Płodowe komórki CD34+ izolowane z krwi matki oraz mikromacierze

PRACE ORYGINALNE
Agnieszka GRABOWSKA1
Anna MADETKO-TALOWSKA1
Magdalena JANECZKO1
Marcin MAJKA2
Jacek J. PIETRZYK1
P³odowe komórki CD34+ izolowane z krwi
matki oraz mikromacierze cytogenetyczne
jako potencjalne narzêdzia w przesiewowej,
nieinwazyjnej diagnostyce prenatalnej
– badania wstêpne
Fetal CD34+ cells isolated from maternal blood
and cytogenetics array as potential tools in screening,
non-invasive prenatal diagnosis – preliminary research
Zak³ad Genetyki Medycznej Katedry Pediatrii
Uniwersytetu Jagielloñskiego
Collegium Medicum
Kierownik:
Prof. dr hab. med. Jacek J. Pietrzyk
1
Zak³ad Transplantologii Katedry Immunologii
Klinicznej i Transplantologii
Uniwersytetu Jagielloñskiego
Collegium Medicum
Kierownik:
Prof. dr hab. Marcin Majka
2
Dodatkowe s³owa kluczowe:
nieinwazyjna diagnostyka prenatalna
p³odowe komórki macierzyste
macierze cytogenetyczne
Additional key words:
non-invasive prenatal diagnosis
fetal stem cells
cytogenetics arrays
Praca finansowana z:
K/ZBW/000551
K/ZBW/000556
Praca finansowana ze œrodków Mechanizmu
Finansowego Europejskiego
Obszaru Gospodarczego (PL0226) oraz
œrodków Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa
Wy¿szego (EO23/P01/2008/02/85).
Adres do korespondencji:
Mgr Agnieszka Grabowska
Zak³ad Genetyki Medycznej Katedry Pediatrii
UJ CM
30-663 Kraków, ul. Wielicka 265
Tel.: 12 658 02 56
e-mail: [email protected]
40
Wspó³czesna diagnostyka prenatalna oparta jest g³ównie na metodach
inwazyjnych i zwi¹zana jest z ryzykiem
poronienia. Oczywiste jest istnienie
potrzeby opracowania nowego nieinwazyjnego testu prenatalnego. W czasie ci¹¿y komórki p³odu przep³ywaj¹ do
krwioobiegu matki, co w konsekwencji prowadzi do powstania fizjologicznego mikrochimeryzmu. Badanie tego
zjawiska stwarza mo¿liwoœæ stworzenia nowego narzêdzia dla diagnostyki
prenatalnej. Celem badania jest opracowanie innowacyjnej metody izolacji
komórek pochodzenia p³odowego z
krwi obwodowej matki, ich analiza genetyczna oraz ocena potencja³u zastosowania techniki mikromacierzy cytogenetycznych w diagnostyce zaburzeñ
genetycznych p³odu lub komplikacjach
po³o¿niczych. Materia³ badawczy stanowi³y 22 próbki krwi pobrane od kobiet ciê¿arnych poddanych nastêpnie
amniopunkcji. Protokó³ oparty by³ na
separacji oraz hodowli komórek hematopoetycznych CD34+. W celu oceny
pochodzenia komórek izolowano pojedyncze kolonie oraz analizowano
profil ekspresji genów hemoglobiny
metod¹ PCR w czasie rzeczywistym
przy u¿yciu specyficznych sond dla
Hbb i Hbg. Wykazano, i¿ stosunek ekspresji Hbb/Hbg jest ni¿szy w komórkach pochodzenia p³odowego w stosunku do komórek doros³ych. Wykorzystano cechy w³asne p³odowych komórek CD34+ takie jak silny potencja³
proliferacyjny oraz profil ekspresji hemoglobiny. Mo¿liwoœæ ekspansji komórek CD34+ pozwala zredukowaæ
objêtoœæ krwi matki niezbêdn¹ do przeprowadzenia testu.
