LightCycler® MRSA Advanced Test For Use With The

Transkrypt

LightCycler® MRSA Advanced Test
For Use With The LightCycler® 2.0 Instrument
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
LightCycler® Advanced Lysis Kit
LC MRSA
96 Tests
P/N: 05352894 190
LYS ADV
96 Tests
P/N: 05205743 190
ZASTOSOWANIE
Test LightCycler® MRSA Advanced jest jakościowym testem diagnostycznym in vitro, służącym do
bezpośredniego wykrywania kolonizacji jamy nosowej przez szczepy Staphylococcus aureus oporne
na metycylinę (MRSA, ang. methicillin-resistant S. aureus) i ułatwiającym zapobieganie zakażeniom
MRSA oraz ich kontrolowanie w ośrodkach służby zdrowia. Test jest przeprowadzany z wykorzy®
staniem urządzenia LightCycler 2.0 na wymazach z jamy nosowej pacjentów, u których podejrzewa
się kolonizację. W celu przygotowania próbki wykonuje się ekstrakcję z wymazówki oraz lizę mechaniczną, a następnie przeprowadzana jest łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR), w której amplifikowane jest DNA MRSA, oraz detekcja zamplifikowanego DNA za pomocą fluorogennych sond
hybrydyzacyjnych swoistych dla sekwencji docelowej.
Test LightCycler® MRSA Advanced nie jest przeznaczony do diagnostyki zakażeń MRSA ani jako
środek umożliwiający wybór sposobu ich leczenia lub kontrolę postępów leczenia. Dodatkowe
zakładanie hodowli jest konieczne, aby uzyskać mikroorganizmy do typowania epidemiologicznego
lub dalszego badania wrażliwości.
PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIE TESTU
Staphylococcus aureus jest oportunistycznym patogenem przenoszonym jako mikroorganizm
komensalny na skórze i w nozdrzach około 30% zdrowych osób, posiadającym zdolność wywoływania szerokiego spektrum chorób, powodujących śmierć w ciągu 30 dni od zakażenia w około
34% przypadków1,2. Staphylococcus aureus potrafi szybko przystosowywać się do selektywnej antybiotykoterapii, co doprowadziło do powstania i rozprzestrzenienia szczepów Staphylococcus aureus
opornych na metycylinę (MRSA). Gen mecA jest zlokalizowany na dużym ruchomym elemencie
genetycznym zwanym gronkowcową kasetą chromosomową mec (SCCmec) i jest odpowiedzialny za
oporność na metycylinę i inne antybiotyki β-laktamowe. Gen mecA koduje zmienione białko wiążące
penicylinę, PBP2a lub PBP2’, które ma bardzo niskie powinowactwo do wszystkich antybiotyków
β-laktamowych, co umożliwia prawidłową syntezę warstwy peptydoglikanu nawet w obecności tych
antybiotyków3. Powstało wiele szczepów MRSA, które rozprzestrzeniły się na całym świecie,
a kaseta SCCmec została pozyskana przez szczepy Staphylococcus aureus4 wrażliwe na metycylinę,
pochodzące z różnych rejonów. Dotychczas rozróżniono siedem typów kasety SCCmec (I–VII)
i opisano kilka odmian typów tejże kasety SCCmec4.
Zakażenia szpitalne (HAIs, ang. healthcare associated infections) wywoływane przez MRSA stały się
ostatnio ważnym problemem dla ośrodków służby zdrowia na całym świecie z powodu dużej
częstotliwości zakażeń, wysokiej śmiertelności i wysokich kosztów leczenia5-8. Co więcej, w ciągu
ostatnich kilku lat doszło do rozprzestrzenienia pozaszpitalnych szczepów MRSA (CA-MRSA, ang.
community-associated MRSA)9, co sprzyja zakażeniom szpitalnym10, 11 i uwydatnia potrzebę istnienia
kompleksowych programów kontroli infekcji. Aby pomóc placówkom wybrać priorytety i wdrożyć
działania zapobiegające rozprzestrzenianiu MRSA, w 2008 roku podsumowano zalecenia zawarte
w opublikowanych wytycznych kilku organizacji zdrowia publicznego oraz organizacji rządowych i zawodowych12. Każdy program zapobiegający rozprzestrzenianiu MRSA musi obejmować wiele kluczowych strategii, w tym aktywne przesiewowe badania kontrolne, higienę rąk, izolację chorego i inne
działania zapobiegające rozprzestrzenianiu. W porównaniu ze standardowymi testami hodowlanymi,
Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu.
05548942001-04PL
1
Doc Rev. 4.0
detekcja szczepów MRSA za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym znacznie skraca czas
potrzebny do wykrycia (poniżej 2 godzin pracy laboratoryjnej) i z tego względu poprawia skuteczność
strategii kontroli i postępowania.
ZASADY PROCEDURY
Wykrywanie szczepów MRSA za pomocą testu LightCycler® MRSA Advanced jest oparte na 3 głównych
procesach:
•
przygotowaniu próbki przez mechaniczną lizę ścian komórkowych bakterii,
•
amplifikacji docelowego DNA metodą PCR i detekcji za pomocą swoistych sond
hybrydyzacyjnych,
•
automatycznym generowaniu wyniku po przeprowadzeniu analizy pików temperatur
topnienia.
Przygotowanie próbki
Mechaniczna liza wymazów z jamy nosowej jest przeprowadzana za pomocą zestawu do lizy
LightCycler® Advanced oraz urządzenia MagNA Lyser. Główki wymazówek są ucinane, umieszczane
w probówkach do lizy i poddawane ogrzewaniu w celu inaktywacji wszystkich bakterii. Następnie
probówki do lizy są przenoszone do urządzenia MagNA Lyser, gdzie zachodzi liza mechaniczna
ścian komórkowych bakterii, w wyniku której powstają surowe lizaty. Po krótkim wirowaniu, mającym
osadzić na dnie szklane kuleczki i włókna wacika, przetworzone próbki są przenoszone do kapilary
i poddawane analizie PCR z zastosowaniem testu LightCycler® MRSA Advanced i urządzenia
®
LightCycler 2.0.
Amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
W teście LightCycler® MRSA Advanced primery i sondy wykrywają zastrzeżoną sekwencję, wskazującą
na włączenie kasety SCCmec do chromosomu Staphylococcus aureus, co wskazuje na obecność
DNA MRSA.
Amplifikacja
Przetworzone próbki oraz mieszanina amplifikacyjna zawierająca polimerazę Taq aktywowaną
w wysokiej temperaturze są umieszczane w kapilarach urządzenia LightCycler® (20 µl), w których
zachodzi amplifikacja PCR. Każda reakcja testu LightCycler® MRSA Advanced zawiera wewnętrzną
próbę kontrolną, która służy do kontroli inhibicji próbki i monitorowania niezawodności odczynników.
Enzym AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) zawarty w teście LightCycler® MRSA Advanced rozpoznaje
nici DNA zawierające dezoksyurydynę, ale nie DNA zawierającego dezoksytymidynę, i katalizuje
niszczenie tych pierwszych. Ze względu na fakt, że amplikony wytwarzane za pomocą testu
LightCycler® MRSA Advanced zawierają dezoksyurydynę, potencjalne zanieczyszczenia amplikonu
są likwidowane podczas etapu wydłużonego ogrzewania, zachodzącego przed rozpoczęciem
amplifikacji PCR.
Sekwencja docelowa w plazmidzie jest jednocześnie amplifikowana w dodatniej próbie kontrolnej
(PC, ang. Positive Control). Dodatnia próba kontrolna służy do monitorowania defektów odczynników
i jest uwzględniona w każdym przebiegu testowym. Każdy przebieg testowy zawiera również ujemną
próbę kontrolną (NC, ang. Negative Control), która służy do wykrycia zanieczyszczenia odczynników
lub otoczenia przez DNA MRSA.
05548942001-04PL
2
Doc Rev. 4.0
Swoista detekcja produktów reakcji PCR za pomocą sond hybrydyzacyjnych
Amplikony MRSA i amplikony wewnętrznej próby kontrolnej są wykrywane przez fluorescencję, za
pomocą określonej pary sond hybrydyzacyjnych. Sondy wiążą się z określoną sekwencją w zamplifikowanym fragmencie w bliskiej odległości od siebie. Po wzbudzeniu związane sondy emitują sygnał
fluorescencyjny o określonej długości fali w procesie zwanym „fluorescencyjnym rezonansowym przeniesieniem energii” (FRET, ang. Fluorescence Resonance Energy Transfer). Emitowane światło jest
mierzone przez urządzenie LightCycler® 2.0. Amplikony swoiste dla MRSA i wewnętrznej próby kontrolnej wykrywa się równolegle w dwóch różnych kanałach detekcyjnych, co pozwala na ich rozróżnienie.
Po zakończeniu procesu reakcji PCR w czasie rzeczywistym urządzenie LightCycler® 2.0 automatycznie przeprowadza analizę pików temperatury topnienia. Jednoniciowe amplikony DNA ze
związanymi sondami hybrydyzacyjnymi są poddawane działaniu wzrastających temperatur. Kiedy
produkty reakcji PCR osiągną określoną temperaturę, jedna z dwóch związanych sond hybrydyzacyjnych topnieje, w wyniku czego następuje spadek sygnału fluorescencji. Spadek sygnału fluorescencji następuje w określonej temperaturze i prowadzi do powstania pików temperatury topnienia,
które stosuje się do rozpoznania i rozróżnienia amplikonów swoistych dla MRSA i IC (ang. Internal
Control, wewnętrzna próba kontrolna).
Automatyczne generowanie wyniku po przeprowadzeniu analizy pików temperatur topnienia
Po wzrokowej identyfikacji pików temperatury topnienia przy użyciu pasków TM w oprogramowaniu
urządzenia LightCycler® wyniki testu są przekazywane do specjalnego narzędzia do interpretacji
(programu Micro Analysis Software) i generowany jest raport z wynikami diagnostyki in vitro.
05548942001-04PL
3
Doc Rev. 4.0
ODCZYNNIKI
Zestaw do lizy LightCycler® Advanced
(P/N: 05205743 190)
LYS ADV
96 testów
96 x 0,6 ml
LYS
(Odczynnik lizujący)
bufor Tris
EDTA
< 15% kuleczek krzemionkowych
0,09% azydku sodu
(P/N: 05352894 190)
LC MRSA
96 testów
MRSA RXNMX
(Mieszanina reakcyjna MRSA)
bufor Tris
< 0,1% chlorku magnezu
chlorek potasu
< 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP
0,19% oktyloglukozydu
0,03% albuminy surowicy bydlęcej (ssaczej)
< 0,1% polimerazy FastStart Taq DNA (bakteryjnej)
< 0,1% enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylazy)
(bakteryjnej)
0,09% azydku sodu
3 x 0,352 ml
MRSA DETMX
(Mieszanina detekcyjna MRSA)
®
0,05% roztworu Brij 35
bufor Tris
< 0,01% EDTA
< 0,01% primerów MRSA
< 0,01% znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi
sond oligonukleotydowych swoistych dla MRSA
oraz wewnętrznej próby kontrolnej MRSA
0,09% azydku sodu
0,001% Poly rA RNA (syntetycznego)
< 0,001% niezakaźnego plazmidu DNA
(bakteryjnego), zawierającego sekwencje
wiążące primer MRSA i unikatową
sekwencję wiążącą sondę
3 x 0,176 ml
MRSA (+) C
(Dodatnia próba kontrolna dla MRSA)
bufor Tris
< 0,01% EDTA
0,002% Poly rA RNA (syntetycznego)
0,09% azydku sodu
< 0,001% niezakaźnego plazmidu DNA
(bakteryjnego) zawierającego sekwencje MRSA
1 x 0,176 ml
05548942001-04PL
4
Doc Rev. 4.0
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
A.
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. Tego produktu powinny używać wyłącznie
osoby wykwalifikowane w technikach PCR.
B.
Ten test jest przeznaczony wyłącznie do wymazów z jamy nosowej.
C.
Nie należy pipetować za pomocą ust.
D.
Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami
i odczynnikami z zestawów, należy stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz
odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami testowymi.
E.
Unikać kontaminacji bakteryjnej odczynników podczas pobierania porcji z butelek z odczynnikami. Zaleca się stosowanie jałowych, jednorazowych końcówek do pipet.
F.
Nie łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii.
G.
Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych serii zestawów.
H.
Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
I.
Nie używać zestawu po upływie daty ważności.
J.
Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS, ang. Material Safety Data Sheet) są
dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche.
K.
Z próbkami oraz kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne, przedstawione w Biosafety in Microbiological and Biomedical
13
14
Laboratories oraz w CLSI Document M29-A3 . Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie
powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie
dejonizowanej lub destylowanej.
Uwaga: Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zazwyczaj zawiera podchloryn sodu
w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 pozwoli
uzyskać roztwór 0,5% podchlorynu sodu.
L.
Odczynniki LYS, MRSA RXNMX, MRSA DETMX i MRSA (+) C zawierają azydek sodu.
Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub
miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu
do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu
azydków.
M.
Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy oraz fartuchów
laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze
skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, trzeba natychmiast spłukać
dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń.
W razie rozlania wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą.
N.
Zanieczyszczenia materiałem pochodzącym z dodatnich prób kontrolnych oraz z dodatnich
próbek klinicznych można uniknąć dzięki stosowaniu zasad dobrej praktyki laboratoryjnej
i starannemu przestrzeganiu procedur opisanych w niniejszej ulotce, dołączonej do opakowania zestawu.
05548942001-04PL
5
Doc Rev. 4.0
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA
A.
Po przyjęciu dostawy zestaw do lizy LightCycler® Advanced (LYS) przechowywać w pozycji
pionowej, w temp. od 15 do 25°C.
B.
Po przyjęciu dostawy zestaw testu LightCycler® MRSA Advanced (MRSA RXNMX,
MRSA DETMX i MRSA (+) C) przechowywać w temp. od –15 do –25°C. Jeżeli nie zostały
otwarte, odczynniki te zachowują stabilność do daty ważności. Po otwarciu przechowywać
pozostałe odczynniki MRSA RXNMX i MRSA DETMX w temp. od –15 do –25°C do 30 dni.
Odczynniki MRSA RXNMX i MRSA DETMX wytrzymują do 5 cykli zamrażania i rozmrażania.
C.
Po otwarciu przechowywać pozostały odczynnik MRSA (+) C w temp. od –15 do –25°C lub
w temp. od 2 do 8°C do 30 dni. Odczynnik MRSA (+) C wytrzymuje do 22 cykli zamrażania
i rozmrażania.
D.
Chronić odczynnik MRSA DETMX przed działaniem światła.
E.
Odczynnik roboczy Master Mix (przygotowywany przez dodanie odczynników MRSA RXNMX
i MRSA DETMX) należy przygotowywać bezpośrednio przed użyciem i zużyć w ciągu
24 godzin od przygotowania. Jeśli odczynnik roboczy Master Mix nie został zużyty
natychmiast po przygotowaniu, należy przechowywać odczynnik roboczy Master Mix z dala od
źródeł światła w temp. od 2 do 8°C przez okres do 24 godzin.
F.
Przetworzone próbki i ujemne próby kontrolne przygotowane z wymazówek Liquid Stuart
i wymazówek z żelem Amies (z węglem drzewnym lub bez) zachowują stabilność do 1 dnia
w temp. od 22 do 25°C, do 5 dni w temp. od 2 do 8°C lub do 12 miesięcy w temp. od
–15 do –25°C.
G.
Amplifikację rozpocznij niezwłocznie po dodaniu przetworzonych próbek badanych i prób
kontrolnych do mieszaniny roboczej Master Mix. Jeżeli nie jest to możliwe, napełnione kapilary
należy przechowywać z dala od światła przez maksymalnie 3 godziny w temp. od 2 do 8°C.
DOSTARCZONE MATERIAŁY
A.
Zestaw do lizy LightCycler® Advanced
(P/N: 05205743 190)
LYS ADV
LYS
(Odczynnik lizujący)
B.
(P/N: 05352894 190)
LC MRSA
MRSA RXNMX
(Mieszanina reakcyjna MRSA)
MRSA DETMX
(Mieszanina detekcyjna MRSA)
MRSA (+) C
(Dodatnia próba kontrolna dla MRSA)
05548942001-04PL
6
Doc Rev. 4.0
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
Przyrządy i oprogramowanie
•
Urządzenie LightCycler® 2.0 (P/N: 03 531 414 201)
•
Oprogramowanie do urządzenia LightCycler®, wersja 4.1 (P/N: 04 898 915 001) lub
nowsza
•
Zestaw oprogramowania LightCycler®
(P/N: 06 364 861 190) lub nowsza
•
Wirówka LC Carousel Centrifuge 2.0 [P/N: 03 709 582 001 (230 V) lub
P/N: 03 709 507 001 (110 V)]. Uwaga: Z wirówką LC Carousel Centrifuge
[P/N: 12 189 682 001 (230 V) lub P/N: 03 030 512 001 (115 V)] wymagany jest
zestaw wirnika LightCycler® Carousel 2.0 [P/N: 03 724 697 001].
•
Lub standardowa mikrowirówka stojąca laboratoryjna, posiadająca wirnik do probówek o objętości 2,0 ml oraz adaptery do wirowania LC [P/N: 11 909 312 001]
•
Urządzenie MagNA Lyser [P/N: 03 358 976 001 (230 V) lub 03 358 968 001
(110 V)]
•
Opcjonalny czytnik kodów kreskowych [P/N: 05 536 421 001].
MRSA
Advanced
wersja
1.2
CE
Odczynniki i materiały jednorazowe
•
Zestaw LightCycler® Multicolor Compensation (P/N: 04 484 355 001)
•
Kapilary LightCycler®, 20 µl (P/N: 04 929 292 001)
INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
•
Wymazówka BD CultureSwab™ Liquid Stuart (BD P/N: 220099 lub 220109) lub
Copan Venturi Transystem™ Liquid Stuart (Copan Italia International P/N: 141C
lub 139C)
•
Lub wymazówka BD CultureSwab™ wraz z żelem Amies bez węgla drzewnego
(BD P/N: 220116 albo 220117), lub Copan Venturi Transystem™ wraz z żelem
Amies bez węgla drzewnego (Copan Italia International P/N: 108C lub 134C)
•
Lub wymazówka BD CultureSwab™ wraz z żelem Amies z węglem drzewnym
(BD P/N: 220121 albo 220122), lub Copan Venturi Transystem™ wraz z żelem
Amies z węglem drzewnym (Copan Italia International P/N: 114C lub 136C)
•
Rękawice jednorazowe bezpudrowe
•
Gaza
•
Etanol (70%)
•
Pipetory zmiennopojemnościowe*: (pojemność: 10 µl, 100 µl i 1000 µl) ze
sterylnymi, wolnymi od DNazy końcówkami z filtrem lub dodatnim wypieraniem
•
Suchy blok grzejny o temperaturze 95°C (±2°C): VWR (P/N: 12621-088) lub
odpowiednik z blokiem na zakręcane probówki o objętości 2,0 ml: VWR
(P/N: 12985-050)
•
Mikrowirówka o mocy wirowania 8000–20 000 x g z wirnikiem odpowiednim do
zakręcanych probówek o objętości 2,0 ml: (P/N: model Eppendorf 5417C) lub
odpowiednik
•
Jałowe, pokryte silikonem polipropylenowe probówki do mikrowirówki o objętości
1,5 ml (P/N: Eppendorf nr zamówienia 0030 108.051) lub odpowiednik
05548942001-04PL
7
Doc Rev. 4.0
•
Mieszadło wibracyjne Fisher (P/N: 12-812) lub odpowiednik
•
Opcjonalne narzędzie do mikroprobówek: VWR (P/N: 20170-688) lub Rainin
(P/N: PJ-4A), lub odpowiednik
* Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. Tam gdzie jest to wymagane, należy używać pozbawionych DNazy końcówek z barierą aerozolową lub końcówek
dodatniego wypierania w celu zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem.
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
Uwaga: Ze wszystkimi próbkami i próbami kontrolnymi należy obchodzić się jak z materiałem
potencjalnie zakaźnym.
A.
Pobieranie próbek
1.
Zwilżyć wymazówkę dwiema kroplami (około 50 µl) jałowej soli fizjologicznej lub użyć jej
w formie suchej.
2.
Delikatnie włożyć wymazówkę do nozdrza na głębokość około 0,5 cala lub 1,3 cm (w przypadku wymazówki z dwiema główkami — obie główki jednocześnie) i obrócić pięć razy, pocierając o śluzówkę i wywierając mały nacisk na zewnętrzną część nosa (aby ułatwić kontakt
główek wymazówki z wnętrzem nosa).
3.
Włożyć tę samą wymazówkę do drugiego nozdrza i powtórzyć procedurę.
4.
Włożyć wymazówkę do pojemniczka i odpowiednio oznaczyć.
B.
Transport i przechowywanie próbek
Próbki muszą być transportowane zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi
15
dotyczącymi transportu czynników etiologicznych . Próbki mogą być transportowane w temp. od
22 do 25°C.
Przed przygotowaniem próbki mogą być przechowywane (wliczając czas potrzebny na transport)
w sposób opisany poniżej.
•
•
Próbka pobrana za pomocą wymazówek Liquid Stuart jest stabilna:
–
w temp. od 22 do 25°C do 6 dni,
–
w temp. od 2 do 6°C do 5 dni,
–
w temp. od –15 do –25°C do 1 miesiąca.
Próbka pobrana za pomocą wymazówek z żelem Amies z węglem drzewnym lub bez węgla
drzewnego jest stabilna:
–
w temp. od 22 do 25°C do 4 dni (przy 25°C odsetek trafień wynosił 95% w 6. dniu).
05548942001-04PL
8
Doc Rev. 4.0
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
Przygotowanie urządzeń
A.
Instalowanie programu Micro Analysis Software (MAS)
Aby zainstalować aktualizacje, sprawdź, czy wraz z produktem dostarczono dodatkową informację.
1.
Zaloguj się w jednostce sterującej urządzenia LightCycler® jako administrator.
2.
Włóż płytę CD z zestawem oprogramowania LightCycler® MRSA Advanced wersja 1.2 CE (lub
nowsza) do napędu CD jednostki sterującej urządzenia LightCycler®. Rozpocznij instalację
programu MAS, klikając dwukrotnie ikonę pliku setup.exe na płycie CD.
3.
Aby przeprowadzić pierwszą instalację:
4.
a.
Jeżeli nie zainstalowano jeszcze programu Microsoft Data Access Components 2.8,
pojawi się monit o jego zainstalowanie na początku konfigurowania programu MAS.
Program Microsoft Data Access Components 2.8 musi być zainstalowany; w przeciwnym razie program MAS nie będzie działać prawidłowo.
b.
Jeżeli nie zainstalowano jeszcze oprogramowania Microsoft .NET Framework 2.0 (x86),
na początku konfigurowania programu MAS pojawi się monit o jego zainstalowanie.
Oprogramowanie Microsoft .NET Framework 2.0 (x86) musi być zainstalowane; w przeciwnym razie program MAS nie będzie działać prawidłowo.
c.
Jeżeli nie zainstalowano jeszcze Microsoft Windows Installer 3.1, na początku konfigurowania programu MAS pojawi się monit o jego zainstalowanie. Microsoft Windows
Installer 3.1 musi być zainstalowany; w przeciwnym razie program MAS nie będzie
działać prawidłowo.
d.
Jeżeli nie zainstalowano jeszcze Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer, na
początku konfigurowania programu MAS pojawi się monit o jej zainstalowanie.
Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer musi być zainstalowany; w przeciwnym
razie program MAS nie będzie działać prawidłowo.
e.
Jeżeli nie zainstalowano jeszcze programu Microsoft SQL Server 2005 Express SP2
(x86), na początku konfigurowania programu MAS pojawi się monit o jego zainstalowanie. Program Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86) musi być zainstalowany; w przeciwnym razie program MAS nie będzie działać prawidłowo.
Jeżeli pojawi się monit o zrestartowanie komputera, potwierdź, klikając <Yes>.
Uwaga: W czasie restartowania komputera nie wyciągaj płyty CD z zestawem oprogramowania
LightCycler® MRSA Advanced.
5.
Po zrestartowaniu komputera postępuj według wskazówek podanych w kreatorze instalacji.
Aby rozpocząć instalację programu MAS, naciśnij przycisk <Next>.
6.
Wybierz opcję <Just Me>, jeżeli tylko jeden użytkownik będzie korzystał z jednostki sterującej
LightCycler®; wybierz opcję <Everyone>, jeżeli z jednostki sterującej LightCycler® będzie
korzystać więcej niż jedna osoba.
7.
Potwierdź prawidłową instalację programu MAS, klikając przycisk <Close> w oknie
<Installation Complete>.
8.
Foldery danych dla plików *.ixo i *.pdf są tworzone automatycznie (<C:\Export to MAS>,
<C:\Export to MAS\ColorCompensations> i <C:\Export to MAS\Macros>).
B.
Instalowanie i eksportowanie makropoleceń LightCycler® MRSA Advanced Macros
1.
Zainstaluj mikropolecenia *.lckit LightCycler® MRSA Advanced MCC Macro wersja 1.0 (MRSA
MCC_04484355001A_1.0.Ickit) lub nowsza i LightCycler® MRSA Advanced Macro wersja 1.0
(MRSA_05352894190_1.0.Ickit) lub nowsza z płyty CD zawierającej zestaw oprogramowania
LightCycler® MRSA Advanced wersja 1.2 CE (lub nowsza).
05548942001-04PL
9
Doc Rev. 4.0
2.
Zapoznaj się z rozdziałem „Uruchamianie makropolecenia Roche Macro” w podręczniku
A użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0.
3.
Wyeksportuj oba makropolecenia do folderu <C:\Export to MAS\Macros>; w oknie dialogowym
zapisu wybierz typ pliku *.ixo i nie zmieniaj pierwotnej nazwy makropolecenia.
C.
Weryfikacja zainstalowania oprogramowania Micro Analysis Software (MAS)
1.
