Wpływ mutacji w genach regulatorowych nfxB klinicznych szczepów

Transkrypt

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2009 • Volume 45 • Number 4 • 285-292
Praca oryginalna • Original Article
Wpływ mutacji w genach regulatorowych nfxB klinicznych szczepów
Pseudomonas aeruginosa na oporność na fluorochinolony
Zenobia Wydmuch1, Marta Adamek2, Olga Skowronek-Ciołek3
Laboratorium Analityczne Szpitala Specjalistycznego w Chorzowie;
Instytut Fizjologii Człowieka Akademii Wychowania Fizycznego im. Bronisława Czecha w Krakowie;
3
Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego
w Katowicach
1
2
Streszczenie
Cel badań: Niepokojący jest narastający rozwój oporności szczepów Pseudomonas aeruginosa na fluorochinolony. Z badań
genetycznych wynika, iż istotnym mechanizmem oporności są mutacje w genach regulatorowych, prowadzące do nadekspresji pomp MDR (ang. multi drug resistant) i powstawania oporności na wiele grup leków przeciwbakteryjnych. Celem pracy
było wykrycie mutacji w genach regulatorowych nfxB klinicznych szczepów P. aeruginosa, odpowiedzialnych za oporność na
fluorochinolony.
Materiał i metody: Badaniem objęto 44 izolaty P. aeruginosa wyizolowane z materiałów klinicznych od pacjentów hospitalizowanych i ambulatoryjnych. Metodą E-testów oznaczono MIC fluorochinolonów dla badanych drobnoustrojów. Wyizolowany
DNA chromosomalny pałeczek ropy błękitnej poddano reakcji amplifikacji, produkty reakcji PCR sekwencjonowano.
Wyniki: Analiza sekwencyjna części kodującej fragmentu genu nfxB badanych pałeczek pozwoliła na wykrycie 3 typów mutacji punktowych w 24/44 izolaty (Glu-124→Ala, Arg-82→Leu, Ala-15→Val) i 7 typów mutacji cichych. W 10/24 szczepy,
w których w genie nfxB występowała mutacja Glu-124→Ala, stwierdzono oporność na wszystkie użyte do badań fluorochinolony. Szczep posiadający podwójną mutację punktową: Ala-15→Val, Glu-124→Ala, również wykazywał całkowitą oporność.
Najczęściej wykrywaną mutacją w badanym fragmencie genu była mutacja punktowa Glu-124→Ala, którą zidentyfikowano
w 24/44 badane izolaty, wykazywały one wysoką oporność na fluorochinolony.
Wnioski: Przedstawione wyniki badań wskazują na znaczący wpływ mutacji w genie nfxB pałeczek P. aeruginosa w nabywaniu
oporności na fluorochinolony.
nfxB genes mutations and their impact on resistance to fluoroquinolones of Pseudomonas aeruginosa clinical
strains
Summary
Aim: The growing concern is rising resistance to fluoroquinolones of Pseudomonas aeruginosa strains. The genetic testing
shows that an important mechanism of resistance is due to mutations in the analyzed ntxB regulatory genes, leading to overexpression of mutidrug resistance MDR pumps and to formation of resistance to many groups of antibacterial drugs.
The purpose of this study was to detect mutations in nfxB regulatory genes of P. aeruginosa clinical strains, responsible for
resistance to fluoroquinolones.
Materials and methods: The study included 44 isolates of P. aeruginosa taken from patients hospitalized or from ambulatory
patients. E-test method was used to determine MICs for all the fluoroquinolones tested. Bacterial DNA isolates were amplified,
and subsequently the PCR reaction products were sequenced.
Results: Sequencing analysis of the nfxB genes revealed 3 types of point mutations in the 24 of 44 isolates and 7 types of
silent mutations. In 10 of 24 strains in which the nfxB genes mutations were detected, mutations at Glu-124-Ala were found to
code resistance to all fluoroquinolones used in our research. The strain bearing the double point mutation: at Ala-15-Val, and
Glu-124-Ala, also showed the total drug resistance. The most frequently detected nfxB gene mutation was point mutation described at Glu-124-Ala, which was identified in 24 of 44 isolates tested, and also showed high resistance to fluoroquinolones.