Wstêp
Wady wrodzone stwierdzane s¹ u oko³o 5% ¿ywo urodzonych noworodków i stanowi¹ jeden z najpowa¿niejszych proble-
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 1
Current prenatal diagnosis is dependent mainly on invasive methods
and it correlates with risk of fetal loss.
It is clear that there is necessity to devise new non-invasive prenatal test.
During the pregnancy fetal cells pass
into the maternal circulation which results in a physiological micro-chimerism. Investigation of this phenomenon
creates opportunity to elaborate new
tool of prenatal diagnosis. The aim of
the study is to evolve novel method of
fetal cells isolation from maternal
blood, their analyses and assessment
of potential cytogenetics arrays application for diagnosis of fetal genetic
disorders or obstetric complications.
Experimental material contained 22
samples of peripheral blood from pregnant women undergoing an amniocentesis. Our protocol was based on separation and culture of CD34+ hematopoietic cells. To estimate the origin of
cells we isolated single colonies and
examined hemoglobin genes expression profiles by Real-time PCR assays
using specific probes for Hbb ang Hbg.
We demonstrated that Hbb/Hbg expression ratio was lower in fetal origin cells
than in adult ones. We successfully
used the native characteristics of fetal CD34+ cells such as strong proliferating potential and hemoglobin expression profile. Expansion of CD34+
cells reduced volume of maternal
blood required to run the test.
mów wspó³czesnej pediatrii [4,17]. Ogromny postêp medycyny oraz technologii w
ostatnich latach sprawi³, i¿ mo¿liwe staje siê
diagnozowanie oraz leczenie dziecka ju¿ w
A. Grabowska i wsp.
trakcie ¿ycia p³odowego. Z tak¹ strategi¹
wi¹¿e siê nierozerwalnie koniecznoœæ ci¹g³ego udoskonalania systemu diagnostyki
prenatalnej pozwalaj¹cej na wczesne postawienie rozpoznania oraz zapewnienie
optymalnej opieki medycznej dziecku ju¿ od
pierwszych chwil po narodzinach.
Wspó³czesna diagnostyka prenatalna
oparta jest g³ównie na metodach inwazyjnych takich jak amniocenteza, biopsja kosmówki czy kordocenteza. Wiarygodnoœæ
tych technik jest bardzo wysoka, jednak¿e
stanowi¹ one potencjalne zagro¿enie dla
p³odu i zwi¹zane s¹ z ryzykiem poronienia
oszacowanym odpowiednio na 0,5-2%. Ultrasonografia i testy biochemiczne wykonywane z krwi matki niweluj¹ ryzyko powik³añ.
Niestety techniki te wykazuj¹ wiele ograniczeñ i czêsto generuj¹ fa³szywie pozytywne wyniki [11,13]. Koniecznoœci¹ staje siê
wiêc stworzenie nowej, nieinwazyjnej metody diagnostyki prenatalnej.
Nies³abn¹ce zainteresowanie problemami diagnostyki prenatalnej koncentruje
badania œwiatowe na opracowaniu bezinwazyjnego testu prenatalnego, wykorzystuj¹cego komórki p³odu kr¹¿¹ce w krwi matki. Mikrochimeryzm to wspó³istnienie w jednym organizmie dwóch populacji komórek
ró¿nych pod wzglêdem pochodzenia i profilu genetycznego, podczas gdy jedna z tych
populacji wystêpuje w niewielkiej liczbie.
Najczêstszym Ÿród³em chimeryzmu jest
mieszanie krwi. W czasie ci¹¿y dochodzi
do dwukierunkowego przep³ywu komórek
pomiêdzy matk¹ a p³odem, konsekwencj¹
czego jest powstanie chimeryzmu p³odowomatczynego [1,2,6,12,21]. G³ówn¹ pulê komórek p³odu obecnych w organizmie matki
stanowi¹ komórki linii hematopoetycznej,
wykazano równie¿ obecnoœæ fragmentów
trofoblastu oraz mezenchymalnych komórek macierzystych [9,14,20]. Komórki te,
obecne we krwi matki, sta³y siê istotnym
celem bezinwazyjnych testów prenatalnych.