Kopiuj pliki weryfikacji z płyty CD zawierającej zestaw oprogramowania LightCycler® MRSA
Advanced wersja 1.2 CE (lub nowsza) do folderu <C:\Export to MAS> (nie zapisuj plików
w podfolderach).
2.
a.
MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.ixo lub jego nowsza wersja
b.
MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.pdf lub jego nowsza wersja
Kopiuj pliki kompensacji kolorów z płyty CD zawierającej zestaw oprogramowania LightCycler®
MRSA Advanced wersja 1.2 CE (lub nowsza) do folderu <C:\Export to MAS\
ColorCompensations>.
a.
MRSA_CCE_080905-01.ixo
b.
MRSA_CCO_080905-01.ixo
3.
Jeżeli program MAS nie jest jeszcze otwarty, kliknij dwukrotnie ikonę programu MAS na
pulpicie i naciśnij przycisk <Load>.
4.
Wybierz plik MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.ixo (lub jego nowszą wersję) w folderze
<C:\Export to MAS>.
5.
W odpowiednich polach okna konfiguracji ustawień programu MRSA wpisz numer serii, datę
ważności oraz informacje o laboratorium.
Zestaw do lizy Advanced
Lot No
11A00000
Expiration Date
12201812
Test MRSA Advanced
Lot No
23A00000
Expiration Date
24201812
Informacje osobowe
Lab Info
laboratorium firmy Roche
6.
Wybierz rodzaj raportu <MRSA Combined> i kontynuuj, klikając <OK>. Plik będzie analizowany automatycznie, a dane zostaną wyświetlone.
7.
Wydrukuj raport.
8.
Przejdź do folderu <C:\Export to MAS>, otwórz i wydrukuj plik MRSA Advanced Proof File
v1.2CE.pdf (lub jego nowszą wersję).
9.
Upewnij się, że wydrukowany raport programu MAS i wydrukowany raport PDF zawierają te
same wyniki. Jeżeli nie, skontaktuj się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania
pomocy technicznej.
05548942001-04PL
10
Doc Rev. 4.0
D.
Usuwanie programu Micro Analysis Software (MAS)
1.
Zaloguj się w jednostce sterującej urządzenia LightCycler® jako administrator.
2.
®
Kliknij przycisk <Start> na pasku zadań jednostki sterującej urządzenia LightCycler .
3.
Wybierz pozycję <Start> / <Control Panel> / <Add/Remove Programs> w lewym dolnym rogu
pulpitu systemu Windows.
4.
Pojawi się lista obecnie zainstalowanych programów; kliknij pozycję <MAS>.
5.
Wybierz opcję <Remove> i potwierdź, klikając przycisk <Yes>.
Uwaga: Płyta CD z zestawem oprogramowania MRSA Advanced zawiera funkcję odinstalowania i naprawy. Funkcję odinstalowania można stosować zamiast procesu opisanego
powyżej. Funkcję naprawy można stosować do odzyskiwania uszkodzonych lub utraconych plików oprogramowania Micro Analysis Software.
E.
Badanie kompensacji multikolorowej z użyciem oprogramowania LightCycler® Multicolor
Compensation Set z zastosowaniem urządzenia LightCycler® 2.0
Aby utworzyć nowy lub zastąpić przeterminowany plik kompensacji koloru, wykonaj następujące
czynności:
1.
Rozmroź fiolki 1, 2, 3 i 5, wymieszaj je delikatnie na mieszadle wibracyjnym i krótko odwiruj.
2.
Przygotuj 3-krotne rozcieńczenie zawartości fiolki 2, mieszając ze sobą:
3.
a.
10 µl roztworu znajdującego się w fiolce 2,
b.
20 µl buforu z probówki LYS, nie przenosząc szklanych kuleczek.
®
Odpipetuj po 10 µl każdego składnika do oddzielnych kapilar (20 µl) urządzenia LightCycler .
a.
Kapilara nr 1: Fiolka 1
b.
Kapilara nr 2: rozcieńczenie z etapu E2
c.
d.
Uwaga: Po zakończeniu przebiegu testowego wyrzuć roztwór sporządzony przez rozcieńczenie
zawartości fiolki 2.
4.
Odpipetuj po 10 µl buforu z probówki LYS (bez przenoszenia szklanych kuleczek) do
wszystkich kapilar, tak aby uzyskać całkowitą objętość 20 µl.
5.
Zamknij szczelnie każdą kapilarę zatyczką, używając narzędzia do zamykania.
6.
Odwiruj kapilary za pomocą wirówki LC Carousel Centrifuge 2.0 lub standardowej wirówki
i adapterów do wirowania. Probówki muszą znajdować się w następujących pozycjach
w obrotowym pojemniku na próbki:
a.
pozycja 1 obrotowego pojemnika na próbki: CCB (fiolka 1),
b.
pozycja 2 obrotowego pojemnika na próbki: CC530 (fiolka 2),
c.
pozycja 3 obrotowego pojemnika na próbki: CC610 (fiolka 3),
d.
pozycja 4 obrotowego pojemnika na próbki: CC670 (fiolka 5).
Uwaga: Nie zmniejszaj objętości dla żadnej kapilary.
05548942001-04PL
11
Doc Rev. 4.0
7.
Umieść obrotowy pojemnik na próbki LightCycler® w urządzeniu LightCycler® 2.0. Jeżeli użyto
®
typowej wirówki, przenieś kapilary do obrotowego pojemnika na próbki LightCycler
w kolejności opisanej w punkcie E6.
Uwaga: Nie zmieniaj kolejności odczynników w obrotowym pojemniku na próbki.
8.
Uruchom i zapisz badanie kompensacji koloru (CCE, ang. Color Compensation Experiment)
a.
W celu zastosowania makropolecenia LightCycler® MRSA Advanced MCC
Macro zapoznaj się z rozdziałem „Uruchamianie makropolecenia Roche Macro”
w podręczniku A użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0.
Uwaga: Nie używaj pola <assay lot number>. Jeżeli chcesz dodać numer serii oznaczenia do
wykonywanej próby, umieść tę informację w odpowiednim polu w edytorze próbki.
9.
b.
Zapisz przebieg reakcji, stosując obowiązkową konwencję nadawania nazw
badaniom kompensacji kolorów: MRSA_CCE_RRMMDD-xx, gdzie: R = rok,
M = miesiąc, D = dzień, xx = numer reakcji.
c.
Raport LightCycler® zostanie utworzony automatycznie po zakończeniu przebiegu testowego.
Walidacja przebiegu testowego
Raport nie zawiera informacji, czy badanie kompensacji koloru zakończyło się powodzeniem.
Poprawność badania kompensacji koloru określa się dopiero po zastosowaniu obiektu
kompensacji koloru (CCO, ang. Color Compensation Object) wygenerowanego podczas CCE
we wstępnej reakcji testu MRSA Advanced.
10.
11.
a.
Jeżeli raport oprogramowania LightCycler® (LCS) z badania kompensacji koloru
(CCE) zawiera znacznik <User Developed or Modified Test Method>, to przebieg
CCE jest nieważny. Powtórz badanie kompensacji koloru (od etapu E1).
b.
Jeżeli raport LCS z badania kompensacji koloru (CCE) nie zawiera znacznika,
przejdź do następnego etapu.
Tworzenie obiektu kompensacji kolorów (CCO)
a.
Uaktywnij tryb analizy kompensacji kolorów i naciśnij przycisk <save CC object>.
b.
Nadaj krótką, niepowtarzalną nazwę, stosując obowiązkową konwencję nadawania nazw obiektom kompensacji kolorów: MRSA_CCO_RRMMDD-xx, gdzie:
R = rok, M = miesiąc, D = dzień, xx = numer reakcji.
c.
Obiekt ten jest wykorzystywany do dalszej analizy oznaczeń wykonanych za
pomocą testu LightCycler® MRSA Advanced.
Wyeksportuj pliki CCE i CCO do folderu <C:\Export to MAS\ColorCompensations>, w oknie
dialogowym zapisu wybierz typ pliku *.ixo i nie zmieniaj pierwotnej nazwy pliku.
05548942001-04PL
12
Doc Rev. 4.0
Przygotowanie próbki i próby kontrolnej
A.
Przygotowanie próbek
1.
Odpowiednio oznacz po jednej probówce LYS dla każdej próbki chorego.
Uwaga: Nie podpisuj probówek na górnej części zatyczki.
2.
Wyjmij wymazówkę z pojemnika transportowego.
3.
Umieść główkę pojedynczej wymazówki w probówce LYS.
Uwaga: Przy stosowaniu pojedynczych wymazówek można prowadzić bezpośrednią hodowlę,
pocierając wymazówką o płytkę przed umieszczeniem jej w próbówce LYS.
4.
Przytrzymaj wymazówkę za trzonek w pobliżu obrzeża probówki, podnieś wymazówkę kilka
milimetrów nad dno probówki i zegnij trzonek o obrzeże probówki, tak aby go złamać.
Uwaga: Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia, podczas łamania wymazówki użyj
gazy. Do każdej wymazówki użyj nowej gazy.
5.
Zamknij szczelnie zatyczkę probówki LYS.
B.
Przygotowanie ujemnej próby kontrolnej
Uwaga: NC należy przygotować w tym samym czasie co próbki, które mają być badane.
1.
Oznacz odpowiednio jedną probówkę LYS jako ujemną próbę kontrolną.
Uwaga: Nie podpisuj probówek na górnej części zatyczki.
2.
Umieść jałową wymazówkę w pojemniku transportowym. Wykaz zalecanych wymazówek
można znaleźć w części „Inne materiały wymagane, lecz niedostarczane”.
3.
Inkubuj w temperaturze pokojowej co najmniej przez 1 minutę.
4.
Wyjmij wymazówkę z pojemnika transportowego.
5.
Umieść główkę pojedynczej wymazówki w probówce LYS.
6.
Przytrzymaj wymazówkę za trzonek w pobliżu obrzeża probówki, podnieś wymazówkę kilka
milimetrów nad dno probówki i zegnij trzonek o obrzeże probówki, tak aby go złamać.
Uwaga: Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia, podczas łamania wymazówki użyj
nowej gazy.
7.
Zamknij szczelnie zatyczkę probówki LYS.
C.
Przetwarzanie próbki i próby kontrolnej
1.
Podgrzewaj badane próbki i ujemną próbę kontrolną w suchym bloku grzejnym w temperaturze 95 ± 2°C przez 2 minuty.
2.
Dokonaj lizy badanej próbki i ujemnej próby kontrolnej w urządzeniu MagNA Lyser (70 sekund
przy prędkości 5000 obr/min). Dokładne instrukcje użytkowania można znaleźć w podręczniku
użytkownika urządzenia MagNA Lyser.
3.
Odwirowuj badaną próbkę i ujemną próbę kontrolną przy 8000–20 000 x g w temperaturze
pokojowej przez 1 minutę.
Uwaga: Przetworzone próbki i ujemne próby kontrolne przygotowane z wymazówek Liquid
Stuart i wymazówek z żelem Amies (z węglem drzewnym lub bez) zachowują stabilność do 1 dnia w temp. od 22 do 25°C, do 5 dni w temp. od 2 do 8°C lub do 12 miesięcy
w temp. od –15 do –25°C.
05548942001-04PL
13
Doc Rev. 4.0
Przygotowanie odczynników
1.
Rozmroź odczynniki MRSA RXNMX i MRSA DETMX i MRSA (+) C w temperaturze
pokojowej. Przed użyciem upewnij się, że powyższe odczynniki są całkowicie rozmrożone.
2.
Mieszaj odczynniki MRSA RXNMX i MRSA DETMX i MRSA (+) C na mieszadle wibracyjnym
przez 3–5 sekund i krótko je odwiruj, aby zebrać materiał na dnie probówki.
3.
W jałowej, pokrytej silikonem polipropylenowej probówce przygotuj mieszaninę roboczą Master
Mix w objętości odpowiadającej liczbie próbek badanych i prób kontrolnych, które mają być
badane. (Użyj tabeli 1 jako poradnika.) Każdy przebieg testowy musi obejmować przynajmniej
jedną próbkę, jedną PC i jedną NC.
Uwaga: Zalecane objętości obejmują 2 reakcje przewidziane na ujemną próbę kontrolną
i dodatnią próbę kontrolną oraz dodatkową objętość, która ma zrekompensować
objętość martwą i ułatwić pipetowanie z probówki, w której następowało mieszanie,
a także pipetowanie do kapilar LC.
Uwaga: Aby sobie ułatwić otwieranie odczynników MRSA RXNMX i MRSA DETMX, w razie
konieczności użyj narzędzia do mikroprobówek (VWR P/N 20170-688 lub Rainin
P/N PJ-4A) albo jego odpowiednika.