Conclusions: Our results indicate a significant impact of nfxB genes mutations on the aquisition of Pseudomonas aeruginosa
resistance to fuoroquinolones.
Słowa kluczowe:Pseudomonas aeruginosa, oporność, geny regulatorowe, mutacja cicha, mutacja punktowa, nfxB, sekwencjonowanie, fluorochinolony
285
Wpływ mutacji w genach regulatorowych nfxB klinicznych szczepów Pseudomonas aeruginosa na oporność ...
Key words:Pseudomonas aeruginosa, resistance, regulatory genes, silent mutation, point mutation, nfxB, sequence analysis, fluoroquinolones
Wstęp
Pałeczki P. aeruginosa należą do bakterii szeroko rozpowszechnionych w przyrodzie. Występują pospolicie w wodzie,
glebie, ściekach i żywności. Stanowią również fizjologiczną
florę przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. Szczepy tego
gatunku mogą być także czynnikiem etiologicznym zakażeń
układu oddechowego, dróg moczowych, zapalenia ucha
środkowego i zatok, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych,
kości i szpiku kostnego, zapalenia osierdzia i wsierdzia, zapalenia spojówek oka oraz zatrucia pokarmowego [4, 14].
Chemioterapia zakażeń wywołanych pałeczką P. aeruginosa
stanowi jedno z najtrudniejszych zagadnień lecznictwa. Wynika to z faktu istnienia szczepów opornych na wiele antybiotyków oraz łatwości pojawiania się oporności na antybiotyki aktualnie stosowane. Pałeczka ropy błękitnej wykazuje
wysoką naturalną oporność na penicylinę G, ampicylinę,
cefalosporyny I i II generacji, tetracykliny, linkosamidy i stare
chinoliny. Aktywność wobec tego gatunku mogą wykazywać
karbenicylina, tykarcylina, ureidopenicyliny, aztreonam, cefalosporyny III i IV generacji, karbapenemy, aminoglikozydy
i fluorochinoliny [2, 3, 10, 16, 18].
Fluorochinolony to grupa leków przeciwbakteryjnych, które w odróżnieniu od starych chinolonów charakteryzują się
aktywnością wobec pałeczek niefermentujących (P. aeruginosa, Acinetobacter sp.), a także niektórych ziarenkowców
Gramdodatnich. Rozwój oporności na fluorowane chinolony
ogranicza skuteczność stosowania tych względnie nowych
chemioterapeutyków. Niepokojący jest zwłaszcza niespodziewanie szybki rozwój oporności szczepów P. aeruginosa.
Oporność na fluorochinolony u tych drobnoustrojów może
wynikać z modyfikacji miejsca w komórce, będącego punktem uchwytu leku – mutacje w genach gyrA i parC, zmniejszonego przenikania leku przez zewnętrzną błonę komórkową oraz mutacji w genach regulatorowych prowadzących do
nadekspresji pomp MDR (ang. multi drug resistant), skutecznie usuwających chinoliny z komórki bakteryjnej. Wymienione powyżej mechanizmy uwarunkowane są chromosomalnie [1, 8, 11].
Kodowana chromosomalnie oporność nie jest przenoszona
horyzontalnie, a pojedyncza mutacja nie powoduje powstania oporności o znaczeniu klinicznym. Fenotyp oporności
nadaje kombinacja mutacji w silnie konserwatywnym re-
gionie chromosomu, tak zwanym regionie warunkującym
oporność na chinolony – QRDR (ang. Quinolone Resistant
Determination Region) i dodatkowo w regulatorowym locus
mar, które jest zaangażowane w aktywne wydalanie leku
z komórki oraz zmniejszone jego pobieranie, przez redukcję syntezy powierzchniowego białka OmpF. U P. aeruginosa za ten mechanizm odpowiedzialny jest operon kodowany przez geny mex (ang. multiple efflux). Pompy te
zwykle współdziałają z systemami wspomagającymi. U P.
aeruginosa zidentyfikowano 5 pomp efflux: MexAB-OprM,
MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM i ostatnio odkryta MexVM-OprM.