W wielu patologiach ci¹¿y, takich jak:
stan przedrzucawkowy, ograniczenie wzrastania p³odu, wielowodzie, zmiany w budowie ³o¿yska oraz aneuploidie p³odu, obserwuje siê zwiêkszon¹ liczbê komórek p³odowych we krwi matki. Badanie tego zjawiska
stwarza mo¿liwoœæ wczesnego okreœlenia
ryzyka zagro¿enia p³odu, którego nie mo¿na jeszcze wykryæ metod¹ ultrasonografii
[7,20].
Klasyczne techniki analizy cytogenetycznej wad p³odu wykazuj¹ nisk¹ rozdzielczoœæ i w przypadkach mutacji strukturalnych czêsto generuj¹ b³êdne wyniki (fa³szywie ujemne), co skutkuje postawieniem nieprawid³owej diagnozy [11,13,18]. Postêp
technologiczny ostatnich lat doprowadzi³ do
opracowania narzêdzia analizy genetycznej
nowej generacji - mikromacierzy.
Mikromacierz jest to œciœle uporz¹dkowany uk³ad sond molekularnych (fragmentów kwasu nukleinowego) naniesionych na
szklan¹ lub plastikow¹ p³ytkê. Technologia
ta opiera siê na hybrydyzacji (uprzednio
wyznakowanego fluorescencyjnie) badanego materia³u dodawanego do komplementarnych sekwencji sond znajduj¹cych siê na
macierzy. Poprzez skanowanie wi¹zk¹
œwiat³a mikromacierzy nastêpuje wzbudzenie fluorescencji. Intensywnoœæ sygna³u jest
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 1
proporcjonalna do liczby zhybrydyzowanych
z sondami fragmentów materia³u genetycznego [16,19]. Laboratorium Genetyki Molekularnej Zak³adu Genetyki Medycznej Katedry Pediatrii Uniwersytetu Jagielloñskiego Collegium Medicum dysponuje systemem GeneChip firmy Affymetrix. System ten
umo¿liwia analizê cytogenetyczn¹ poprzez
dedykowane do tego celu mikromacierze
Cytogenetics 2.7M Array (Affymetrix). Zastosowanie wymienionych mikromacierzy
pozwala uzyskaæ z bardzo niewielkiej iloœci
materia³u (100ng DNA genomowego) czu³¹
i szybk¹ detekcjê zmian w genomie pacjenta. Wysok¹ wiarygodnoœæ otrzymywanych
wyników zapewnia 2,7 miliona markerów
umieszczonych na macierzy pokrywaj¹cych
ca³y genom ludzki. Dodatkowo dziêki obecnoœci 400,000 markerów typu SNP daj¹ one
mo¿liwoœæ jednoczesnej detekcji zmian o
charakterze utraty heterozygotycznoœci
(LOH) oraz disomi jednorodzicielskich
(UPD). Technologia ta pozwala na kompleksow¹ analizê genomu pacjenta.
Celem badania jest próba opracowania
bezinwazyjnego testu prenatalnego w oparciu o izolacjê komórek p³odu z krwi obwodowej matki, ich hodowlê i analizê genetyczn¹ oraz ocena potencja³u zastosowania
techniki mikromacierzy cytogenetycznych.
Materia³ i metody
Materia³ badawczy stanowi³o 5 ml krwi obwodowej
pobieranej od kobiet ciê¿arnych na antykoagulant EDTA
(kwas etylenodiaminotetraoctowy) podczas rutynowych
badañ diagnostycznych. Badaniem objêto 22 pacjentki
w drugim trymestrze ci¹¿y, w wieku 18-43 lata, zaliczane do grupy ryzyka – tzn. pacjentki, dla których prawdopodobieñstwo urodzenia dziecka z chorob¹ dziedziczn¹
lub wad¹ wrodzon¹ przekracza³o ryzyko populacyjne.