Tabela 1
Przygotowanie mieszaniny roboczej Master Mix
Liczba próbek
Objętość MRSA RXNMX
(µl)
Objętość MRSA DETMX
(µl)
Całkowita objętość
(µl)*
1
40
20
60
2
50
25
75
3
60
30
90
4
70
35
105
5
80
40
120
6
90
45
135
7
100
50
150
8
110
55
165
9
120
60
180
10
130
65
195
11
150
75
225
12
160
80
240
13
170
85
255
14
180
90
270
15
190
95
285
16
200
100
300
17
210
105
315
18
220
110
330
19
230
115
345
20
240
120
360
21
260
130
390
05548942001-04PL
14
Doc Rev. 4.0
Liczba próbek
Objętość MRSA RXNMX
(µl)
Objętość MRSA DETMX
(µl)
Całkowita objętość
(µl)*
22
270
135
405
23
280
140
420
24
290
145
435
25
300
150
450
26
310
155
465
27
320
160
480
28
330
165
495
29
340
170
510
30
350
175
525
* Obejmuje objętość NC, MRSA (+) C oraz objętość martwą.
4.
Mieszaj odczynnik roboczy Master Mix w mieszadle wibracyjnym przez 3–5 sekund i krótko go
odwiruj, aby zebrać materiał na dnie probówki. Odczynnik roboczy Master Mix należy
przygotowywać codziennie bezpośrednio przed użyciem. Usuń wszelkie niezużyte w ciągu
24 godzin partie odczynnika roboczego Master Mix.
Przygotowanie przetwarzanych próbek badanych i prób kontrolnych
1.
Umieść odpowiednią liczbę kapilar LightCycler® w obrotowym pojemniku na kapilary LC lub
w adapterach do wirowania. Potrzebna jest jedna (1) kapilara na PC (pozycja 1), 1 kapilara na
przetwarzaną NC (pozycja 2) oraz po 1 kapilarze na każdą przetwarzaną próbkę badaną
(pozycja 3 i dalsze).
Uwaga: Kapilary LightCycler® należy przenosić, trzymając za zbiorniczek kapilary.
2.
Odpipetuj 15 µl mieszaniny roboczej Master Mix do każdego zbiorniczka kapilary.
3.
Z każdej przetwarzanej próbki odpipetuj po 5 µl klarownego supernatantu do kapilar
o numerze 3 i wyższych. Po każdej próbce zmień końcówkę pipety.
4.
Do kapilary nr 2 odpipetuj 5 µl przetwarzanej ujemnej próby kontrolnej.
Uwaga: Przetworzone próbki i ujemne próby kontrolne przygotowane z wymazówek Liquid
Stuart i wymazówek z żelem Amies (z węglem drzewnym lub bez) zachowują
stabilność do 1 dnia w temp. od 22 do 25°C, do 5 dni w temp. od 2 do 8°C lub do
12 miesięcy w temp. od –15 do –25°C. W przypadku użycia przetworzonych próbek
w stanie zamrożonym należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej, wymieszać
na mieszadle wibracyjnym przez 10 s, a następnie odwirować z prędkością
8000–20 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
5.
Odpipetuj 5 µl rozmrożonego odczynnika MRSA (+) C do kapilary nr 1.
6.
Zamknij szczelnie każdą kapilarę zatyczką, używając narzędzia do zamykania.
7.
Odwiruj kapilary za pomocą wirówki LC Carousel Centrifuge 2.0 lub standardowej wirówki
i adapterów do wirowania.
8.
Umieść obrotowy pojemnik na próbki LightCycler® w urządzeniu LightCycler® 2.0.
Uwaga: Jeżeli użyto standardowej wirówki, przenieś kapilary do obrotowego pojemnika na
próbki LightCycler® w kolejności opisanej w punkcie 1.
Uwaga: Amplifikację rozpocznij niezwłocznie po dodaniu przetworzonych próbek badanych
i prób kontrolnych do mieszaniny roboczej Master Mix. Jeżeli nie jest to możliwe,
napełnione kapilary należy przechowywać z dala od światła przez maksymalnie
3 godziny w temp. od 2 do 8°C.
05548942001-04PL
15
Doc Rev. 4.0
Uruchamianie i obsługa urządzenia LightCycler® 2.0
1.
®
Zaloguj się do oprogramowania LightCycler .
2.
Uruchom makropolecenie LightCycler® MRSA Advanced MCC Macro (patrz rozdział „Uruchamianie makropolecenia Roche Macro” w podręczniku A użytkownika urządzenia LightCycler® 2.0).
Uwaga: Nie używaj pola <assay lot number>. Przed rozpoczęciem procesu analizy wyników
pojawi się monit programu MAS o podanie danych odczynnika (numer serii oznaczenia można też umieścić w odpowiednim polu w edytorze próbki oprogramowania
®
LightCycler ).
3.
Nadaj reakcji nazwę, identyfikującą ją w niepowtarzalny sposób.
4.
Zredukuj automatyczną, domyślną listę próbek do liczby próbek, jakie mają być badane. Jeżeli
przypadkowo usunięto zbyt wiele pozycji próbek, rozpocznij procedurę od punktu 2.
5.
Zeskanuj etykiety z kodami kreskowymi próbek lub ręcznie wprowadź nazwy próbek w polu
nazwy próbki albo pozostaw ustawienia domyślne. Jeżeli jest to wymagane, do wprowadzenia
danych można użyć pola <Run Note>.
Uwaga: Nie zmieniaj domyślnych nazw dodatniej i ujemnej próby kontrolnej.
6.
Postępuj według wskazówek podanych na ekranie i rozpocznij przebieg testu LightCycler®
MRSA Advanced.
05548942001-04PL
16
Doc Rev. 4.0
WYNIKI
Rozpoznawanie największej wartości oraz automatyczna analiza wyników:
Uwaga: Nie rozpoczynaj analizy danych podczas pracy urządzenia LightCycler®.
•
Tryb ręcznego określania TM wymaga ręcznej obsługi w dwóch automatycznie wybieranych modułach określania TM.
•
Przy analizie tego testu nie stosuje się modułów bezwzględnego oznaczania ilościowego (ang. Absolute Quantification).
•
W oknie melting peak (piki temperatury topnienia) przedstawiono wszystkie krzywe
wybranych wykresów.
•
Ustawienie paska TM dla każdego modułu analizy jest wstępnie definiowane w makro®
poleceniu LightCycler MRSA Advanced Macro.
•
Pasek TM można zaznaczyć lub usunąć jego zaznaczenie bez tworzenia znacznika.
•
Linia bazowa dla każdego modułu analizy jest wstępnie zdefiniowana zgodnie
z poniższą tabelą w makropoleceniu LightCycler® MRSA Advanced Macro i nie wolno
jej zmieniać ani usuwać jej zaznaczenia. Jeśli doszło do przypadkowej zmiany, wpisz
prawidłowe wartości z tabeli 2.
Tabela 2
Wartości linii bazowej
Wartość początkowa
CH 610
CH 670
0,085
0,100
•
Piki są definiowane jako maksymalne wartości powyżej linii bazowej. Ustawienia
„Shoulders” (ramiona) nie stanowią największych wartości.
•
Przykłady pików dla typowej dodatniej próby kontrolnej (wykres 1, kanał 610) i wewnętrznej próby kontrolnej (wykres 2, kanał 670) oraz przykład piku z ramieniem (wykres 3):
Wykres 1
Wykres 2
05548942001-04PL
17
Doc Rev. 4.0
Wykres 3
Dostosowywanie pasków TM:
1.
Po zakończeniu przebiegu testowego kreator badania informuje: <Analyses have been created>.
2.
Przesuń okno komunikatu na dół ekranu, tak aby zobaczyć wartości TM i wartości linii bazowej
(nie naciskaj przycisku <Finish>).
3.
Kliknij moduł analizy TM 610; zostanie wyświetlony podgląd wszystkich pozycji.
4.
Zmniejsz rozmiar okna wykresu, przesuwając lewy uchwyt tego okna w prawo; powinny być
teraz widoczne kolumny „Baseline”, „TM1” i „Height1”.
Uwaga: Jeżeli wybrano więcej niż jedną pozycję, zostaną wyświetlone ustawienia pierwszej
wybranej kapilary.
Uwaga: Przesunięcie pasków ma wpływ na wszystkie aktywowane i wybrane kapilary.
5.
Kliknij pozycję dodatniej próby kontrolnej (#PC#), aby ją wybrać.
6.
Jeżeli pasek TM nie znajduje się w najwyższym punkcie piku (powyżej linii bazowej), przesuń
go w najwyższy punkt piku, koncentrując się na określonych zakresach TM (patrz tabela 3).
7.
Jeżeli powyżej linii bazowej nie ma żadnych wartości, pozostaw pasek TM w pozycji wyjściowej.
Upewnij się, że paski nie są oznaczeniem nachyleń żadnych istniejących pików (np. poza
określonym zakresem TM).
8.
Upewnij się, że wartości (wszelkie wartości) dla danej próby są wyświetlane w kolumnach
„TM1” i „Height1”. Jeżeli nie są widoczne żadne wartości (pusta przestrzeń), przesuń pasek TM
w najwyższy punkt piku. Wartości powinny być teraz wyświetlane w kolumnach „TM1”
i „Height1”.
Tabela 3
Określone zakresy TM
Niska TM (°C)
Wysoka TM (°C)
MRSA
(CH 610)
57,00
62,00
Wewnętrzna próba kontrolna
(CH 670)
57,00
62,00
Uwaga: W próbkach bez pików (np. w ujemnej próbie kontrolnej) automatyczne skalowanie
spowoduje dostosowanie do największej wartości tła. Zdefiniowana na początku linia
bazowa może nie być widoczna w tym przypadku. Jeżeli chcesz uwidocznić linię
bazową, wybierz tę kapilarę razem z dodatnią próbą kontrolną.
Uwaga: Zaznaczone piki poza określonym zakresem TM zostaną odnotowane w raporcie
programu MAS.
05548942001-04PL
18
Doc Rev. 4.0
9.
Kontynuuj oznaczanie pików, tak jak opisano w punktach 5–8 powyżej, dla wszystkich
pozostałych kapilar (prób kontrolnych i badanych).
10.
Kliknij moduł analizy TM 670.
11.
Kontynuuj oznaczanie pików, tak jak opisano w punktach 4–8 powyżej, dla wszystkich pozycji
(prób kontrolnych i badanych).
Kończenie analizy TM:
1.
Przesuń okno kreatora badania z powrotem na środek ekranu i naciśnij przycisk <Finish>.
2.
Raport LightCycler® jest tworzony automatycznie i może zostać wydrukowany.
3.
Badanie zostanie automatycznie zapisane.
Uwaga: Jeżeli w polu którejkolwiek nazwy próbki w oprogramowaniu LightCycler® po zapisaniu wprowadzono zmiany, użytkownik musi uaktualnić bazę danych, wybierając
i klikając ikony „Abs Quant 610” i „Abs Quant 670”, oraz zapisać plik ponownie.
4.
Wyeksportuj plik *.ixo do folderu <C:\Export to MAS>, klikając przyciski <File> \ <Export>.
Automatyczna analiza wyników przy użyciu oprogramowania Micro Analysis Software (MAS):
1.
Dwukrotnie kliknij ikonę programu MAS na pulpicie i naciśnij przycisk <Start>.
2.
Z katalogu <C:\Export to MAS> wybierz badanie MRSA Advanced, które ma być analizowane,
i załaduj plik *.ixo.
3.
Zeskanuj lub ręcznie wprowadź informacje dotyczące numeru serii oraz daty ważności,
dostarczone z zestawem do lizy Advanced i testem LightCycler® MRSA Advanced.
4.
Według uznania wprowadź dane osobowe (np. nazwisko użytkownika).
Uwaga: Od tego momentu będą używane informacje wprowadzone do programu MAS jako
ostatnie.
5.
Wybierz odpowiedni format raportu (tabelaryczny, pogrupowany lub złożony).
6.
Plik *.ixo badania MRSA Advanced zostanie automatycznie poddany analizie, a dane zostaną
wyświetlone w formie raportu o wybranym formacie.
7.
Wydrukuj raport programu MAS i/lub wyeksportuj go jako plik *.pdf.
Uwaga: Raport programu MAS wyświetla wyniki diagnostyki in vitro, jest więc nadrzędny
względem informacji zwartych w raporcie podstawowym LightCycler® (raport LCS).
05548942001-04PL
19
Doc Rev. 4.0
INTERPRETACJA WYNIKÓW
1.
Wyniki są obliczane przez oprogramowanie LightCycler® na podstawie zmierzonych sygnałów
fluorescencji oraz wbudowanych algorytmów obliczeniowych i przedstawiane za pomocą programu Micro Analysis Software (MAS).
2.
Walidacja przebiegu testowego oraz prób kontrolnych i badanych próbek jest przeprowadzana
automatycznie przez program MAS.
Uwaga: Analizator może generować znaczniki i komentarze (RUN STATUS, CONTROLS
STATUS i SAMPLE STATUS). Użytkownik musi sprawdzić wydruk raportu programu
MAS, aby ustalić, czy w którymkolwiek polu występują znaczniki lub komentarze.
Uwaga: Wynik ujemny testu LightCycler® MRSA Advanced nie wyklucza kolonizacji jamy
nosowej przez MRSA.
3.