Cztery pierwsze pompy efflux są regulowane m.in. przez
geny: nfxB, mexR, mexT i mexZ. Mutacje występujące w obrębie któregoś z wyżej wymienionych genów regulatorowych
są odpowiedzialne za zwiększenie ekspresji odpowiednich
pomp efflux, wyrzut fluorochinolonu z komórki i rozwój oporności. Proces ten przyczynia się do spadku stężenia wewnątrzkomórkowego leku i wzrostu wartości MIC [1, 8, 9,
13, 15, 17, 20].
Celem niniejszej pracy było poszukiwanie mutacji w genach
regulatorowych nfxB klinicznych szczepów P. aeruginosa
odpowiedzialnych za oporność na fluorochinolony.
Materiał i metody
Przedmiotem badań były 44 szczepy pałeczek P. aeruginosa, które wyizolowano z materiału klinicznego (wymazy
z gardła, z rany, z ucha, przetoki, mocz), pochodzącego od
pacjentów hospitalizowanych i ambulatoryjnych, w Zakładzie
Mikrobiologii Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego
Nr 5 im. Św. Barbary w Sosnowcu.
Metodą E-testów wykonano badanie lekowrażliwości szczepów P. aeruginosa, oznaczając MIC 5. fluorochinolonów:
ciprofloksacyny (CI), ofloksacyny (OF), pefloksacyny (PE),
sparfloksacyny (SO) i norfloksacyny (NX). Do badania wykorzystano podłoże agar Hinton-Müller (HMA) oraz paski
E-test® (firmy AB®Biodisk), posiewy inkubowano w temperaturze 35°C 18-24 h, następnie odczytywano wartości
MIC użytych do badań antybiotyków, zgodnie z zalecanymi
NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (tab. I). Wykonano również badanie kontrolne z użyciem szczepu wzorcowego P. aeruginosa ATCC 27853 [5].
Tabela I.
Zakresy wrażliwości szczepów P. aeruginosa na wybrane do badań fluorochinolony.
Stopień wrażliwości
Wrażliwy
286
Zakresy wartości stężeń (μg/ml) fluorochinolonów na pasku E-testu
CI
OF
PE
SO
NX
≤1
≤2
≤2
≤0,5
≤4
Średnio wrażliwy
2
4
4
1
8
Oporny
≥4
≥8
≥8
≥2
≥16
Z. Wydmuch, M. Adamek i O. Skowronek-Ciołek
Kolejnym etapem badania była izolacja chromosomalnego
DNA z komórek badanych szczepów, przy użyciu zestawu
QIAmp® DNA Mini Kit(QIAGEN), zgodnie z załączonym protokołem. W celu potwierdzenia obecności wyizolowanego
DNA wykonano elektroforezę w 1,5% żelu agarozowym. Następnie dobrano odpowiednie startery i warunki reakcji PCR
do identyfikacji fragmentów genu nfxB.
Sekwencję genu nfxB (GB:X65646) P. aeruginosa wyszukano
w bazie GenBank® (www.ncbi.nlm.nih.gov/), następnie dobrano właściwe startery komplementarne do amplifikowanej sekwencji badanego genu, które przedstawiono w tabeli II.
Potwierdzenie sekwencji nukleotydowej starterów dla genu
nfxB uzyskano z danych literaturowych [20] i potwierdzono
w GenBank®. Ustalone doświadczalnie warunki reakcji PCR
programowano w termocyklerze Personal Thermocycler
(BIOMETRA). Do reakcji amplifikacji wykorzystano zestaw
2xPCR Master Mix (Fermentas) oraz startery robocze o stężeniu 5 pmol/μl. Doświadczalnie ustalono profil temperaturowy reakcji PCR dla amplifikowanego fragmentu genu nfxB:
I etap: Termiczna aktywacja polimerazy DNA Taq (95˚C –
3 min)
II etap: Denaturacja (94˚C – 1 min)
Przyłączenie starterów (56˚C – 1 min)
Wydłużanie starterów (72˚C – 1 min)
35 cykli reakcji PCR (I i II etap) dla amplifikowanego fragmentu genu nfxB
III etap: Końcowe wydłużanie (72˚C – 10 min).
