (?µl) pDNA dopełnić do 120 µl NaCl
Dodać („kropla po kropli”) mix PEI do mixu pDNA, delikatnie wymieszać, 20-30min
37 oC
Zmienić pożywkę na płytkach z komórkami (2,5ml poż.MEM 2%FBS)
Dodać mix PEI z pDNA na płytki z komórkami
Liczenie komórek w komorze Burkera
Po 10 µl zawiesiny komórek odpipetować na komorę nad i pod środkowym rowkiem,
przykryć szkiełkiem nakrywkowym i liczyć wg wzoru:
LICZBA KOM. W 1ML= N x 10000
CAŁKOWITA LICZBA KOM. = N x 10000 x ROZCIEŃCZENIE
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Ćwiczenie 3
Badanie ekspresji genu wprowadzanego do komórek na plazmidzie pAAV:
1. Zebranie komórek z płytek po transfekcji
2. Liza termiczna osadu komórkowego
3. Test Beta-gal
4. Test Beta-gal in situ (Stratagene)
Ad.1.
• Ściągnąć pożywkę znad powierzchni komórek, dwukrotnie przepłukać je PBSem (23ml/płytkę);
• Płytki z komórkami delikatnie zeskrobać (scaper) z powierzchni płytki i zawieszone w
PBSie przenieść do probówki 15ml
• Zwirować 3’, RT, 1500 rpm, supernatant delikatnie ściągnąć ssawką nie naruszając
osadu komórkowego
Ad.2.
• Osad komórek zawiesić w buforze 0,25M Tris pH=8 w ilości 50-200 µl/próbę,
roztwór powinien być mętny;
• (-70 oC 10min, 37 oC 10min)x3
• Wirowanie: 12000 rpm, 10min, 4 oC
• Zebrać supernatant (lizat białkowy), w trakcie początkowych etapów eksperymentu
trzymać na lodzie (nadmiar mroźić w -20 oC)
Ad.3.
• Odpipetować do nowej probówki 10 µl lizatu białkowego /próbę
• Odpipetować tą samą ilość (co lizatu białkowego) samego buforu Tris (próbka ślepa
która posłuży do kalibracji)
• Dodać 3 µl 100X Mg/próbę
• Dodać 50 µl substratu ONPG/próbę
• Dopełnić do 300 µl buforem fosforanowym (0,1 M Na3PO4)
• Inkubacja w 37 oC, 30-60min (żółte zabarwienie)
• Blokowanie reakcji: 500 µl węglanu sodu (1M Na2CO3)
• Pomiar absorbancji przy wartości 420nm
• Pomiar ilości białka całkowitego (met.Lowry: 10 µl lizatu białkowego, 50 µl
odczynnika A + 450 µl odczynnika B, zworteksować, 15-20’RT) przy wartości 750nm
• Obliczyć współczynnik Abs 420/Abs 750
Ad.4.
• Ściągnąć ssawką medium znad komórek
• Dodać na płytkę z komórkami 3ml 1X roztworu utrwalającego (fixing solution),
inkubować 10’ RT
• Ściągnąć z płytki utrwalacz, przepłukać komórki dwukrotnie 1X PBSem (4ml/płytkę)
• Dodać 2ml świeżego 1X roztworu wybarwiającego (staining solution), inkubować
15min-24h, 37 oC
• Po ściągnięciu roztworu wybarwiającego komórki, przepłukać je 1X PBSem
(4ml/płytkę)
• Dokonać analizy mikroskopowej
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Badanie obecności sekwencji transgenu (GFP) z wykorzystaniem techniki PCR:
1.
2.
3.
4.
Ad.1.
•
Ad.2.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Zebranie komórek z płytek po transfekcji/infekcji
Izolacja DNA (Sherlock, alternatywnie Qiagen)
Pomiar stężenia DNA
Reakcja PCR
Osad komórkowy zawiesić w
Osad komórkowy zawiesić w 0,3ml buf.TE, zworteksować
Dodać 0,3ml buf. L 1.4, zworteksować
Dodać 20 µl Proteinazy K, zworteksować
Inkubacja w 50oC co jakiś czas worteksując próbkę do momentu całkowitego
zlizowania komórek
Lizat przenieść na kolumnę z żółtym korkiem (filtr 1), zwirować 5000 rpm 1’
Usunąć kolumnę, przesącz nanieść na kolumnę z niebieskim korkiem (Spin 10 AX),
zwirować 5000 rpm 1’
Wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do probówki, dodać 0,6ml roztworu K2,
5000 rpm 1’
Powtórzyć poprzednią czynność
Przenieść kolumnę do nowej probówki (2ml) i dodać 0,35ml roztworu elucyjnego K3,
2’ RT, następnie 5000 rpm 1’
Ponownie dodać 0,35ml roztworu K3, następnie zwirować 5000 rpm 1’
Usunąć kolumnę, eluat (w nim DNA) przenieść do probówki (1,5ml) dodając 5 µl
Wzmacniacza precypitacji oraz 0,6ml izopropanolu, całość wymieszać, zwirować
12000 rpm 5’
Po odwirowaniu zlać supernatant (osad DNA niebiesko-zabarwiony) i dodać 70%
EtOH, wymieszać , 12000 rpm 5’
Po wirowaniu zlać supernatant, osad osuszyć przez odwrócenie probówki na 10min w
RT
Osad po wyschnięciu zawiesić w wodzie dest./buforze TE/10mM pH =8
•
Ad.3.
• Przygotować 60-krotne rozcieńczenie DNA do pomiaru spektrofometrycznego
(objętość próby: 600 µl)
• Dokonać pomiaru absorbancji badanej próby przy następujących długościach fal: Abs
260 oraz Abs 280
• Obliczyć stężenie DNA wg formuły:
Abs 260*współczynnik dsDNA (50)*rozcieńcznie (60)
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Ad.4.
Objętość reakcyjna: 20 µl
Stężenie wyjściowe pDNA(pAAV/GFP):
Do reakcji: 100 ng pDNA
Bufor reakcyjny 10X 1X
dNTPs: 10mM
RedTaq: 1U/ µl
Długość produktu:
•
Warunki reakcji:
Bufor 10X
dNTPs
Forward
Reverse
RedTaq
H2 O
pDNA
94 oC 5’
94 oC 30’’
55 oC 30’’
72 oC 30’’
72 oC 10’
4 oC ∞
x 30 cykli
x1
2 µl
2 µl
1 µl
1 µl
1 µl
x