W przypadku poprawnego przebiegu wyniki interpretuje się w następujący sposób:
Wynik
CH 610
(MRSA)
Wynik
CH 670
(IC)
Wynik
MRSA
Komentarz
Interpretacja
–
Dodatni wynik próbki na
obecność DNA MRSA.
Przypuszczalna kolonizacja jamy nosowej przez
szczepy MRSA.
DODATNI
DODATNI
lub
DETECTED
UJEMNY
UJEMNY
UJEMNY
INVALID
UJEMNY
DODATNI
NOT
DETECTED
Wynik nieważny. Powtórz
procedurę PCR na rozmrożonej, przetworzonej
próbce lub na nowej
IC not detected próbce. Jeśli wynik nadal
jest nieważny, zgłoś nieważny wynik. Skontaktuj
się z lokalnym biurem
firmy Roche
–
Nie wykryto DNA MRSA.
Mało
prawdopodobna
kolonizacja jamy nosowej
przez szczepy MRSA.
Dodatkowe komentarze dotyczące dodatniej próby kontrolnej, ujemnej próby kontrolnej oraz wyniku
próbki mogą pojawiać się w programie MAS.
Komentarz
Interpretacja
Peak(s) outside Target TM range
Wykryto amplikony poza zakresem TM określonym
dla MRSA
Peak(s) outside IC TM range
Wykryto amplikony poza zakresem TM określonym
dla IC
Jeżeli w programie MAS pojawi się komentarz „Peak(s) outside Target TM range” dla wyniku próbki,
który ma stan „Not Detected / Valid” lub „Invalid / Invalid” (odpowiednio dla kolumn „MRSA Result”
i „Status” w raporcie programu MAS), próbka powinna być podejrzewana o dodatni wynik DNA MRSA.
Pobierz kolejną próbkę (lub wykorzystaj pozostałą cześć wymazówki z dwiema główkami) i ponownie
wykonaj test z użyciem innej techniki, takiej jak posiew, aby określić stan nosicielstwa w jamie
nosowej pacjenta.
Wyniki próbek, które mają stan „Detected / Valid” (odpowiednio dla kolumn „MRSA Result” i „Status”
w raporcie programu MAS) i dla których w programie MAS pojawi się komentarz „Peak(s) outside
Target TM range”, powinny być podejrzewane o dodatni wynik DNA MRSA (przypuszczalna kolonizacja jamy nosowej przez MRSA).
05548942001-04PL
20
Doc Rev. 4.0
Wyświetlanie tych komentarzy na pasku „Controls Status” raportu programu MAS nie zmienia interpretacji „Controls Status” i „Run Status” generowanych przez program MAS i wyświetlanych w raportach
programu MAS.
4.
W programie MAS mogą być wyświetlane następujące znaczniki:
Znacznik
Invalid
macro
version
Komentarze
File could not
be loaded
Interpretacja
Stan
Zastosowano złe
makropolecenie.
Run
INVALID
Run
INVALID
User
Developed
or Modified
Test Method
–
Parametry krytyczne
w plikach CCE i (lub)
CCO, i (lub) MRSA
Advanced *.ixo różnią
się od parametrów
w plikach odniesienia
*.ixo makropoleceń
MRSA Advanced.
Możliwe przyczyny
opisano w podręczniku
użytkownika urządzenia
LightCycler® 2.0
(np. zmodyfikowanie
ustawień domyślnych
makropolecenia).
Lysis Kit
expired
–
Upłynęła data ważności
zestawu do lizy
LightCycler® Advanced.
Run
INVALID
MRSA Test
expired
–
Upłynęła data ważności
testu LightCycler®
MRSA Advanced.
Run
INVALID
CCO
expired on
YYMMDD1
–
Plik kompensacji
kolorów jest starszy niż
sześć miesięcy.
Run
INVALID
INVALID
CCO NAME
–
Nieprawidłowa nazwa
obiektu kompensacji
kolorów.
Run
INVALID
05548942001-04PL
21
Czynność naprawcza
Powtórz przebieg
LightCycler®. Sprawdź,
czy makropolecenie
w oprogramowaniu
LightCycler® i/lub zestawie oprogramowania
MRSA Advanced jest
prawidłowe.
Jeżeli zostaną wyświetlone dodatkowe znaczniki, zapoznaj się z działaniem naprawczym
podanym dla odpowiedniego znacznika.
Jeżeli nie zostaną wyświetlone dodatkowe
znaczniki, powtórz
badanie.
Jeżeli znacznik jest
dodawany wielokrotnie,
skontaktuj się z miejscowym serwisem
firmy Roche.
Powtórz badanie
LightCycler® na
nieprzeterminowanych
odczynnikach.
Powtórz badanie
®
LightCycler na
nieprzeterminowanych
odczynnikach.
Przygotuj nowy przebieg
kompensacji kolorów
i utwórz nowy obiekt
kompensacji kolorów.
Powtórz przebieg
LightCycler® wykonany
na obiekcie kompensacji
kolorów po dacie
ważności.
Przygotuj nowy przebieg
i utwórz nowy obiekt
według konwencji nadawania nazw określonej
w tym dokumencie. Powtórz przebieg LightCycler®
wykonany na obiekcie
o nieprawidłowej nazwie.
Doc Rev. 4.0
Znacznik
Komentarze
Interpretacja
Stan
MULTIPLE
CCO USED
–
W modułach analizy
zastosowano różne pliki
kompensacji kolorów.
Run
INVALID
NO CCO
USED
–
W modułach analizy
brakuje jednego lub
kilku plików kompensacji kolorów.
Run
INVALID
INVALID
LCS
VERSION
–
Nieprawidłowa wersja
oprogramowania
LightCycler® SW zastosowana do procedury.
Run
INVALID
INVALID
BASELINE
–
Wartości początkowe
mogły zostać przypadkowo zmienione.
Run
INVALID
•
INVALID
NC
INVALID PC
INVALID
NC NAME
INVALID PC
NAME
1
•
NC:
Target
peak(s)
detected
NC:
IC not
detected
PC: PC not
detected
Otwórz oryginalny plik
*.ixo badania MRSA
w oprogramowaniu
LightCycler® i wybierz
właściwy obiekt kompensacji kolorów. Zapisz
badanie i ponownie
wyeksportuj.
Otwórz oryginalny plik
*.ixo badania MRSA
w oprogramowaniu
LightCycler® i wybierz
właściwy plik kompensacji
kolorów. Zapisz badanie
i ponownie wyeksportuj.
Otwórz oprogramowanie
LightCycler® i sprawdź
prawidłowość numeru
wersji oprogramowania.
Otwórz plik *.ixo badania
MRSA w oprogramowaniu LightCycler®
i popraw wartości początkowe zgodnie z tabelą 2.
Zapisz badanie i ponownie je wyeksportuj.
•
Wykryto amplikon(y) w zakresie
MRSA TM dla
ujemnej próby
kontrolnej
•
Nie wykryto IC
w ujemnej próbie
kontrolnej.
Nie wykryto sekwencji
docelowej MRSA
w dodatniej próbie
kontrolnej.
Controls
INVALID
Patrz część Kontrola
jakości.
Controls
INVALID
Patrz część Kontrola
jakości.
–
Zmieniono domyślną
nazwę ujemnej próby
kontrolnej.
Controls
INVALID
–
Zmieniono domyślną
nazwę dodatniej próby
kontrolnej.
Controls
INVALID
i wprowadź #NC#. Zapisz
badanie i ponownie
wyeksportuj.
i wprowadź #PC#. Zapisz
badanie i ponownie
wyeksportuj.
W programie MAS 30 dni przed upływem daty ważności odczynników wyświetlane jest ostrzeżenie.
05548942001-04PL
22
Doc Rev. 4.0
5.
W programie MAS wyświetlane mogą być następujące komunikaty:
Komunikat
Interpretacja
Stan
Macro file <…>
was not found
Brak <…> pliku
makropolecenia
w <C:\Export to MAS\
Macros>
Interpretation
aborted
CCExperiment file
<…> was not
found
Brak <…> pliku CCE
w <C:\Export to MAS\
ColorCompensations>
Interpretation
aborted
CCObject
<…> file was not
found
Brak <…> pliku CCO
w folderze <C:\Export to
MAS\ColorCompensations>
Interpretation
aborted
Error in… Color
Compensation
Experiment/Object
/ MRSA
Experiment / or
MD5 Hash code
Błąd przy sprawdzaniu, czy
lik *.ixo jest prawidłowy.
Interpretation
aborted
Modified test
method in < ….>
Wykryto zmieniony
parametr.
Run
INVALID
Wyeksportuj ponownie plik
makropolecenia z oprogramowania LightCycler®
do folderu <C:\Export to
MAS\Macros>.
CCE z oprogramowania
®
LightCycler do folderu
<C:\Export to MAS\
CCO z oprogramowania
®
LightCycler do folderu
<C:\Export to MAS\
badania oraz pliki CC
i makropolecenia z oprogramowania LightCycler®.
Jeżeli ten komunikat pojawia
się stale, skontaktuj się
z miejscowym serwisem
firmy Roche.
Patrz „User Developed or
Modified Test Method”.
KONTROLA JAKOŚCI
1.
W każdej reakcji LightCycler® MRSA Advanced zawarta jest wewnętrzna próba kontrolna (IC).
IC służy do kontroli inhibicji próbek i monitorowania niezawodności odczynników.
a.
Wewnętrzna próba kontrolna (IC)
Wynik IC musi być dodatni dla wszystkich próbek ujemnych dla MRSA oraz dla ujemnej
próby kontrolnej (NC). Jeżeli dla próbki o ujemnym wyniku wynik IC jest ujemny, próbka
jest nieważna i należy powtórzyć procedurę PCR na świeżo rozmrożonej, przetworzonej próbce. Jeżeli wynik IC jest ujemny dla NC, cały przebieg reakcji jest nieważny i musi zostać powtórzony z użyciem zamrożonych przetworzonych próbek lub nowych
próbek. Jeżeli przebieg powtórnej reakcji z zastosowaniem zamrożonych, przetworzonych próbek jest nadal błędny, zanotuj nieważny wynik i skontaktuj się z miejscowym
biurem firmy Roche. Wynik IC pomija się w przypadku próbek o wyniku dodatnim dla
MRSA oraz w przypadku poprawnego wyniku dodatniej próby kontrolnej (PC),
ponieważ podczas amplifikacji MRSA może dochodzić do współzawodnictwa z tą próbą
kontrolną.
2.
W każdym przebiegu należy uwzględnić co najmniej 1 PC oraz 1 NC. PC służy do monitorowania defektów odczynników. NC stosuje się do wykrycia zanieczyszczenia odczynników lub
otoczenia przez DNA MRSA. Odczynniki do amplifikacji zawierają enzym zapobiegający
zanieczyszczeniu amplikonami MRSA. Oprogramowanie LightCycler® automatycznie przypisuje obu próbom kontrolnym pozycje w urządzeniu.
a.
Ujemna próba kontrolna (NC)
Wynik NC musi być ujemny, a wynik wewnętrznej próby kontrolnej musi być dodatni.
Jeżeli NC nie spełnia tych kryteriów, cały przebieg testowy jest nieważny i musi zostać
powtórzony z użyciem zamrożonych, przetworzonych próbek lub nowych próbek. Jeżeli
przebieg powtórnej reakcji jest nadal błędny, należy skontaktować się z miejscowym
biurem firmy Roche.
05548942001-04PL
23
Doc Rev. 4.0
b.
Dodatnia próba kontrolna (PC)
Wynik PC musi być dodatni (przy dodatnim lub ujemnym wyniku IC). Jeżeli PC nie
spełnia tego kryterium, cały przebieg jest nieważny i musi zostać powtórzony z użyciem
zamrożonej, przetworzonej próbki lub nowej próbki. Jeżeli przebieg powtórnej reakcji
jest nadal błędny, należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche.
Program Micro Analysis Software (MAS) może generować znaczniki i komentarze. Aby
stwierdzić poprawność przebiegu reakcji, użytkownik musi sprawdzić, czy wydruki przebiegu reakcji zawierają znaczniki i komentarze.
Próba
kontrolna
Wynik
CH 610
(MRSA)
Wynik
CH 670
(IC)
Interpretacja
UJEMNY
DODATNI
Poprawny
działań
DODATNI
DODATNI
lub
przebieg,
nie
podejmować
Błędny przebieg, przeprowadzić reakcję
na nowych próbkach
UJEMNY
Ujemna
próba
kontrolna
UJEMNY
UJEMNY
DODATNI
DODATNI
lub
na
zamrożonych,
przetworzonych
próbkach (lub nowych próbkach). Jeżeli
powtórny przebieg z zastosowaniem
zamrożonych, przetworzonych próbek
jest nadal błędny, należy skontaktować
się z miejscowym biurem firmy Roche.
Poprawny
działań
przebieg,
nie
podejmować
UJEMNY
Dodatnia
próba
kontrolna
DODATNI
UJEMNY
lub
UJEMNY
na
zamrożonych,
przetworzonych
próbkach (lub nowych próbkach). Jeżeli
powtórny przebieg z zastosowaniem
zamrożonych, przetworzonych próbek
jest nadal błędny, należy skontaktować
się z miejscowym biurem firmy Roche.