Produkty amplifikacji badanego fragmentu genu uzyskano
dla 24 szczepów. Potwierdzeniem obecności genu nfxB był
prążek na żelu agarozowym o wielkości 584 pz. Fragmenty
genu nfxB poddawano reakcji sekwencjonowania, badanie
to przeprowadzono w Pracowni Sekwencjonowania DNA
i Syntezy Oligonukleotydów IBB PAN w Warszawie. PCR
sekwencyjny produktów amplifikacji genu nfxB wykonano
z wykorzystaniem komercyjnego zestawu DNA Sequencing
Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing v3.1. Badany fragment genu nfxB amplifikowano w warunkach przedstawio-
nych w tabeli III. Analizę uzyskanych wyników dotyczących
sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej przeprowadzono
z zastosowaniem programów: FinchTV ≥ 1.3.0 oraz GenDoc
A.zip. Przy użyciu wyżej wymienionych programów przeprowadzono porównanie sekwencji genu nfxB szczepu dzikiego
(GB:X65646) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) z genami nfxB
badanych izolatów.
Wyniki
Szczegółową ocenę wrażliwości 44 klinicznych szczepów
P. aeruginosa oraz szczepu wzorcowego przedstawiono w
tabeli IV. Analizując wyniki badań, zaobserwowano, iż pałeczki ropy błękitnej wykazują najwyższą wrażliwość na
norfloksacynę: 25/44 szczepy (56,82%) i ciprofloksacynę:
21/44 szczepy (47,73%), natomiast badane izolaty najbardziej oporne były na sparfloksacynę: 33/44 szczepy (75%),
pefloksacynę: 27/44 (61,36%) i ofloksacynę: 24/44 szczepy
(54,54%). W badaniach stwierdzono, że szczepy kliniczne
izolowane z materiału od pacjentów hospitalizowanych charakteryzowały się dużo wyższą opornością niż te wyhodowane od pacjentów z poradni. Wszystkie badane szczepy,
w których wykryto gen nfxB (24/44 szczepy), poddano sekwencjonowaniu. Wyniki uzyskanych fragmentów genu nfxB
24 badanych izolatów przedstawiono w tabeli V w zestawieniu z wartościami MIC fluorochinolonów.
Wykonując sekwencjonowanie fragmentu genu nfxB badanych pałeczek ropy błękitnej, wykryto 3 typy mutacji
punktowych ze zmianą w sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej: GAA→GCC(Glu-124→Ala), CGC→CTC(Arg82→Leu) i GCA→GTA( Ala-15→Val) oraz 7 typów mutacji
cichych, wyłącznie ze zmianą w sekwencji nukleotydowej,
w 13 badanych szczepach. Na rycinie 1 pokazano miejsce mutacji punktowej w kodonie 82, którą porównano
z sekwencją fragmentu genu nfxB szczepu POA. Mutację
punktową Glu-124→Ala wykryto we wszystkich poddanych
analizie sekwencyjnej szczepach, zmianę aminokwasową
Arg-82→Leu w 8 izolatach, zaś mutację Ala15→Val stwier-
Tabela II.
Startery użyte w reakcji PCR.
Nazwa
Sekwencja nukleotydowa ( 5’ - 3’)
nfxB
1F
nfxB
2R
Stężenie
μM
μg/μl
5’-AAAACCAACCGGGACCCATC-3’
(20 nukleotydów)
313
1,89
5’-CAGGAGCGAGCCGGATT-3’
(17 nukleotydów)
314
1,65
Tabela III.
Profil temperaturowy i czasowy amplifikacji sekwencyjnej genu nfxB (ilość cykli 25).
Temperatura
Czas
94°C
10 s
52°C
20 s
60°C
4 min
Długość fragmentu genu
584 pz
dzono u 1 mutanta pałeczki ropy błękitnej. Spośród 24 badanych szczepów mutację cichą posiadało: 10 izolatów w kodonie 160. (Arg-160→Arg), 8 w kodonach 13. (Ala-13→Ala),
61. (Val-61→Val), 141. (Ala-141→Ala) i 162. (Gly-162→Gly)
oraz 1 szczep w dwóch kodonach: 42. (Arg-42→Arg) i 129.
(Gly-129→Gly). Stwierdzono, że szczepy P. aeruginosa posiadające mutację w genie regulatorowym nfxB izolowane
287
Tabela IV.
