Monoclonal Mouse
Transkrypt
Monoclonal Mouse
MultiMix™ Triple-Colour Reagent Anti-Human CD71/FITC Anti-Human CD235a/RPE Anti-Human CD45/APC Nr kat. TC675 Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. Odczynnik TC675 przeznaczony jest do stosowania w cytometrii przepływowej. Odczynnik jest przeznaczony do stosowania w identyfikacji komórek wykazujących ekspresję CD71, CD235a i CD45. CD71 jest receptorem transferyny. W tkankach prawidłowych wysoki poziom ekspresji CD71 wykazują prekursory komórek erytroidalnych i retikulocyty syntetyzujące hemoglobinę (1), ekspresja ta jednak zanika w dojrzałych erytrocytach (2). Limfocyty aktywowane wykazują ekspresję CD71, nie zachodzi ona jednak w limfocytach w fazie spoczynku (2). Status proliferacji, zarówno w komórkach prawidłowych, jak i nowotworowych, jest skorelowany z ekspresją CD71 (3). Przeciwciała anty-CD71, wraz z panelem innych przeciwciał, uznaje się za istotne we wstępnej ocenie ostrych białaczek pochodzących z komórek linii erytroidalnych (4). Ekspresję CD235a (glikoforyny A) wykazują komórki erytroidalne, począwszy od rozpoznawalnych morfologicznie prekursorów komórek erytroidalnych, zaraz po fazie CFU-E, aż po dojrzałe erytrocyty. Po osiągnięciu maksymalnego poziomu ekspresji CD235a, ilość tego białka w erytrocycie pozostaje stała i nie zmienia się w trakcie dalszego dojrzewania (5). W większości przypadków choroby di Gugliemo ekspresję CD235a wykazują erytroblasty po przemianie nowotworowej, podczas gdy w ostrej białaczce szpikowej i limfoblastycznej ekspresja CD235a zachodzi bardzo rzadko (6). CD45 jest jedną z najobficiej występujących glikoprotein powierzchniowych błony komórkowej leukocytów, a jego ekspresja zachodzi wyłącznie w komórkach układu krwiotwórczego i potomnych (7). Anty-CD45, wraz z panelem przeciwciał, uważany jest za kluczowy do wstępnego rozpoznania przewlekłych zaburzeń proliferacji limfocytów i ostrych białaczek (8). Interpretacji wyniku — z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz wyników innych metod diagnostycznych — powinien dokonać wykwalifikowany patolog. Dostarczany odczynnik TC675 składa się z trzech specjalnie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych: Monoclonal Mouse Anti-Human CD71, klon Ber-T9, sprzężone z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Monoclonal Mouse Anti-Human CD235a, Glycophorin A, klon JC159, sprzężone z R-fikoerytryną (RPE). Monoclonal Mouse Anti-Human CD45, klon 2D1, sprzężone z allofikocyjaniną (APC). Trzy koniugaty w TC675 wytworzono z oczyszczonych mysich przeciwciał monoklonalnych izotypu IgG1 kappa. Odczynnik TC675 dostarczany jest w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy surowicy wołowej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Każda fiolka zawiera koniugat na 50 testów (20 µL koniugatu dla leukocytów, w ilości do 106, z prawidłowej ludzkiej krwi obwodowej). Swoistość Przeciwciała anty-CD71, Ber-T9, opisano podczas warsztatów Fifth International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (5. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD71 została potwierdzona przez wiele laboratoriów (9). Przeciwciała anty-CD235a, JC159, dają silny odczyn w prawidłowych komórkach erytroidalnych na wszystkich etapach różnicowania, od erytroblastów po dojrzałe krwinki czerwone (6). Przeciwciała anty-CD45, 2D1, opisano podczas warsztatów Third International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (3. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów różnicujących leukocyty ludzkie), a ich reaktywność z CD45 została potwierdzona przez wiele laboratoriów (10). Nazwa klonu przeciwciała to anty-Hle-1 (10). Środki ostrożności 1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników. 2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. 3. Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować odpowiednie procedury postępowania. Przechowywanie (113857-002) Przechowywać w ciemności, w temperaturze 2–8°C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na opakowaniu. Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na ulotce dołączanej do opakowania, Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów należy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z odczynnikiem, należy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. TC675/PL/SSA/06.09.05 s.1/3 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17 Wykonanie odczynu Ponieważ przeciwciała anty-CD235a reagują z erytrocytami, niezbędne jest usunięcie erytrocytów przed rozpoczęciem wykonania odczynu przy użyciu odczynnika TC675. 1. Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej o wymiarach 12 mm x 75 mm. 2. Zlizować erytrocyty po etapie 3–5 albo wyizolować komórki jednojądrzaste przez wirowanie w gradiencie gęstości i przejść do etapu 6. 3. Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym pomieszczeniu. 4. Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym pomieszczeniu. 5. Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go, pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy. 6. Dodać 20 µL TC675 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym. 7. Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8°C lub przez 15–30 minut w temperaturze pokojowej (20–25°C). 8. Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go, pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy. 9. Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę za pomocą mieszadła wibracyjnego. 10. Powtórzyć etap 8. 11. Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS. 12. Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności i temperaturze 2–8°C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia. Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie wykonywania odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem. Uwagi dotyczące procedury Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne w celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek. Etap 6: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą się zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w każdym laboratorium. Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być dopasowany do odczynnika ze sprzężonymi przeciwciałami. Zalecanym trójbarwnym odczynnikiem kontrolnym dla TC675 jest odczynnik Dako o numerze kat. X0978. Etap 12: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej liczby komórek, w których zachodzi ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca ekspresji antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów. Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru. Dzięki minimalnemu nakładaniu się pasm emisyjnych fluorochromów FITC, RPE i APC ich połączenie umożliwia wyjątkowo łatwą analizę. Piśmiennictwo (113857-002) 1. Goding J. CD71. CD Guide. In: Mason D, André P, Bensussan A, Buckley C, Civin C, Clark E, et al., editors. Leucocyte typing VII. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 7th International Workshop and Conference; 2000 Jun 19-23; Harrogate, United Kingdom. New York: Oxford University Press Inc.; 2002. p. 823-4. 2. Sutherland R, Delia D, Schneider C, Newman R, Kemshead J, Greaves M. Ubiquitous cell-surface glycoprotein on tumor cells is proliferation-associated receptor for transferrin. Proc Natl Acad Sci (USA) 1981;78:4515-9. 3. Newman R, Schneider C, Sutherland R, Vodinelich L, Greaves M. The transferrin receptor. [Review]. Trends Biochem Sci 1982;1:397-400. 4. Basso G, Buldini B, De Zen L, Orfao A. New methodologic approaches for immunophenotyping acute leukemias. Haematologica 2001;86:675-92. 5. Loken MR, Shah VO, Dattilio KL, Civin CI. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood 1987;69:255-63. 6. Erber WN, McLachlan J, Cordell JL, Turley H, Reid M, Mason DY. A new monoclonal antibody (JC159) that detects glycophorin A for the diagnosis of erythroleukaemia. Hematol Rev 1991;5:113-20. 7. Leong AS-Y, Cooper K, Leong FJW-M. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. London: Greenwich Medical Media Ltd.; 2003. p. 121-4. 8. Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7. 9. Boeker M, Werfel T. AA12.1. Binding of activation antigen panel mAb to mononuclear cells after antigenspecific stimulation in vitro. In: Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leucocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5th TC675/PL/SSA/06.09.05 s.2/3 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17 International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1995. p. 1181-2. 10. Cobbold S, Hale G, Waldmann H. Non-lineage, LFA-1 family, and leucocyte common antigens: new and previously defined clusters. In: McMichael AJ, Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch FM, et al., editors. Leucocyte typing III. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd International Workshop and Conference; 1986 Sep 21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1987. p. 788-803. Objaśnienie symboli Numer katalogowy W y d i a r g ó b n m o s e t d y k y i c i n z n v y i t d r Temperatura przechowywania o o Chronić przed słońcem (patrz s e k c j a n t . p r z e c h o w y w a n i a Zużyć przed Producent ) Sprawdzić w instrukcji N s (113857-002) t o s o w a n i u m e r s e r i i a TC675/PL/SSA/06.09.05 s.3/3 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17