Uwaga: Jeżeli w teście LightCycler® MRSA Advanced dla ujemnej próby kontrolnej (NC) lub
kontroli MRSA (+) C otrzymuje się stale błędny wynik, plik LightCycler® Multicolor
Compensation może być nieprawidłowy. Należy powtórzyć badanie kompensacji
koloru lub skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania
pomocy technicznej.
Zewnętrzna dodatnia próba kontrolna (EPC)
Dodatniej próby kontrolnej MicroBioLogics® KWIK-STIK™ MRSA (P/N: 0158ROCHE) można używać
w celach ćwiczeniowych, do badań sprawności oraz jako zewnętrznej kontroli jakości dla testu
LightCycler® MRSA Advanced. W niniejszej zewnętrznej dodatniej próbie kontrolnej wykorzystano
szczep MRSA, reprezentujący typ RE2. W przypadku posiadania szczepów MRSA reprezentujących
typy RE3 i RE7 można je wykorzystać jako dodatkowe zewnętrzne dodatnie próby kontrolne w celu
kontroli primerów i sond stosowanych w teście, które nie podlegają w nim bezpośredniemu
nadzorowi. Tam gdzie to stosowne, zewnętrznych prób kontrolnych można używać zgodnie z wytycznymi lokalnych, państwowych i federalnych jednostek akredytujących. W celu przygotowania
wymazówki należy wykonać czynności opisane w dołączonej do opakowania KWIK-STIK™ ulotce,
nie wolno jednak umieszczać wymazówki na podłożu hodowlanym. Po przesiąknięciu wymazówki
uwodnionym materiałem w celu przygotowania próbek i zbadania wymazówki należy postępować
według wskazówek zawartych w ulotce testu LightCycler® MRSA Advanced, dołączonej do
opakowania.
05548942001-04PL
24
Doc Rev. 4.0
Wynik EPC musi być dodatni (przy dodatnim lub ujemnym wyniku IC). Jeżeli EPC nie spełnia tego
kryterium, cały przebieg MagNA Lyser jest nieważny i musi ona zostać powtórzona z użyciem nowej
próbki. Jeżeli przebieg powtórnej reakcji jest nadal błędny, należy skontaktować się z miejscowym
biurem firmy Roche.
Uwaga: Dotychczas rozróżniono siedem typów kasety SCCmec (I–VII) i opisano kilka odmian
typów tejże kasety SCCmec4. Test LightCycler® MRSA Advanced jest oparty na
zastrzeżonym systemie detekcji, wykrywającym szczepy MRSA posiadające różne
sekwencje molekularne w okolicy otaczającej połączenie kasety SCCmec z genem
orfX na prawym krańcu (ang. right extremity, RE). Wykazano, że test LightCycler®
MRSA Advanced wykrywa różne typy RE, w tym RE2, RE3 i RE7. Ponadto, analiza
sekwencji typu RE1 wykazała 100-procentową homologię z primerami i sondami
stosowanymi w teście LightCycler® 2.0 MRSA Advanced.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY
1.
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania
kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
OGRANICZENIA METODY
1.
Niniejszego produktu można używać wyłącznie z urządzeniem LightCycler® 2.0.
2.
Ten test został zatwierdzony wyłącznie do badania próbek pobranych z jamy nosowej ludzi.
3.
Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od właściwego pobrania próbki (liczby mikroorganizmów w próbce), transportu, przechowywania oraz procedur przetwarzania.
4.
Produkt ten powinien być używany wyłącznie przez wykwalifikowany personel.
5.
Dodatni wynik testu LightCycler® MRSA Advanced nie dowodzi obecności żywych MRSA.
Wskazuje jednak na obecność MRSA. Dodatni wynik nie dowodzi nieskuteczności leczenia
infekcji, jako że w jamie nosowej może przetrwać DNA martwych komórek bakteryjnych.
Ujemny wynik po wcześniejszym wyniku dodatnim może, ale nie musi, wskazywać na skuteczność leczenia infekcji.
6.
Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod
użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu
określenia występujących pomiędzy nimi różnic jakościowych.
7.
Obecność enzymu AmpErase w mieszaninie reakcyjnej testu LightCycler® MRSA Advanced
zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia amplikonu. Jednak zanieczyszczenia materiałem pochodzącym z MRSA (+) C i próbek klinicznych można uniknąć jedynie dzięki stosowaniu zasad
dobrej praktyki laboratoryjnej i uważnemu wykonywaniu procedur opisanych w niniejszej
ulotce, dołączonej do opakowania zestawu.
8.
Wykrywalność MRSA przy niskich stężeniach (tj. 1000 CFU/wymazówkę) w obecności
szczepów Staphylococcus aureus wrażliwych na metycylinę (MSSA) w stężeniach powyżej
10E4 CFU/wymazówkę nie została wykazana.
9.
Mutacje lub polimorfizm w obrębie regionu genomu bakteryjnego, z którym wiążą się primery
i (lub) sonda używane w teście LightCycler® MRSA Advanced, chociaż rzadkie, mogą
utrudniać wykrycie bakterii. Rzadko występujące formy szczepów MSSA posiadające
genetyczną odmianę kasety SCCmec mogą dawać w teście LightCycler® MRSA Advanced
wyniki dodatnie.
10.
Podobnie jak w przypadku innych testów do diagnostyki in vitro z zastosowaniem techniki
PCR, możliwe jest wykrycie bardzo niskiego stężenia sekwencji docelowej, znacznie poniżej
granicy wykrywalności (LOD) testu, jednak wyniki mogą nie być powtarzalne (więcej
szczegółów podano w części „Powtarzalność”).
11.
Skażenie krzyżowe lub produktami poprzedniej reakcji może nastąpić przy stężeniach MRSA
powyżej (>) 10E5 CFU/wymazówkę.
05548942001-04PL
25
Doc Rev. 4.0
Substancje wpływające na wynik testu
Do substancji, które mogą zakłócać wykrywanie MRSA w teście LightCycler® MRSA Advanced
i potencjalnie dawać błędne wyniki, należą krew oraz nadmierne ilości wydzieliny / śluzu z nosa.
Krew wykryto w 20 wymazach z jamy nosowej spośród 1620 (1,2%) próbek; żadna nie dała błędnego
wyniku z powodu błędu wewnętrznej próby kontrolnej (IC).
Wykazano, że poniższe egzogenne substancje (patrz tabela 4), które są składnikami leków zmniejszających przekrwienie i substancji stosowanych do łagodzenia suchości i (lub) podrażnienia w jamie
®
nosowej, nie zakłócają wykrywania MRSA w teście LightCycler MRSA Advanced.
Tabela 4
Substancje egzogenne badane z testem LightCycler® MRSA Advanced
Nazwa handlowa
Substancja czynna
InfectoPyoderm®
Mupirocyna
Turixin
®
20 mg/g (antybiotyk)
Mupirocyna w postaci soli wapnia
Maść do nosa Bepanthen®
Dexpanthenol
12-godzinny spray do nosa
Accumed
Chlorowodorek oksymetazoliny
przekrwienie)
Otriven
®
21,5 mg/g (antybiotyk)
50 mg/g (prowitamina B5)
Ksylometazolina
0,05% (lek zmniejszający
0,1% (lek zmniejszający przekrwienie)
Oczekiwane wartości
W badaniu klinicznym testu LightCycler® MRSA Advanced zebrano 1402 próbki wymazów z jamy
nosowej od 1402 pacjentów spełniających określone kryteria w 5 placówkach z różnych części
Stanów Zjednoczonych. Badaną populację podzielono na pacjentów hospitalizowanych, ale nie na
oddziale intensywnej opieki medycznej (1007; 71,8%), hospitalizowanych na oddziale intensywnej
opieki medycznej (67; 4,8%), przebywających w domach opieki lub instytucjach rehabilitacyjnych
(255; 18,2%) i na personel medyczny (73; 5,2%). Całościowa liczba dodatnich wyników próbek
MRSA uzyskanych poprzez bezpośrednią hodowlę chromogeniczną wyniosła 187 (13,3%). Tabela 5
podaje liczby wyników dodatnich i ujemnych uzyskanych poprzez bezpośrednią hodowlę chromogeniczną w różnych grupach.
Tabela 5
Oczekiwane wartości MRSA w różnych grupach
Liczba
wyników
dodatnich (%)
Liczba
wyników
ujemnych (%)
Całkowita
liczba wyników
(%)
Hospitalizowani, ale nie na oddziale
intensywnej opieki medycznej
74 (7,3%)
933 (92,7%)
1007 (71,8%)
Hospitalizowani na oddziale
intensywnej opieki medycznej
3 (4,5%)
64 (95,5%)
67 (4,8%)
109 (42,7%)
146 (57,3%)
255 (18,2%)
1 (1,4%)
72 (98,6%)
73 (5,2%)
187 (13,3%)
1215 (86,7%)
1402
Grupa
Przebywający w domach opieki lub
instytucjach rehabilitacyjnych
Personel medyczny
Razem
05548942001-04PL
26
Doc Rev. 4.0
CHARAKTERYSTYKA SKUTECZNOŚCI
SKUTECZNOŚĆ KLINICZNA
Charakterystykę skuteczności testu LightCycler® MRSA Advanced sporządzono w wieloośrodkowych, prospektywnych badaniach, przeprowadzonych w 5 placówkach poprzez porównanie testu
LightCycler® MRSA Advanced z innym, zatwierdzonym przez FDA teście amplifikacji kwasu
nukleinowego (NAAT), z bezpośrednią hodowlą chromogeniczną i hodowlą bulionową (bardziej czułą
metodą hodowlaną). Badanie objęło osoby, w tym personel medyczny, znajdujące się w grupie
ryzyka kolonizacji jamy nosowej. Każda z tych osób uczestniczyła w badaniu tylko raz. Osoby, które
przyjmowały antybiotyki ogólnoustrojowe lub miejscowe — do jamy nosowej — w leczeniu kolonizacji
jamy nosowej przez MRSA od dnia zebrania próbki i do tygodnia przed uczestnictwem w badaniu,
poniżej 2 lat i (lub) nietolerujące zebrania próbki do wymazu z jamy nosowej były wykluczone
z badania.
U każdej osoby pobrano próbki wymazówką o dwóch główkach. Jedną główkę wymazówki zastosowano do wykonania bezpośredniego wymazu na jednej czwartej chromogenicznej płytki agarowej
i przetworzono zgodnie z ulotką dołączoną do opakowania testu LightCycler® MRSA Advanced. Na
pozostałych ćwiartkach chromogenicznej płytki agarowej wykonano wymaz sterylną ezą. Drugą
główkę wymazówki zastosowano do wykonania bezpośredniego wymazu na kolejnej płytce agarowej
z cefoksytyną i przetworzono zgodnie z ulotką dołączoną do opakowania innego, zatwierdzonego
przez FDA testu amplifikacji kwasu nukleinowego (NAAT). Następnie przeniesiono drugą główkę
wymazówki do bulionu sojowego Trypticase i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 35–37°C,
a następnie pasażowano na chromogeniczną płytkę z cefoksytyną (hodowla bulionowa). Płytki
z kulturą chromogeniczną inkubowano przez 20–48 godzin w temperaturze 35–37°C. Jeśli po
44–48 godzinach inkubacji pojawiły się przypuszczalne kolonie MRSA na którejkolwiek z płytek
hodowlanych, wykonywano test na koagulazę i barwienie Grama. Wszystkie badania zostały
wykonane przez ośrodki uczestniczące w badaniu.
Skuteczność testu LightCycler® MRSA Advanced wyliczano w odniesieniu do wyników innego, zatwierdzonego przez FDA testu amplifikacji kwasu nukleinowego (NAAT), bezpośredniej hodowli
chromogenicznej i hodowli bulionowej. Próbki, z których uzyskano MRSA w bezpośredniej hodowli
chromogenicznej z główki A lub główki B wymazówki, uznano za dodatnie na MRSA, chyba że
stwierdzono inaczej.
Zebrano łącznie 1620 próbek wymazów z jamy nosowej w 5 placówkach z różnych części Stanów
Zjednoczonych i przebadano, stosując test LightCycler® MRSA Advanced. Spośród 1620 przebadanych próbek 1402 spełniało kryteria uwzględnienia w analizie statystycznej1. Całościowa liczba
dodatnich wyników próbek MRSA uzyskanych poprzez bezpośrednią hodowlę chromogeniczną
wyniosła 187 (13,3%).
®
Ogółem 2 (1,7%) spośród 117 przebiegów LightCycler wykonanych podczas badania były nieważne
z powodu odstępstw od przepisu badania. Dziesięć (10) (0,6%) wymazów z jamy nosowej spośród
1620 przebadanych testem LightCycler® Test MRSA Advanced dał błędne wyniki z powodu błędu
wewnętrznej próby kontrolnej (IC) po testach wstępnych, a 7 na 1620 (0,4%) pozostało błędnych
z powodu błędu wewnętrznej próby kontrolnej (IC) po powtórnym przeprowadzeniu testu.