Pacjentki zosta³y zakwalifikowane do badania na
podstawie informacji uzyskanych z bazy danych Poradni Genetycznej Uniwersyteckiego Szpitala Dzieciêcego
w Krakowie. Uczestnictwo w badaniu proponowano jedynie pacjentkom, u których lekarz stwierdzi³ koniecznoœæ przeprowadzenia amniocentezy w celu szczegó³owej diagnostyki prenatalnej. Kryteria w³¹czenia do badania zawiera³y: nieprawid³owy wynik testów biochemicznych i/ lub stwierdzenie nieprawid³owoœci w badaniu ultrasonograficznym p³odu (zwiêkszona wartoœæ NT) oraz
uzyskanie œwiadomej zgody pacjentki na uczestnictwo
w badaniu. Krew obwodowa pobrana od 5 zdrowych,
doros³ych ochotników (3 kobiety i 2 mê¿czyzn) z Zak³adu Genetyki Medycznej Katedry Pediatrii UJ CM pos³u¿y³a jako kontrola wewnêtrzna badania.
Na przeprowadzenie badañ uzyskano zgodê Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Jagielloñskiego - zgoda
nr KBET/92/B/2008 z dnia 13. 11. 2008 r.
Procedura izolacji oraz analizy p³odowych komórek macierzystych z krwi matki obejmowa³a nastêpuj¹ce
etapy. Próbkê krwi poddawano wirowaniu w gradiencie
gêstoœci (Ficoll-Paque Premium; GE Healthcare Life
Sciences) w celu uzyskania rozdzia³u frakcji komórkowych i separacji komórek jednoj¹drzastych. Izolacjê hematopoetycznych komórek CD34+ (ang. cluster of differentiation, CD34 to glikozylowane bia³ko transb³onowe,
nale¿¹ce do rodziny cz¹steczek adhezyjnych i homologiczne z sialomucyn¹) przeprowadzono przy u¿yciu systemu immunomagnetycznego EasySep Human CD34+
(StemCell Technologies), procedurê izolacji przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. Wyizolowane
komórki poddawano hodowli w po¿ywce na bazie metylocelulozy (MethoCult GF H4434; StemCell Technologies), w standartowych warunkach (temperatura 37oC,
atmosfera wysycana 5%CO2, 95% wilgotnoœci) umo¿liwiaj¹c preferencyjne namno¿enie p³odowych komórek
krwiotwórczych.
Po 14 dniach hodowli zbierano pojedyncze kolonie
erytroidalne BFU-E (ang. burst forming unit-erythrocyte)
(rycina 1). Ka¿d¹ z uzyskanych kolonii analizowano indywidualnie. Z komórek kolonii BFU-E izolowano RNA
(zestaw RNAqueous®-Micro Kit; Ambion) oraz DNA
(QIAamp® DNA Mini Kit; Qiagen). Oceny czystoœci uzyskanych preparatów dokonywano przez pomiar spektrofotometryczny (spektrofotometr NanoDrop1000; ThermoScientific). Reakcjê odwrotnej transkrypcji przeprowadzono przy u¿yciu zestawu High Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit (Applied Biosystem). Weryfikacjê pochodzenia poszczególnych kolonii komórkowych (p³odowe/matczyne) przeprowadzono poprzez reakcjê PCR w
czasie rzeczywistym (ang. Real-time PCR) z zastosowaniem specyficznych sond dla hemoglobiny osoby doros³ej Hbß oraz hemoglobiny p³odowej Hbg (TaqMan;
Applied Biosystem). W celu normalizacji liczby transkryptów genów badanych zastosowano sondê dla genu referencyjnego dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego - GAPDH (TaqMan; Applied Biosystem).