Wrażliwość (MIC) badanych szczepów P. aeruginosa oraz szczepu wzorcowego ATCC 27853 na fluorochinolony (CI,
OF, PE, SO, NX).
Wrażliwość na fluorochinolony [MIC (μg/ml)]
Numer
szczepu
Wb
CI
OF
PE
SO
NX
MICa
MICa
MICa
MICª
MICa
Sb
Ob
Wb
Sb
Ob
Wb
Ob
Wb
Sb
Ob
Wb
Sb
2
3
>32
32
>32
8
3
3
16
24
16
8
>32
24
16
8
8
4
2
5
1,5
6
9
4
2
>32
0,125
10
0,75
24
1
2
>32
6
8
12
0,5
8
0,32
24
>32
8
8
8
0,75
16
0,64
0,75
1
0,5
0,38
17
0,94
0,5
1
0,5
0,38
19
0,95
0,75
1
2
27
>32
0,38
4
0,5
16
16
24
>32
>256
>32
4
>256
29
0,94
0,75
1
0,5
0,38
30
0,94
0,5
1
0,5
0,38
36
2
40
42
>32
1
43
44
1,5
0,25
0,5
50
0,25
16
32
>256
>32
12
8
8
4
16
8
12
4
2
1
>256
>32
2
>32
49
32
>32
2
47
>32
3
3
2
2
Ob
3
15
26
8
>256
>256
3
2
2
1
54
>32
>32
>256
>32
>256
69
>32
>32
>256
>32
>256
70
>32
>32
>256
>32
>256
71
>32
>32
>256
>32
>256
76
>32
>32
>256
>32
>256
90
0,094
0,75
0,75
0,5
0,25
91
>32
>32
>256
>32
>256
93
>32
>32
>256
>32
>256
94
>32
>32
>256
>32
>256
95
96
>32
0,25
>32
1
102
0,064
105
1
106
0,094
107
1
110
0,094
112
0,5
115
0,75
120
0,38
0,25
>256
1
1,5
0,5
0,75
4
4
16
6
0,38
6
8
8
2
2
A – MIC w μg/ml
B – stopień wrażliwości: W – wrażliwy, S – średnio wrażliwy, O – oporny
0,5
1,5
3
16
2
>256
0,25
0,38
32
4
>32
8
1
>256
0,5
0,25
3
1,5
>32
0,5
>32
0,5
2
ATCC 27853
>256
1,5
>32
104
119
288
Sb
4
0,38
3
1,5
4
2
4
4
2
1
1
Tabela V.
Zestawienie MIC fluorochinolonów ze zmianami w genach regulatorowych nfxB zmutowanych szczepów P. aeruginosa.
CI
OF
PE
SO
NX
Zmiany w sekwencji nukleotydowej
i aminokwaowej w genie nfxB
ATCC 27853
0,25
1,5
2
0,5
1
-a
2
3
>32
32
>32
8
Arg(CGC)82→Leu(CTC)
Glu(GAA)124→Ala(GCC)
3
3
16
24
16
8
4
2
>32
24
16
8
6
2
>32
24
12
8
Ala(GCG)13→Ala(GCA)c
Val(GTA)61→Val(GTG)c
Arg (CGT)160→Arg (CGC)c
Gly(GGA)162→Gly(GGT)c
10
2
>32
24
12
8
26
2
16
16
24
4
36
2
32
16
32
8
>256
40
c
>32
>32
>256
>32
42
1
12
8
8
4
43
1,5
16
8
12
4
44
0,25
2
2
2
1
47
>32
>32
>256
>32
>256
50
0,25
2
2
2
1
>256
54
a
MIC(µg/ml)
Numer
szczepu
>32
>32
>256
>32
70
>32
>32
>256
>32
>256
71
>32
>32
>256
>32
>256
Gly(GGA)129→Gly(GGC)c
– brak mutacji
– mutacja cicha
289
Tabela V.
cd.