1
218 próbek nie nadawało się do oceny na potrzeby analizy statystycznej: 36 osób nie spełniło kryteriów rekrutacji do
badania, 153 próbki nie zostały przetestowane zgodnie z przepisem badania, 22 próbki były nieważne z powodu błędu
zewnętrznej próby kontrolnej i 7 próbek było nieważnych z powodu błędu wewnętrznej próby kontrolnej. Po ponownym
przetestowaniu 7 próbek pozostały one nieważne z powodu błędu wewnętrznej próby kontrolnej.
05548942001-04PL
27
Doc Rev. 4.0
Wyniki uzyskane z wymazów próbek u osób spełniających kryteria, badanych na obecność MRSA
testem LightCycler® MRSA Advanced, porównano z wynikami uzyskanymi w bezpośredniej hodowli
chromogenicznej innym zatwierdzonym przez FDA testem NAAT i hodowli w bulionie, co pokazano
odpowiednio w tabelach 6, 7 i 8. W tabeli 6 porównano 1402 nadające się do oceny próbki, dla
których uzyskano wynik ważny w teście LightCycler® MRSA Advanced i w bezpośredniej hodowli
chromogenicznej. W tabeli 7 porównano 1385 próbek, dla których uzyskano wynik ważny w teście
LightCycler® MRSA Advanced i w innym zatwierdzonym przez FDA teście NAAT, dla którego
dodatkowo uzyskano zgodne wyniki bezpośredniej hodowli chromogenicznej główek A i B
wymazówki. W tabeli 8 porównano 1395 nadających się do oceny próbek, dla których uzyskano
wynik ważny w teście LightCycler® MRSA Advanced i hodowli w bulionie.
Tabela 6
Porównanie wyników testu LightCycler® MRSA Advanced
z bezpośrednią hodowlą chromogeniczną
Test LightCycler® MRSA Advanced
Dodatni
Ujemny
Razem
Procentowa zgodność pozytywna
(95% dokładności CIa)
Procentowa zgodność negatywna
Bezpośrednia hodowla chromogeniczna
Dodatni
Ujemny
178
44
9
1171
187
1215
95,2%
(91,1%, 97,8%)
96,4%
(95,2%, 97,4%)
Razem
222
1180
1402
Uwaga: W tym podsumowaniu tabelarycznym uwzględniono 1402 nadające się do oceny próbki, dla których uzyskano
®
wyniki ważne w teścieLightCycler MRSA Advanced i bezpośredniej hodowli chromogenicznej.
a
CI = przedział ufności
Spośród 178 próbek z dodatnim wynikiem w teście LightCycler® MRSA Advanced i w bezpośredniej
hodowli chromogenicznej w innym zatwierdzonym przez FDA teście NAAT uzyskano wynik dodatni
dla 175 prób i ujemny dla 3 prób.
Spośród 44 próbek z dodatnim wynikiem w teście LightCycler® MRSA Advanced i ujemnym w bezpośredniej hodowli chromogenicznej w innym zatwierdzonym przez FDA teście NAAT uzyskano
wynik dodatni dla 25 prób i ujemny dla 19 prób.
Spośród 9 próbek z ujemnym wynikiem w teście LightCycler® MRSA Advanced i dodatnim w bezpośredniej hodowli chromogenicznej w innym zatwierdzonym przez FDA teście NAAT uzyskano
wynik dodatni dla 4 prób i ujemny dla 5 prób.
Spośród 1171 próbek z ujemnym wynikiem w teście LightCycler® MRSA Advanced i w bezpośredniej
hodowli chromogenicznej w innym zatwierdzonym przez FDA teście NAAT uzyskano wynik dodatni
dla 76 prób i ujemny dla 1091 prób oraz błędny wynik bądź brak wyniku dla 4 prób.
05548942001-04PL
28
Doc Rev. 4.0
Analiza rozbieżności
Dalsze badania (tj. testy na wynikającą z obecności genu mecA oporność na oksacylinę z zastosowaniem metody dyfuzyjno-krążkowej z użyciem krążka z cefoksytyną, przeprowadzenie reakcji PCR
specyficznej dla genów fem- mecA i sekwencjonowanie regionów SCCmec) wykonano na wszystkich
próbkach, dla których uzyskano rozbieżne wyniki pomiędzy bezpośrednią hodowlą chromogeniczną
(tylko próbki, które dały zgodne wyniki dla główek wymazówek A i B) a testem LightCycler® MRSA
Advanced lub pomiędzy bezpośrednią hodowlą chromogeniczną (tylko próbki, które dały zgodne
wyniki dla główek wymazówek A i B) w innym zatwierdzonym przez FDA teście NAAT.
•
Analiza rozbieżności potwierdziła obecność MRSA w 30 z 44 próbek, dla których
uzyskano dodatni wynik w teście LightCycler® MRSA Advanced, ale ujemny w bezpośredniej hodowli chromogenicznej.
•
Obecność MRSA potwierdzono w 4 z 9 próbek, dla których uzyskano ujemny wynik
w teście LightCycler® MRSA Advanced, ale dodatni w bezpośredniej hodowli chromogenicznej.
•
Obecność MRSA potwierdzono w 13 z 76 próbek, dla których uzyskano dodatni wynik
®
w innym zatwierdzonym przez FDA teście NAAT, ale ujemny w teście LightCycler
MRSA Advanced i w bezpośredniej hodowli chromogenicznej.
Tabela 7
Porównanie wyników testu LightCycler® MRSA Advanced
z wynikami innego zatwierdzonego przez FDA testu NAAT
Dodatni
Ujemny
Razem
Inny zatwierdzony przez FDA test NAAT
Dodatni
Ujemny
195
20
77
1093
272
1113
71,7%
(65,9%, 77,0%)
98,2%
(97,2%, 98,9%)
Razem
215
1170
1385
Uwaga: W tym podsumowaniu tabelarycznym uwzględniono 1385 próbek, dla których uzyskano wynik ważny w teście
®
LightCycler MRSA Advanced i innym zatwierdzonym przez FDA teście NAAT, dla którego dodatkowo uzyskano zgodne
wyniki bezpośredniej hodowli chromogenicznej główek A i B wymazówki.
a
CI = przedział ufności.
Spośród 195 próbek z dodatnim wynikiem w teście LightCycler® MRSA Advanced i w innym zatwierdzonym przez FDA teście NAAT, w bezpośredniej hodowli chromogenicznej uzyskano wynik
dodatni dla 171 próbek i ujemny dla 24 próbek (obecność MRSA potwierdzono w 20 próbkach z 24
po analizie rozbieżności).
Spośród 20 próbek z dodatnim wynikiem w teście LightCycler® MRSA Advanced i ujemnym w innym
zatwierdzonym przez FDA teście NAAT w bezpośredniej hodowli chromogenicznej uzyskano wynik
dodatni dla 1 próbki i ujemny dla 19 próbek (obecność MRSA potwierdzono w 10 próbkach z 19 po
analizie rozbieżności).
Spośród 77 próbek z ujemnym wynikiem w teście LightCycler® MRSA Advanced i dodatnim w innym
zatwierdzonym przez FDA teście NAAT w bezpośredniej hodowli chromogenicznej uzyskano wynik
dodatni dla 1 próbki i ujemny dla 76 próbek (obecność MRSA potwierdzono w 13 próbkach z 76 po
analizie rozbieżności).
05548942001-04PL
29
Doc Rev. 4.0
Spośród 1093 próbek z ujemnym wynikiem w teście LightCycler® MRSA Advanced i w innym zatwierdzonym przez FDA teście NAAT, w bezpośredniej hodowli chromogenicznej uzyskano wynik dodatni
dla 4 próbek (obecność MRSA potwierdzono we wszystkich 4 po analizie rozbieżności) i ujemny dla
1089 próbek.
Tabela 8
®
Porównanie wyników testu LightCycler MRSA Advanced z hodowlą w bulionie
Dodatni
Ujemny
Razem
Hodowla w bulionie
Dodatni
Ujemny
184
38
21
1152
205
1190
89,8%
(84,8%, 93,5%)
96,8%
(95,6%, 97,7%)
Razem
222
1173
1395
Uwaga: W tym podsumowaniu tabelarycznym uwzględniono wszystkie 1395 próbek spośród 1402
®
nadających się do oceny próbek, dla których uzyskano wynik ważny w teście LightCycler MRSA Advanced
i hodowli bulionowej. Wyniki hodowli w bulionie były błędne lub brakowało wyniku dla 7 z 1402 próbek
nadających się do oceny.
a
CI = przedział ufności.
OCENA DZIAŁANIA W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
A.
Czułość analityczna
Czułość analityczną testu LightCycler® MRSA Advanced ustalono przy użyciu 3 szczepów MRSA,
reprezentujących trzy typy RE, będące celem działania tego testu (prawy kraniec połączenia
(RE) kasety SCCmec i genu orfX, typy 2, 3 i 7). Hodowle tych szczepów określono ilościowo,
rozcieńczono do wartości mieszczących się w zakresie od 100 do 400 jednostek tworzących kolonie
(CFU) na wymazówkę i nasączono nimi wymazówki zanurzone wcześniej w różnych podłożach
transportowych. Wszystkie rozcieńczenia w pobliżu wartości granicy wykrywalności (LOD) badano
w co najmniej 30 powtórzeniach. Granica wykrywalności, ustalona dla każdego badanego typu
szczepu i każdego rodzaju wymazówki, stanowi najmniejszą liczbę CFU/wymazówkę, dla której
zostanie uzyskany dodatni wynik z prawdopodobieństwem 95%. Wyniki wskazują, że dzięki testowi
LightCycler® MRSA Advanced można uzyskać wynik dodatni z prawdopodobieństwem 95% dla
wymazówki z 240 CFU.
Tabela 9
Wykrywalność MRSA na różnych podłożach transportowych
Rodzaje wymazówek
CFU/wymazówkę
Podłoże transportowe Liquid Stuart
240
Żel Amies bez podłoża transportowego
z węglem drzewnym
240
Żel Amies z podłożem transportowym
z węglem drzewnym
240
05548942001-04PL
30
Doc Rev. 4.0
B.
Swoistość analityczna
Reprezentatywność
Skuteczność testu LightCycler® MRSA Advanced w badaniu 137 dokładnie scharakteryzowanych
izolatów MRSA reprezentatywnych dla klonów epidemiologicznych w USA przedstawiono w tabeli 10.
Szczepy pozyskano w ramach programu Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus
aureus (NARSA, sieć badania oporności Staphylococcus aureus na antybiotyki), finansowanego na
mocy umowy NIAID/NIH nr HHSN272200700055C i przez ośrodki kliniczne. Wszystkie szczepy były
testowane jako hodowle o zagęszczeniu 10E5 cfu/ml.
Dla wszystkich izolatów oprócz 1 (jednego) uzyskano dodatni wynik w teście LightCycler® MRSA
Advanced (99,3%).
Tabela 10
Izolaty MRSA reprezentatywne dla klonów epidemiologicznych pozyskane w ramach
programu Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA)
i dokładnie scharakteryzowane izolaty z ośrodków klinicznych
Typ USA
Liczba
przetestowanych
izolatów
Izolaty, dla których
uzyskano dodatni wynik
w teście LightCycler®
MRSA Advanced
100
54*
53
200
5
5
300
37
37
400
4
4
500
7
7
600
3
3
700
4
4
800
7
7
1000
7
7
1100
4
4
Typ nie do
określenia /
nieznany
Razem
5
5
137
136 (99,3%)
* Spośród 54 badanych szczepów typu USA 100, jeden (NRS642) dawał
®
ujemny wynik z testem LightCycler MRSA Advanced.
Wyłączność diagnostyczna
Swoistość testu LightCycler® MRSA Advanced oceniano, badając reaktywność krzyżową z drobnoustrojami patogennymi i czynnikami kontaminującymi, które są potencjalnie obecne w prawidłowej
mikroflorze jamy nosowej. Badane gatunki obejmowały 13 gatunków wirusów, 66 gatunków bakterii
i 7 gatunków grzybów, jak podano w tabeli 11. Drobnoustroje badano albo w formie hodowli o stężeniach 10E6 do 10E7 cfu/ml, albo jako próbki genomowego DNA o stężeniach 10 pg/PCR. Dodatkowo
badano również ludzkie DNA o stężeniu 5 ng/reakcję. W przypadku DNA ludzkiego i wszystkich
badanych gatunków w teście LightCycler® MRSA Advanced uzyskano ujemny wynik na obecność
MRSA.