Wyniki
Analizie poddano 22 próbki krwi obwodowej o objêtoœci 5 ml, pobranej od kobiet
w II trymestrze ci¹¿y i skierowanych przez
lekarza na zabieg amniopunkcji w celu
szczegó³owej diagnostyki prenatalnej. Jako
kontrolê prowadzonych badañ oraz punkt
odniesienia dla otrzymanych wyników zastosowano 5 ml krwi obwodowej pobranej od
osób doros³ych.
Rezultatem przeprowadzonych badañ
jest opracowanie wstêpnego protoko³u izolacji i hodowli komórek hematopoetycznych
CD34+ p³odu z krwi obwodowej ciê¿arnych.
Dziêki zastosowaniu ekspansji komórek zredukowano do 5 ml objêtoœæ próbki krwi matki
niezbêdn¹ do przeprowadzenia testu prenatalnego. Do identyfikacji Ÿród³a badanych
komórek z powodzeniem wykorzystano ich
cechy w³asne takie jak silny potencja³ proliferacyjny oraz profil ekspresji hemoglobiny.
Wykazano ró¿nice w ekspresji genów hemoglobiny b i g zale¿ne od pochodzenia badanych komórek (p³odowe/matczyne). Stosunek iloœci transkryptów mRNA genów Hb
b/g by³ ni¿szy w komórkach pochodzenia
p³odowego w stosunku do komórek doros³ych (rycina 2).
Dodatkowo podjêto próby izolacji DNA,
które w przysz³oœci pos³u¿y do analizy kariotypu dziecka przy pomocy mikromacierzy cytogenetycznych. Planuje siê konfrontacjê uzyskanych w ten sposób wyników z
rezultatami rutynowo prowadzonej oceny kariotypu oraz fenotypem noworodka.
Omówienie
Wady wrodzone oraz komplikacje oko³oporodowe stanowi¹ wa¿ny problem, z którym zmaga siê wspó³czesna pediatria.
Obecnie stosowana diagnostyka prenatalna zwi¹zana jest nierozerwalnie z metodami inwazyjnymi nios¹cymi ryzyko dla p³odu
i matki. Ponadto klasyczne techniki cytogenetyczne wykazuj¹ nisk¹ rozdzielczoœæ oraz
ograniczone mo¿liwoœci diagnostyki celowanej [5,15,18].
Podjêcie przez nasz oœrodek badawczy
próby opracowania nowego, nieinwazyjnego testu prenatalnego jest odpowiedzi¹ na
rosn¹ce zapotrzebowanie w zakresie diagnostyki prenatalnej. Szacunkowo tylko w
regionie Polski po³udniowej co roku rodzi siê
oko³o 1000 dzieci z wadami wrodzonymi
(dane Zak³adu Genetyki Medycznej Katedry
Pediatrii UJ CM). Z roku na rok wzrasta œred-
41
Rycina 1
Pojedyncze ludzkie kolonie BFU-E po 14 dniach hodowli w po¿ywce MethoCult (powiêkszenie x100).
Single human BFU-E colonies after 14 days of incubation in medium MethoCult (magnification x100).
D Ct
Hb b
Hb g
Krew od osób doros³ych
ni wiek rodz¹cych kobiet (ok. 10% rodz¹cych to kobiety po 35 roku ¿ycia), co niesie
ze sob¹ wzrost ryzyka wyst¹pienia aneuploidii u dziecka. Do najliczniejszej grupy pacjentek, u których wykonywana jest metodami inwazyjnymi prenatalna ocena kariotypu p³odu nale¿¹ ciê¿arne, w przypadku
których stwierdzono nieprawid³owoœci w
wynikach testów biochemicznych i/lub w
badaniu ultrasonograficznym przeziernoœci
karku u p³odu [4,15,17]. Zwiêkszenie wartoœci przeziernoœci fa³du karkowego (NT
ang. nuchal translucency) powy¿ej 2,5mm,
stwierdzane miêdzy 11 a 14 tygodniem ci¹¿y, zwi¹zane jest najczêœciej z wyst¹pieniem
zespo³ów charakteryzuj¹cych siê obecnoœci¹ du¿ych aberracji chromosomowych (trisomia chromosomów 21, 13 oraz 18; monosomia chromosomu X). U oko³o 5% pacjentek ze zwiêkszon¹ wartoœci¹ NT stwierdza siê prawid³owy wynik badania kariotypu. Poszerzenie wartoœci przeziernoœci fa³du karkowego mo¿e wskazywaæ na obarczenie p³odu inn¹ aberracj¹ chromosomow¹ i/lub wad¹ wrodzon¹. Zwiêkszone NT
obserwowano miêdzy innymi w przypadku
42
Rycina 2
Œredni poziom ekspresji genów Hbb i Hbg
oznaczone metod¹ PCR w czasie rzeczywistym (z
uwzglêdnieniem odchyleñ standardowych).