CI
OF
PE
SO
NX
Zmiany w sekwencji nukleotydowej
i aminokwaowej w genie nfxB
ATCC 27853
0,25
1,5
2
0,5
1
-a
>256
76
a
c
MIC(µg/ml)
Numer
szczepu
>32
>32
>256
>32
91
>32
>32
>256
>32
>256
93
>32
>32
>256
>32
>256
Arg(CGT)160→Arg(CGC)c
94
>32
>32
>256
>32
>256
102
>32
>32
>256
>32
>256
Ala(GCA)15→Val(GTA)
105
1
3
8
4
1,5
107
1
32
16
16
4
Arg(CGC)42→Arg(CGA)c
112
0,5
4
2
3
1,5
– brak mutacji
– mutacja cicha
były w większości z materiału klinicznego pochodzącego od
pacjentów hospitalizowanych.
W 10/24 badane izolaty, w których występowała mutacja
punktowa Glu-124→Ala w badanym fragmencie genu nfxB:
stwierdzono oporność na wszystkie użyte do badań fluorochinolony. Mutanty posiadające jednocześnie 2 zmiany
aminokwasowe: Glu-124→Ala i Arg-82→Leu w większości
wykazywały oporność na 3 chemioterapeutyki (SO, PE, OF),
podczas gdy jeden szczep nr 102, posiadający podwójną
mutację: Ala-15→Val i Glu-124→Ala, był oporny na wszystkie wykorzystane do badań fluorochinolony.
Dyskusja
Chemioterapia zakażeń wywołanych pałeczką P. aeruginosa
stanowi obecnie jedno z najtrudniejszych zagadnień lecznictwa. Wynika to z faktu istnienia szczepów opornych na wiele
antybiotyków oraz łatwości pojawiania się oporności na antybiotyki aktualnie stosowane. Zagadnienie to dotyczy także,
jednej z najnowszych grup leków przeciwbakteryjnych – flu290
orowanych chinolonów. Z badań genetycznych wynika, że
za oporność na tę grupę chemioterapeutyków u P. aeruginosa jest odpowiedzialnych kilka mechanizmów. Jeden z nich
dotyczy występowania mutacji w genach regulatorowych P.
aeruginosa prowadzących do nadekspresji pomp efflux [6,
12, 19].
W niniejszej pracy zajęto się poszukiwaniem mutacji w genach regulatorowych nfxB odpowiedzialnych za oporność na
fluorochinolony klinicznych szczepów P. aeruginosa. Przeprowadzona przez nas analiza sekwencyjna fragmentu genu
nfxB pałeczek ropy błękitnej pozwoliła na wykrycie 3 typów
mutacji punktowych: Glu-124→Ala (24 szcz.), Arg-82→Leu
(8 szcz.) i Ala-15→Val (1 szcz.) oraz 7 typów mutacji cichych
w 13 badanych szczepach.
Podobne badania w swojej pracy przeprowadzili Jalal
i Wretling [8]. Spośród 16 poddanych analizie sekwencyjnej
szczepów P. aeruginosa w pracy badaczy 2 izolaty posiadały
mutację punktową z wymianą aminokwasu w genie nfxB. Jeden ze szczepów posiadał substytucję aminokwasu w kodo-
Rycina 1.
Zmiana sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej w genie nfxB szczepu badanego Pseudomonas aeruginosa nr 2:
CGC→CTC (Arg-82→Leu), w odniesieniu do genu nfxB szczepu dzikiego PAO (GB X 65646).
nie 30 (Ala-30→Thr), zaś drugi w kodonie 62 (Leu-62→Val).
Identyczne zmiany w przeprowadzonych przez siebie badaniach uzyskali Oh i wsp. [13]. Wykryli oni obecność tych
samych mutacji punktowych w genie nfxB co Jalal i Wretling. Badacze zaobserwowali także, iż mutacje w genie nfxB
występowały najczęściej w szczepach o wysokim poziomie
oporności na norfloksacynę (MIC>64μg/ml) i ciprofloksacynę (MIC>32 μg/ml).
W celu zidentyfikowania mutacji punktowych w genach
gyrA, gyrB, parC, parE, nfxB oraz mexR Kugelberg i wsp.
[9] wykonali sekwencjonowanie produktów PCR wymienionych fragmentów genów szczepów P. aeruginosa. Uzyskane
przez badaczy wyniki wykazały obecność 2 nowych mutacji punktowych w genie nfxB: Leu-40→Gln, Gln-131→stop
w 2 badanych izolatach. Oba zmutowane szczepy charakteryzowały się wysoką opornością na norfloksacynę
(MIC>256 μg/ml).