05548942001-04PL
31
Doc Rev. 4.0
Tabela 11
Gatunki badane w kierunku reaktywności krzyżowej z testem LightCycler® MRSA Advanced
Gatunki
Staphylococcus aureus (MSSA)
Haemophilus influenzae
Staphylococcus cohnii ssp. cohnii
Haemophilus parainfluenzae
Staphylococcus epidermidis
Wirus Herpes simplex 1
Staphylococcus haemolyticus
Ludzkie DNA
Staphylococcus hominis
Wirus grypy A (H1N1), A (H3N2)
Staphylococcus intermedius
Wirus grypy, typ B
Staphylococcus lugdunensis
Issatchenkia orientalis (Candida krusei)
Staphylococcus pseudointermedius
Klebsiella pneumoniae ssp,ozeanae
Staphylococcus saprophyticus
Kocuria kristinae
Staphylococcus schleiferi ssp. coagulans
Kytococcus schroeteri
Staphylococcus sciuri
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii
Staphylococcus simulans
Legionella pneumophila
Staphylococcus warneri
Metapneumovirus
Staphylococcus xylosus
Microbacterium testaceum
Acinetobacter baumannii
Micrococcus luteus
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Moraxella catarrhalis
Actinomyces odontolyticus
Morganella morganii
Mycobacterium avium
Adenowirus 7A
Aerococcus urinaeequi
Mycoplasma pneumoniae
Aspergillus fumigatus
Mycoplasma salivarium
Bacteroides fragilis
Neisseria meningitidis
Bacteroides uniformis
Oerskovia jenensis
Bacteroides vulgatus
Wirus grypy rzekomej 1
Bordetella bronchioseptica
Bordetella parapertussis
Bordetella pertussis
Parvimonas micra (Peptostreptococcus micros)
Burkholderia cepacia
Peptostreptococcus stomatis
Candida albicans
Peptostreptococcus anaerobius
Candida glabrata
Planococcus maritimus
Candida parapsilosis
Proteus mirabilis
Candida tropicalis
Proteus vulgaris
Citrobacter freundii
Pseudomonas putida
Pseudomonas aeruginosa
Koronawirus
Corynebacterium glutamicum
Wirusy RSV (A, B i A2)
Corynebacterium amycolatum
Rinowirus
Corynebacterium jeikeium
Rhodococcus equi
Cryptococcus neoformans
Rothia mucilaginosa
Eikenella corrodens
SARS
Enterococcus faecalis
Streptococcus agalactiae
Enterococcus faecium
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Enterowirus
Escherichia coli
Streptococcus viridans
Finegoldia magna (Peptostreptococcus magnus)
Veillonella atypica
Haemophilus aphrophilus
W 100% przypadków przetestowane mikroorganizmy nie wykazały reaktywności krzyżowej.
Dodatkowo przeprowadzono badanie 117 izolatów gronkowców koagulazoujemnych opornych na
metycylinę, 104 izolatów gronkowców koagulazoujemnych wrażliwych na metycylinę oraz 100 izolatów
Staphylococcus aureus wrażliwych na metycylinę, przy stężeniach od 10e4 do 10e5 cfu/reakcję,
pozyskanych z różnych ośrodków klinicznych na terenie Europy. Dla dodatkowych szczepów uzyskano
ujemny wynik w teście LightCycler® MRSA Advanced.
05548942001-04PL
32
Doc Rev. 4.0
Powtarzalność
Przebadano zestaw próbek o różnych stężeniach MRSA i Staphylococcus epidermidis wrażliwych na
metycylinę (MSSE). Dwóch użytkowników w każdym z 3 ośrodków wykonywało jeden przebieg
dziennie dla każdej próbki przez 5 dni, stosując odczynniki z trzech serii (4 próbki x 3 powtórzenia
x 5 dni x 3 ośrodki x 3 serie x 2 użytkowników). Stosowano zestaw 12 próbek szczepu ATCC 43300
Staphylococcus aureus opornych na metycylinę (MRSA), rozcieńczonych do stężeń podanych
w tabeli 12. Hodowle ATCC szczepu 14990 Staphylococcus epidermidis wrażliwe na metycylinę
(MSSE) o tym samym stężeniu były uwzględniane przy każdym członie zestawu dla uzyskania
odpowiedniej matrycy próbek. Zestaw zawierał człon ujemny, poniżej granicy wykrywalności (LOD,
20 CFU/wymazówkę, oczekiwano dodatnich wyników w 30–70%), słaby dodatni (300 CFU/wymazówkę) i dodatni (800 CFU/wymazówkę). Człon ujemny zestawu dawał wyniki ujemne w 99% do
100% przypadków, poniżej granicy wykrywalności dawał wyniki dodatnie w 42% do 47% przypadków,
słaby dodatni człon dawał wyniki dodatnie w 99% do 100% przypadków, a człon dodatni dawał wyniki
dodatnie w 99% do 100% przypadków zależnie od ośrodka.
Tabela 12
Podsumowanie wyników badania powtarzalności
TM
Między seriami
Ododczynników
MRSA
TM
chyleCFU/ Rodzaj Średnia
TM CV
Nr/
nie
(%)
wyma- próbki (°C)
Liczba
StanSeria
%
zówkę
badadardonych
we
0
Ujemny
brak
brak
brak
danych danych danych
1
2
3
Między ośrodkami
Ośrodek
90/90 100%
90/90 100%
89/90** 99%
1
2
3
Nr/
Liczba
badanych
%
90/90 100%
89/90** 99%
90/90 100%
20*
Poniżej
59,56
LOD
0,22
0,4
1
2
3
52/90
30/90
39/90
58%
33%
43%
1
2
3
38/90
41/90
42/90
300
Słaby
59,48
dodatni
0,20
0,3
1
2
3
90/90 100%
89/90 99%
90/90 100%
1
2
3
89/90 99%
90/90 100%
90/90 100%
0,3
1
2
3
90/90 100%
90/90 100%
89/90** 99%
1
2
3
90/90 100%
89/90** 99%
90/90 100%
800 Dodatni 59,43
0,21
42%
46%
47%
Między dniami
Dzień
Nr/
Liczba
badanych
%
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
53/54**
54/54
54/54
54/54
54/54
25/54
26/54
22/54
25/54
23/54
53/54
54/54
54/54
54/54
54/54
53/54**
54/54
54/54
54/54
54/54
98%
100%
100%
100%
100%
46%
48%
41%
46%
43%
98%
100%
100%
100%
100%
98%
100%
100%
100%
100%
Uwaga: * Stężenie, przy którym uzyskuje się w przybliżeniu od 30% do 70% wyników dodatnich. ** Najwyraźniej zamieniono
miejscami jedną próbę dodatnią i jedną ujemną, znajdujące się obok siebie w tym samym przebiegu. Wykluczając te
próbki z analizy różnic między seriami, ośrodkami i dniami, uzyskano by wynik 100% powtarzalności.
Skażenie krzyżowe lub produktami poprzedniej reakcji
Przeprowadzono badanie analityczne oceniające możliwość skażenia krzyżowego pomiędzy próbkami
MRSA o wysokim stężeniu i próbkami niezawierającymi MRSA, testowanymi równolegle przez cały
czas pracy z testem LightCycler® MRSA Advanced. Dla wszystkich pięciu pełnych przebiegów wykonanych przez dwóch użytkowników (uwzględniano też proces przygotowania próbki) do piętnastu wymazów dodano 3,3 x 10E5 cfu MRSA typu RE2, a do piętnastu nie dodano tego szczepu. Silnie dodatnie
i ujemne wymazy przetworzono w procesie przygotowywania próbki i przygotowywania reakcji PCR
i umieszczono w urządzeniu LightCycler® 2.0 w celu przeprowadzenia reakcji PCR. Nie obserwowano
fałszywie dodatnich wyników spowodowanych skażeniem krzyżowym przy stężeniach 3,3 x 10E5 cfu/
wymazówkę.
05548942001-04PL
33
Doc Rev. 4.0
PIŚMIENNICTWO
1.
Kuehnert MJ, et al. Prevalence of Staphylococcus aureus nasal colonization in the United
States, 2001-2002. JID 2006; 193:172-9.
2.
Wyllie DH, et al. Mortality after Staphylococcus aureus bacteraemia in two hospitals in
Oxfordshire, 1997-2003: cohort study. BMJ. 2006; 333 (7562):281.
3.
Pinho MG, Filipe SR, de Lencastre H, Tomasz A Complementation of the essential
peptidoglycan transpeptidase function of penicillin-binding protein 2 (PBP2) by the drug
resistance protein PBP2A in Staphylococcus aureus. : J Bacteriol. 2001 Nov; 183(22):6525-31.
4.
Berglund C, Ito T, et al. Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec in a
methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain isolated in Sweden. Antimicrob Agents
Chemother 2008 Oct; 52(10): 3512-6.
5.
Cosgrove SE, et al. Comparison of Mortality Associated with Methicillin-Resistant and
Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus Bacteremia:A Meta-analysis. CID 2003:36, 53-59.
6.
Engemann JJ, et al. Adverse clinical and economic outcomes attributable to methicillin
resistance among patients with Staphylococcus aureus surgical site infection. Clin Infect Dis.
2003; 36(5):592-598.
7.
Abramson MA, et al. Nosocomial methicillin-resistant and methicillin-susceptible
Staphylococcus aureus primary bacteremia: at what costs? Infect Control Hosp Epidemiol.
1999; 20(6):408-411.
8.
Muto CA, et al. SHEA guideline for preventing nosocomial transmission of multidrug-resistant
strains of Staphylococcus aureus and Enterococcus. Infect Control Hosp Epidemiol. 2003;
24(5):362-386.
9.
Association for Professionals in Infection Control & Epidemiology, Inc (APIC). National
prevalence study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in U.S. healthcare
facilities. Executive summary. June 25, 2007.
10.
Klevens RM, et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United
States. JAMA. 2007; 298(15):1763-1771.
11.
Witte W. Nosocomial and community MRSA infections. EH ONLINE. http://www.europeanhospital.com/topics/article/4288.html. Accessed November 7, 2008.
12.
Calfee DP, et al. Strategies to prevent transmission of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus in acute care hospitals. Infect Control Hosp Epidemiol. 2008; 29(suppl 1):S62–S80.
13.
Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
14.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from
Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3.
Wayne, PA:CLSI, 2005.
15.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 51st Edition. 2010.
05548942001-04PL
34
Doc Rev. 4.0
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 4.0
04/2011
W
rozdziale
WYMAGANIA
DOTYCZĄCE
PRZECHOWYWANIA
I UŻYTKOWANIA oraz w rozdziale PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW
wprowadzono poprawki informujące o tym, że:
Odczynnik roboczy Master Mix należy przygotowywać bezpośrednio przed
użyciem i zużyć w ciągu 24 godzin od przygotowania. Jeśli odczynnik roboczy
Master Mix nie został zużyty natychmiast po przygotowaniu, należy go
przechowywać z dala od źródeł światła w temp. od 2 do 8°C przez okres do
24 godzin.
W razie jakichkolwiek pytań
przedstawicielstwem firmy Roche.
05548942001-04PL
35
prosimy
o
kontakt
z
miejscowym
Doc Rev. 4.0
Zestaw do lizy LightCycler® Advanced oraz
test LightCycler® MRSA Advanced zostały wyprodukowane przez:
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
Członek Grupy Roche
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Roche Diagnostics S.L.
Av. de la Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
ROCHE, LIGHTCYCLER, FASTSTART, MAGNA LYSER, MRSA ADVANCED, LC i AMPERASE są
znakami towarowymi firmy Roche.
ROCHE RESPONSE CENTER jest znakiem serwisowym firmy Roche.
BD CULTURESWAB jest znakiem towarowym firmy Becton Dickinson and Company.
BEPANTHEN jest znakiem towarowym firmy Bayer Healthcare.
BRIJ jest znakiem towarowym firmy Croda International, PLC.
COPAN TRANSYSTEM jest znakiem towarowym firmy Copan Diagnostics, Inc.
INFECTOPYODERM jest znakiem towarowym firmy Infectopharm GmbH.
KWIK-STIK jest znakiem towarowym firmy MicroBioLogics, Inc.
MICROSOFT, WINDOWS, VISUAL STUDIO i SQL SERVER są znakami towarowymi firmy Microsoft.
OTRIVEN jest znakiem towarowym firmy Novartis.
TURIXIN jest znakiem towarowym firmy GlaxoSmithKline.
Barwniki cyjaninowe zawarte w produkcie są objęte prawami patentowymi firmy GE Healthcare
BioSciences Corp. oraz Carnegie Mellon University i udostępniane są firmie Roche na zasadzie licencji
w celu ich włączenia do składników zestawów badawczych oraz zestawów do diagnostyki in vitro.
Wszelkie wykorzystanie takich zestawów do celów innych niż badawcze lub związane z diagnostyką
in vitro wymaga uzyskania podlicencji od firmy GE Healthcare BioSciences Corp., Piscataway, New
Jersey, USA, oraz Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pensylwania, USA.
Copyright 2011, Roche Molecular Systems, Inc. Wszystkie prawa zastrzeżone.
04/2011
(05446082001-04ENGL)
Doc Rev. 4.0
05548942001-04PL
05548942001-04
36
Doc Rev. 4.0

LightCycler® MRSA Advanced Test For Use With The

Transkrypt

Podobne dokumenty

Przyjęcia chorych - Śląskie Centrum Chorób Serca w Zabrzu

Prontoderm® Pianka

Prontoderm® Roztwór

fakty dotyczące mrsa cc 398 – czyli gronkowca złocistego opornego

Prontoderm® chusteczki

ProntOral® - ulotka

Odcinek 27. Diagnostyka chorób

Odporny na metycylinę gronkowiec złocisty - MRE-Rhein-Main

BADANIA NA OBECNOŚĆ MRSA