Obliczenia wykonano dla 20 indywidualnie
analizowanych kolonii BFU-E otrzymanych z 5
próbek krwi od osób doros³ych oraz 34 kolonii
p³odowych BFU-E z 22 próbek krwi matczynej.
Average Hbb and Hbg expression level detemined by
Real-time PCR assays (taking standard deviations under
consideration). Calculations were performed for 20
separately analysed BFU-E colonies obtained from 5
adult blood samples and 34 fetal BFU-E colonies from
22 maternal blood samples.
Komórki p³odowe izolowane z krwi matki
Zespo³u Noonan, Zespo³u Smitha Lemliego
i Opitza czy dysplazji kostnych. W tej grupie
pacjentek szerokie spektrum mo¿liwych do
stwierdzenia wad oraz nieprawid³owoœci
genetycznych znacznie utrudnia, a w wiêkszoœci przypadków ca³kowicie uniemo¿liwia
ustalenie rozpoznania u p³odu. Wynika to
przede wszystkim z niskiej rozdzielczoœci
technik pr¹¿kowych, jak równie¿ z bardzo
ograniczonych mo¿liwoœci przeprowadzenia
diagnostyki celowanej, pozwalaj¹cej na detekcjê ró¿norakich zmian [8,10,17]. Rozwi¹zaniem jest zastosowanie techniki o wy¿szej
rozdzielczoœci, która w krótkim okresie czasu pozwoli na wykrycie nie tylko du¿ych
aberracji chromosomowych, ale równie¿ innych zmian kariotypu mog¹cych prowadziæ
do istotnych skutków klinicznych. Tak¹ rozdzielczoœæ analizy umo¿liwia technika mikromacierzy cytogenetycznych.
W obliczu ograniczeñ dostêpnej metodyki diagnostyki prenatalnej wiele oœrodków
badawczych pracuje nad wykorzystaniem
kr¹¿¹cych w krwioobiegu matki komórek
p³odu do identyfikacji jego ewentualnych
patologii. Celem badañ s¹ trzy typy komóPrzegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 1
rek: fragmenty trofoblastu, limfoblasty oraz
erytroblasty [14,18].
Wstêpne rezultaty naszych badañ potwierdzaj¹ doniesienia naukowe o obecnoœci p³odowych komórek hematopoetycznych
w krwi obwodowej ciê¿arnych kobiet. Potwierdzaj¹ ponadto s³usznoœæ prowadzenia
hodowli komórkowej jako metody pozwalaj¹cej na zwielokrotnienie liczby komórek p³odowych do dalszych analiz, wynikiem czego jest zmniejszenie objêtoœci krwi niezbêdnej do przeprowadzenia diagnostyki p³odu
(zaledwie 5 ml krwi). Dotychczasowe œwiatowe próby opracowania bezinwazyjnej diagnostyki prenatalnej oparte by³y na ok. 20
ml krwi obwodowej matki [1,2,7,11,12].