Jalal i wsp. [7] badali 20 szczepów P. aeruginosa pobranych
od pacjentów ze zwłóknieniem torbielowatym. Izolaty ba-
dano pod kątem mutacji punktowych w genach gyrA, parC,
nfxB i mexR związanych z opornością na fluorochinolony.
16 szczepów P. aeruginosa posiadało mutacje w genie nfxB
w pozycji 82 (Arg 82→Leu). Średnie wartości MIC ciproflkosacyny dla tych szczepów wyniosły 4-8 μg/ml. Dla porównania w naszych badaniach mutację w kodonie 82 wykryliśmy
w 8/24 izolaty. Wartości MIC CI dla zmutowanych szczepów
wyniosły od 0,25 do 3 μg/ml.
Przedstawione wyniki badań wskazują na znaczący udział
mutacji w genie nfxB w nabywaniu oporności na fluorochinolony. Nadmierna ekspresja pompy bakteryjnej MexCD-OprJ
spowodowana mutacjami w badanym genie regulatorowym
doprowadza do redukcji wewnątrzkomórkowego stężenia
leku i obniżenia wartości stężenia hamującego MIC antybiotyków. Lomovskaya i wsp. [11] twierdzą w swojej pracy, iż
hamowanie pomp wypływu P. aeruginosa może znacząco
zwiększyć kliniczne zastosowanie fluorochinolonów. Można
się spodziewać, że hamowanie pomp bakteryjnych spowoduje zmniejszenie poziomu wewnętrznej oporności, znaczą291
co cofnie nabytą oporność i zmniejszy częstość występowania mutantów wysoce opornych na chinolony. Dlatego też
należy prowadzić dalsze badania dotyczące pomp bakteryjnych, a także innych mechanizmów oporności pałeczek
ropy błękitnej na fluorochinolony, które pozwolą zwiększyć
skuteczność tych leków w leczeniu zakażeń bakteryjnych.
Wnioski
Analiza sekwencyjna fragmentu genu nfxB pałeczek Pseudomonas aeruginosa opornych na fluorochinolony (CI, OF,
PE, SO, NX) pozwoliła na wykrycie 3 typów mutacji punktowych: Glu(GAA)124→Ala(GCC), Arg(CGC)82→Leu(CTC),
Ala(GCA)15→Val(GTA) oraz 7 typów mutacji cichych.
Najczęściej wykrywaną mutacją w badanym genie nfxB pałeczek ropy błękitnej była mutacja punktowa: Glu-124→Ala,
którą stwierdzono u wszystkich poddanych sekwencjonowaniu szczepów.
Stwierdzono, że szczepy pałeczki ropy błękitnej wykazujące
obecność mutacji w genie nfxB izolowane były w większości
z materiału klinicznego pochodzącego od pacjentów hospitalizowanych niż leczonych ambulatoryjnie.
Nabywanie oporności na antybiotyki, może odbywać się
na drodze mutacji w bakteryjnym genomie. Ze względu na
szybki cykl replikacyjny drobnoustrojów, spontaniczne mutacje punktowe oraz rearanżacje materiału genetycznego,
mogą być przyczyną powstawania szczepów opornych,
a stosowany antybiotyk może odgrywać rolę selekcjonera,
pozwalającego na wzrost jedynie tym komórkom, które prezentują oporność.
Piśmiennictwo
1. Bedearden DT, Danziger LH. Mechanizm
��
of action of and resistance to quinolones. Pharmacotherapy 2001; 21 (10): 224-232.
2. Betlejewska-Kielak K, Fiett J. Nowe fluorochinolony w leczeniu
bakteryjnych zakażeń układu oddechowego. Nowa Klinika Antybiotykoterapia 2001; 8: 925-927.
3. Carewicz R. Fluorochinolony w zakażeniach układu oddechowego. Nowa Klinika 1999; 6(3): 338-340.
4. Gniadkowski M, Gryko R, Grzybowski J i wsp. Pałeczki Gram-ujemne niefermentujące glukozy (rodzaje: Pseudomonas,
Burkholderia, Stenotrophomonas i Acinetobacter) Grzybowski
J, Reiss J. Praktyczna bakteriologia lekarska i sanitarna. Dom
Wydawniczy Bellona. Warszawa 2001.
5. Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypa K i wsp. Rekomendacje
doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki
i chemioterapeutyki. Diagn Lab 2004; 40: 41-64.
6. Hryniewicz W, Mészáros J. Antybiotyki w profilaktyce i leczeniu
zakażeń. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 2001.
7. Jalal S, Ciofu O, Hoiby N i wsp. Molecular
��
mechanisms of fluoro-
292
quinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from
cystic fibrosis patients. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44:
710-712.
8. Jalal S, Wretling B. Mechanisms of quinolone resistance in clinical strains of Pseudomonas aeruginosa. Microb Drug Resist
1998; 4(4): 257-261.
9. Kugelberg E, Löfmark S, Wretlind B i wsp. ��
Reduction of the fitness burden of quinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa. J Antimicrob Chemother 2005; 55: 22-30.
10. Laudy AE, Starościak BJ. ß – laktamazy pałeczek z rodziny
Pseudomonadaceae. Postępy Mikrobiol 2000; 39: 99-132.
11. Lomovskaya O, Warren MS, Lee A i wsp. Identyfication
��
and characterization of inhibitors of multidrug resistance efflux pumps in
Pseudomonas aeruginosa: novel agents for combination therapy. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45(1):105-116.
12. Nowak K, Suryło P, Kowalski P. Chinolony – przeciwbakteryjne
chemioterapeutyki. Farmacja Pol 2002; 58(7): 336-342.
13. Oh H, Stenhoff J, Jalal S i wsp. Role
��
of efflux pumps and mutations in genes for topoisomerases II and IV in fluoroquinolone –
resistant Pseudomonas aeruginosa strains. Microb Drug Resist
2003; 9: 323-328.
14. Romaniszyn D. Pałeczki Gram(-) w zakażeniach szpitalnych.
Zakażenia. Antybiotykoterapia 2005; 5: 28-30.
15. Schweitzer HP. Efflux as a mechanizm of resistance to antimicrobials in Pseudomonas aeruginosa and related bacteria:
unanswerd questions. Genetics and Molecular Research 2003;
2(1): 48-62.
16. Steciwko A, Kurpas D. Chinolony w praktyce lekarza rodzinnego. Standardy Med 2003; 2(38): 808-812.
17. Wydmuch Z, Pacha J, Kępa M i wsp. Oporność na chinolony
wybranych ziarenkowców Gram-dodatnich izolowanych z materiału klinicznego w szpitalu regionu śląskiego. Diagn Lab 2003;
39: 515-521.
18. Wydmuch Z, Pacha J, Kępa M i wsp. Wrażliwość na fluorochinolony szczepów Pseudomonas aeruginosa izolowanych z materiału klinicznego. Med Dośw i Mikrob 2003; 55: 165-171.
19. Wydmuch Z, Skowronek-Ciołek O, Cholewa K i wsp. ��
Gyr A mutations in ciprofloxacin-resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in a Silesian Hospital in Poland. Polish J Microb
2005; 54(3): 201-206.
20. Ziha-Zarifi I, LLanes C, Kohler T i wsp. In vivo emergence of
multidrug-resistant mutants of Pseudomonas aeruginosa overexpressing the active efflux system MexA-MexB-OprM. Antimicrob Agents and Chemother 1999; 43(2): 287-291.
Adres Autorów:
Laboratorium Analityczne
Szpitala Specjalistycznego w Chorzowie
ul. Zjednoczenia 10
41-500 Chorzów
e-mail: [email protected]
(Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-02-12)
(Praca przekazana do opublikowania: 2009-12-04)

Wpływ mutacji w genach regulatorowych nfxB klinicznych szczepów

Transkrypt

Podobne dokumenty

Uchwała Nr 175 XXII 92

Marzec Rok szkolny 2012/2013

Ida Pierelotkin, Ala Betka - Cała Polska Czyta Dzieciom

Ala ma kota - Warsztaty Bibliotekarskie

1. Uzupełnij biblioteki z poprzednich zajęć o makra ułatwiające

Zestaw zadan nr. 9

pobierz - Kraków - Targi w Krakowie