Lakazy bakteryjne

Anna Pawlik
Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie
Wydział Biologii i Biotechnologii, Instytut Biologii i Biochemii, Zakład Biochemii
ul. Akademicka 19
20-033 Lublin
[email protected]
Lakazy bakteryjne
Głównym narzędziem biotechnologii są enzymy, których właściwości (różnorodność
katalizowanych reakcji, specyficzność działania, brak produktów ubocznych, efektywność i
energooszczędność) skłaniają do przewidywania, ze już wkrótce zastąpią, w wielu przypadkach,
tradycyjne katalizatory chemiczne. Szersze wykorzystanie enzymów jest jednak ciągle ograniczone
głównie dostępnością i stosunkowo wysoką ich ceną.
Wśród licznych biokatalizatorów, które stanowią podstawę różnorodnych zastosowań w
bioprocesach biotechnologicznych lakazy reprezentują jeden z przyjaznych środowisku enzymów o
niezwykłych właściwościach i wszechstronnych możliwościach aplikacyjnych. Jak dotąd, enzymy te
używane są w przemyśle spożywczym, papierniczym, odzieżowym oraz nanobiotechnologii. Na
szczególna uwagę zasługuje ich udział w degradacji ksenobiotyków oraz odpadów przemysłowych,
klarowaniu wina, soków i piwa, produkcji kosmetyków i etanolu. W ostatnich latach duże
zainteresowanie wzbudza praktyczne wykorzystanie lakaz do konstrukcji biosensorów w diagnostyce
klinicznej i ochronie środowiska, bioogniw paliwowych oraz w medycynie.
Lakazy (benzenodiol: tlen oksydoreduktazy, EC 1.10.3.2) stanowią zróżnicowaną grupę
miedzioproteidów katalizujących utlenianie związków aromatycznych, a w szczególności substratów
fenolowych.W centrum aktywnym enzymu znajdują się cztery atomy miedzi, które warunkują
aktywność katalityczną lakazy. Ogromna liczba obecnie znanych i scharakteryzowanych oksydaz
fenolowych pochodzi z organizmów grzybowych. Obecność enzymów o aktywności lakazy
zidentyfikowano również u owadów. Stosunkowo niedawno lakazy zostały opisane u organizmów
prokariotycznych, głównie jako enzymy biorące udział w pigmentacji, sporulacji, odporności na
promieniowanie ultrafioletowe, nadtlenek wodoru oraz związki fenolowe wydzielane przez rośliny.
Pomimo wiedzy o występowaniu lakaz bakteryjnych jak dotąd udało się w pełni scharakteryzować i
oczyścić zaledwie kilka enzymów, min. pochodzących z Azospirillum lipoferum czy Bacillus subtilis.
Obecnie wydajnym źródłem lakazy z biotechnologicznego punktu widzenia są organizmy
grzybowe, jednak ich stosowanie limitowane jest niską aktywnością w procesach przemysłowych.
Obiecujące wyniki wdrożeniowe uzyskuje się w przypadku lakaz prokariotycznych. W przeciwieństwie
do lakaz grzybowych ich bakteryjne odpowiedniki wykazują unikalne, a zarazem ciekawe właściwości
fizyko – chemiczne, np. wysoka termostabilność lakazy B. subtilis, czy alkaliczna pH-stabilność
enzymu pochodzącego z γ-proteobakterii JB, co miałoby praktyczne zastosowanie w wielu gałęziach
przemysłu i pozwoliłoby na wykorzystanie enzymów bakteryjnych na szerszą skalę. Warty uwagi jest
również fakt, iż bakterie cechuje duża szybkości wzrostu i łatwość hodowli w warunkach
laboratoryjnych, co pozwala na uzyskanie w krótkim czasie preparatów enzymatycznych o wysokiej
aktywności. Jednak ze względu na brak pełnej charakterystyki preparatów katalitycznych ich
potencjał biotechnologiczny nie został w pełni wykorzystany.
Ze względu na potencjalne możliwości zastosowania lakaz bakteryjnych w biotechnologii
uzasadnione wydają się być badania mające na celu opracowanie metod selekcji, modyfikacji i
hodowli tych mikroorganizmów pod kątem produkcji lakazy oraz pozyskania jak największych ilości
aktywnego białka, a także charakterystyka uzyskanych preparatów enzymatycznych.
W związku z powyższym, praca doktorska obejmuje badania screeningowe, mające na celu
znalezienie szczepu bakteryjnego zdolnego do syntezy przemysłowych ilości aktywnego białka. W
celu intensyfikacji syntezy enzymu zostanie przeprowadzona optymalizacja składu podłoża i
warunków hodowli bakterii. Następnie w celu uzyskania wysokoaktywnych preparatów
enzymatycznych zostanie opracowana metoda oczyszczania lakazy prokariotycznej. Pozwoli to na
określenie właściwości biochemicznych i katalitycznych lakazy oraz jej charakterystykę molekularną,
co w efekcie umożliwi ocenę przydatności biotechnologicznej enzymu. W ostatnim etapie
przeprowadzona zostanie również ekspresja heterologiczna genów kodujących lakazę w innych
organizmach w celu stworzenia szczepu syntetyzującego enzym o potencjalnie najwyższej wartości
biotechnologicznej.
Implikacją powyższej pracy jest opracowanie metody biosyntezy lakazy bakteryjnej, co
pozwoli na upowszechnienie zastosowania biokatalizatorów zastępujących dotychczas stosowane w
przemyśle klasyczne metody chemiczne. Analizy zaproponowane w pracy doktorskiej przyczynią się
również do poszerzenia ogólnego stanu wiedzy z zakresu biochemii i genetyki prokariotycznych
oksydaz fenolowych. Uzyskane wyniki staną się punktem wyjścia do dalszych badań strukturalnych i
wdrożeniowych enzymu.