Atrakcyjny cel dla ekspansji komórek p³odowych stanowi¹ progenitorowe komórki
krwiotwórcze CD34+. Wykazuj¹ one wy¿szy
od matczynych komórek potencja³ proliferacyjny oraz krótszy czas hemoglobinizacji
[3,14]. Opracowany przez nas algorytm wykorzysta³ silny potencja³ proliferacyjny oraz
odmienny profil ekspresji genów hemoglobiny w stosunku do komórek "doros³ych"
jako markery do identyfikacji komórek poA. Grabowska i wsp.
chodzenia p³odowego.
Postêp technologiczny oraz zapotrzebowanie rynku diagnostycznego wymusza
wprowadzenie zmian w rutynowej diagnostyce prenatalnej. Opracowanie nowego
bezpiecznego testu oceny patologii p³odu i
ci¹¿y staje siê nieuniknione. Nieinwazyjna
diagnostyka prenatalna umo¿liwi wyeliminowanie ryzyka wyst¹pienia powik³añ pozabiegowych przy obecnie stosowanych inwazyjnych metodach, wœród których do najwa¿niejszych nale¿¹: krwawienie, zaka¿enie,
odp³yniêcie p³ynu owodniowego oraz poronienie [18]. Wczesne zdiagnozowanie lub
wykluczenie choroby pozwoli na udzielenie
rodzicom stosownej porady genetycznej.
Wiedza, jak¹ w ten sposób mog¹ uzyskaæ
rodzice i/lub lekarz prowadz¹cy pozwoli
przygotowaæ optymalny plan prowadzenia
ci¹¿y oraz porodu z odpowiedni¹ opiek¹
medyczn¹. Umo¿liwi podjêcie decyzji odnoœnie ewentualnej terapii dziecka post- i/lub
prenatalnej.
W chwili obecnej Polska nie dysponuje
oœrodkiem przeprowadzaj¹cym rutynow¹
diagnostykê ci¹¿y z wykorzystaniem komórek macierzystych p³odu izolowanych z krwi
obwodowej matki. Dotychczas nie prowadzono równie¿ prób oceny kariotypu z zastosowaniem mikromacierzy cytogenetycznych. Powy¿sze czynniki potwierdzaj¹
s³usznoœæ prowadzonych badañ a zarazem
czyni¹ je nowatorskimi w skali kraju.
Wnioski
Wprowadzenie do rutynowej diagnostyki
testów prenatalnych z u¿yciem p³odowych
komórek izolowanych z krwi obwodowej
matki pozwoli na eliminacjê ryzyka powik³añ
pozabiegowych zwi¹zanych z metodami inwazyjnymi. Wykorzystanie mikromacierzy
cytogenetycznych w diagnostyce prenatalnej umo¿liwi rozwi¹zanie problemu niewystarczaj¹cej czu³oœci rutynowo stosowa-
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 1
nych technik molekularnych. Pozwoli to na
optymalizacjê oceny kariotypu poprzez wysokorozdzielcz¹ detekcjê zmian w genomie
p³odu.
Powy¿sze fakty uzasadniaj¹ podjêcie
próby opracowania nowej, bezinwazyjnej
metody diagnostycznej, opieraj¹cej siê na
badaniu p³odowych komórek obecnych w
krwioobiegu matki oraz zastosowanie mikromacierzy cytogenetycznych jako metody
wysokorozdzielczej analizy genomu p³odu.
Informacje dostarczane dziêki u¿yciu tej
nowoczesnej technologii daj¹ mo¿liwoœæ
zapewnienia dziecku odpowiedniej opieki
medycznej ju¿ od pierwszych chwil ¿ycia
oraz zaplanowania ewentualnej terapii jeszcze przed narodzinami. Ponadto, badania
prowadzone w oparciu o technikê mikromacierzy daj¹ niepowtarzaln¹ szansê na lepsze zrozumienie wielu patologii okresu ci¹¿y jak równie¿ okresu noworodkowego.
