ĆWICZENIE 1

ĆWICZENIE 1
OZNACZANIE STĘŻENIA BILIRUBINY CAŁKOWITEJ W SUROWICY
ZASADA METODY
Bilirubina zawarta w surowicy reaguje z dwuazowanym kwasem sulfanilowym
tworząc rozpuszczalną w wodzie azobilirubinę, która ma różowe zabarwienie w środowisku
kwaśnym. W reakcji tej możliwe jest rozróżnienie bilirubiny bezpośredniej, reagującej bez
udziału akceleratora i bilirubiny pośredniej, która reaguje w jego obecności. Suma obu form
powstających w reakcji, w obecności akceleratora, nazywana jest bilirubiną całkowitą. W
zastosowanej metodzie akceleratorem jest dimetylosulfotlenek (DMSO). Intensywność
zabarwienia powstającej azobilirubiny jest wprost proporcjonalna do stężenia odpowiedniej
formy bilirubiny w surowicy.
MATERIAŁ BADANY
Surowica
ODCZYNNIKI
1. Odczynnik (kwas sulfanilowy 16 mmol z dodatkiem DMSO w rozcieńczonym
kwasie solnym)
2. Kalibrator - odpowiadający stężeniu bilirubiny 5 mg/dl
3. Roztwór roboczy (odczynnik - a) i azotyn sodu w stosunku 10.1
WYKONANIE
Odmierzyć
(ml)
Próba
badana
Próba badana
Próba
kompensacyjna kalibracyjna
Próba
kalibracyjna
kompensacyjna
roztwór
roboczy
1
-
1
-
surowica
0,05
0,05
-
-
kalibrator
-
-
0,05
0,05
odczynnik
-
1
-
1
Każdą z prób inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym miejscu,
odczytać absorbancje przy długości fali  = 540 nm, względem wody.
OBLICZENIA
stężenie bilirubiny (mg/dl) =
A bad.  A komp. bad.
A kal.  A komp. bad.
5
gdzie:
Abad. - absorbancja próby badanej
Akomp. bad. - absorbancja próby badanej kompensacyjnej
Akal. - absorbancja próby kalibracyjnej
Akomp. kal. - absorbancja próby kalibracyjnej kompensacyjnej
ĆWICZENIE 2
OZNACZANIE KWASU DELTA-AMINOLEWULINOWEGO W MOCZU
ZASADA METODY
Kwas delta-aminolewulinowy (ALA) jest prekursorem porfiryn. Powstaje on z
sukcynylo-CoA i glicyny. Reakcja ta katalizowana jest przez syntazę 8-aminolewulinową.
ALA w obecności acetyloacetonu w temperaturze około 100°C kondensuje na porfobilinogen,
który w reakcji z odczynnikiem Ehrlicha daje produkt o barwie różowej proporcjonalnie do
ilości porfobilinogenu, a pośrednio do ilości ALA.
MATERIAŁ BADANY
Mocz
ODCZYNNIKI
1. Acetyloaceton
2. Bufor octanowy o pH 4,6
3. Odczynnik Ehrlicha
4. Wzorzec macierzysty ALA -1 mg/ml
WYKONANIE
Próba badana:
Do probówki z korkiem odmierzyć 0,5 ml badanego moczu + 0,1 ml acetyloacetonu i
mieszać zawartość silnie wytrząsając. Zawartość probówki dopełnić buforem octanowym do
5 ml. Ogrzewać 10 minut w łaźni wodnej wrzącej, po czym ostudzić pod bieżącą wodą. 1 ml
płynu przenieść do innej probówki i zmieszać z 1 ml odczynnika Ehrlicha. Dokładnie po
15 inutach odczytać ekstynkcję wobec próby ślepej na spekolu w kuwetach 1 cm przy
długości fali  = 553 nm.
Próba ślepa:
0,5 ml badanego moczu + 4,5 ml buforu octanowego.
Ogrzewać 10 minut w łaźni wodnej wrzącej i dalej postępować jak z próbą badaną.
Wykonanie wykresu kalibracyjnego:
Z roztworu wzorca macierzystego (ALA) przygotować szereg rozcieńczeń.
Tabela 1
Numer
próbki
Wzorzec
macierzysty (ml)
Woda destylowana
(ml)
Stężenie (ALA)
mg/dl
1
0,05
9,95
0,5
2
0,1
9,9
1,0
3
0,2
9,8
2,0
4
0,3
9,7
3,0
5
0,4
9,6
4,0
6
0,5
9,5
5,0
Z każdego rozcieńczenia odmierzyć 0,5 ml, dodać po 0,1 ml acetyloacetonu i dalej
postępować jak z próbą badaną. Pomiary – wobec próby ślepej: 0,5 ml wody destylowanej
+ 4,5 ml buforu octanowego. Ogrzewać 10 minut w łaźni wodnej wrzącej i dalej postępować
jak z próbą badaną.
OBLICZENIA
Z wykresu kalibracyjnego odczytać stężenie ALA w mg/dl moczu i znając dobową
zbiórkę moczu przeliczyć wydalanie ALA na dobę