Piœmiennictwo
1. Avent N., Plummer Z., Madgett T.,et al.: Postgenomics studies and their application to non-invasive prenatal diagnosis. Semin. Fetal. Neonatal.
Med. 2008, 13, 91.
2. Bianchi D.: Fetomaternal cell traffic, pregnancy-associated progenitor cells, and autoimmune disease.
Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. 2004, 18,
959.
3. Campagnoli C., Roberts I., Kumar S. et al.:
Expandability of haemopoietic progenitors in first trimester fetal and maternal blood: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Prenat. Dian. 2002, 22,
463.
4. Dangel J.: Diagnostyka prenatalna- mity i rzeczywistoϾ. Nauka 2007, 3, 31.
5. Douglas W.R., Blight C., Langlois S.: Diagnosing
chromosomal abnormalities from "big" to "small" with
molecular cytogenetic technology. J. Obstet.
Gynaecol. Can. 2009, 5, 414.
6. Drexler C., Wagner T.: Blood group chimerism. Curr.
Opin. Hematol. 2006, 13, 484.
7. Hahn S., Huppertz B., Holzgreve W.: Fetal cells
and cell free fetal nucleic acids in maternal blood:
new tools to study abnormal plancentation? Placenta
2005, 26, 515.
8. Hyett J.A.: Increased nuchal translucency in fetuses
with a normal karyotype. Prenat. Diagn. 2002, 22,
864.
9. Ichinohe T., Teshmina T., Matsuoka K. et al.: Fetal-maternal microchimerism: impact on hematopoietic stem cell transplantation. Curr. Opin. Immunol.
2005, 17, 546.
10. Kagan K.O., Avgidou K., Molina F.S. et al.: Relation between increased fetal nuchal translucency
thickness and chromosomal defects. Obstet.
Gynecol. 2006, 107, 6.
11. Krabchi K., Gadji M., Samassekou O. et al.: Quantification of fetal nucleated cells in maternal blood of
pregnant women with a male trisomy 21 fetus using
molecular cytogenetic techniques. Prenat. Diagn.
2006, 26, 28.
12. Lo Y., Lau T., Chan L. et al.: Quantitative analysis
of the bidirectional fetomaternal transfer of nucleated
cells and plasma DNA. Clin. Chem. 2000, 46, 1301.
13. Norbury G., Norbury C.: Non-invasive prenatal diagnosis of single gene disorders: How close are we?
Semin. Fetal. Neonatal. Med. 2008, 13, 76.
14. O'Donoghue K., Choolani M., Chan J. et al.: Identification of fetal mesenchymal stem cells trafficking
in pregnancy. Lancet 2004, 364, 179.
15. Sago H.: Prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities through amniocentesis. J. Mamm. Ova Res.
2004, 21, 18.
16. Soong Y.K., Wang T.H., Lee Y.S. et al.: Genomewide detection of uniparental disomy in a fetus with
intrauterine growth restriction using genotyping
microarrays. Taiwan J. Obstet. Gynecol. 2009, 48,
152.
17. Stembalska A., Œlê¿ak R., Pesz K. et al.: Prenatal
diagnosis- principles of diagnostic procedures and
genetic counseling. Folia Histochem. Cytobiol. 2007,
45, 11.
18. Szaryñska M.: Mikrochimeryzm p³odowo-matczyny
i jego znaczenie kliniczne. Post. Biol. Kom. 2007,
34, 85.
19. Tyreman M., Abbott K.M., Willatt L.R. et al.: High
resolution array analysis: diagnosing pregnancies
with abnormal ultrasound findings. J. Med. Genet.
2009, 46, 531.
20. Wong B., Lo Y.: Cell-free DNA and RNA in plasma
as new tools for molecular diagnostics. Expert Rev.
Mol. Diagn. 2003, 3, 785.
21. Yan Z., Lambert N., Guthrie K. et al.: Male microchimerism in women without sons: quantitative assessment and correlation with pregnancy history. Am.
J. Med. 2005, 118, 899.
43