Laboratorium 09

Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
ĆWICZENIE 9
FITOROMEDIACJA I MIKROBIOLOGICZNA REMEDIACJA
ŚRODOWISK SKAŻONYCH
/Opiekun merytoryczny: dr hab. Teodora M. Traczewska, prof. nadzw. PWr
modyfikacja: dr inż. Agnieszka Trusz-Zdybek i mgr inż. Maciej Bełcik/
1.
Zagadnienia szczegółowe:
proces bioremediacji (mikro- i fitoremediacji), technologie ex-situ i in-situ,
fitodegradacja,
fitoekstrakcja,
fitostabilizacja,
fitowolatylizacja,
rizofiltracja,
rizodegradacja, podstawowe właściwości roślin stosowanych do fitoremediacji,
hiperakumulanty, wpływ metali ciężkich na organizmy żywe (rośliny, zwierzęta, ludzi),
bioremediacja naturalna, biostymulacja, bioaugmentacja, wpływ organicznych związków
toksycznych na organizmy żywe (rośliny, zwierzęta, ludzi)
2.
Literatura zalecana
Buczkowski Roman, Kondzielski Igor, Szymański Tomasz: Metody remediacji gleb
zanieczyszczonych metalami ciężkimi. Wydawnictwo Uniwersytetu Mikołaja Kopernika,
Toruń 2002. Strony 52-59, 66-92
Marecik Roman, Króliczak Paweł, Cyplik Paweł: Fitoremediacja – alternatywa dla
tradycyjnych metod oczyszczania środowiska. 2006. Biotechnologia 3 (74). Strony 8897 (http://pfb.info.pl/files/kwartalnik/3_2006/marecik-kroliczak.pdf)
Baranowska-Morek Agnieszka: Roślinne mechanizmy tolerancji na toksyczne działanie
metali
ciężkich.
2003.
Kosmos
52
(2-3).
Strony
283-298
(http://kosmos.icm.edu.pl/PDF/2003/283.pdf)
Hanus-Fajerska Ewa, Augustynowicz Joanna, Muszyńska Ewa, Koźmińska Aleksandra:
Organizmy przydatne w oczyszczaniu środowiska z nadmiernych stężeń pierwiastków
metalicznych. 2011. Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych 50. Strony 180-192
(http://www.ios.edu.pl/pol/pliki/nr50/nr_50_182.pdf)
Nowak Joanna: Bioremediacja gleb z ropy naftowej i jej produktów. 2008,
Biotechnologia
1
(80).
Strony
97-108
(http://www.pfb.info.pl/files/kwartalnik/1_2008/nowak.pdf)
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
Zad. 1: Oznaczanie aktywności oddechowej mikroorganizmów glebowych w obecności
toksyny oraz substancji biogennych
Materiały:
Szczelnie zamykane pojemniki, małe zlewki, kolby miarowe
Gleba skażona miedzią
KH2PO4
KNO3
KOH
HCl
Oranż metylowy
Wykonanie:
- skażoną miedzią glebę umieścić w czterech szczelnie zamykanych pojemnikach po
200 g w każdym,
- pojemniki opisać: kontrola, P, N, P+N,
- do pojemników dodać odpowiednie substancje biogenne zgodnie z opisem:
3
 K: 30 cm H2O,
3
3
 P: 20 cm 10% roztworu KH2PO4 i 10 cm H2O,
3
3
 N: 10 cm 10% roztworu KNO3 i 20 cm H2O,
3
3
 P+N: mieszaniny 20 cm 10% roztworu KH2PO4 i 10 cm 10% roztworu
KNO3,
- w pojemnikach umieścić małe zlewki zawierające po 10 cm3 KOH (50 mM) i
szczelnie zamknąć,
- pozostawić na 60 minut,
- po zakończeniu inkubacji zawartość przenieść do kolby miarowej, dodać 2-3 krople
oranżu metylowego,
- miareczkować 50 mM HCl do zmiany zabarwienia z żółtego na pomarańczowy,
Porównać aktywność oddechową mikroorganizmów glebowych indukowanych
poszczególnymi substancjami biogennymi w stosunku do nie indukowanych.
Obliczenia:
- ilość wydzielonego CO2 obliczyć ze wzoru:
y
(V0  V )  50
1000  m
gdzie:
y – aktywność oddechowa gleby [mM CO2/g gleby],
V0 – objętość KOH użyta do absorpcji CO2 [cm3],
V - objętość KOH nie zobojętniona przez HCO3- [cm3], odpowiadająca objętości
HCl zużytego do miareczkowania,
M – masa próbki gleby [g].
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
Zad. 2: Ocena wpływu metali ciężkich na przykładzie manganu na rośliny przy różnym
pH środowiska.
Materiały:
- Kolby Erlenmeyera
- Gleba ogrodowa
- Gleba skażona manganem
- pH-metr
- moczówki
- siewki pomidora
- gaza
Wykonanie:
- 4 kolby Erlenmeyera zawierające po 90 cm3 sterylnego roztworu fizjologicznego
podpisać: K, 4, 6, 8,
- do kolby podpisanej K (kontrola) wprowadzić odważone 10g gleby nieskażonej
(np. ogrodowej),
- do kolb podpisanych 4, 6 i 8 wprowadzić odważone 10g gleby skażonej manganem,
- wytrząsać przez 10 minut,
- poczekać kilka minut na sedymentację gleby,
- zlać ciecz nadosadową,
- sprawdzić pH roztworu oznaczonego K (kontrola)
- sprawdzić pH roztworów 4, 6, 8 i skorygować je (0,1 M kwasem solnym lub
wodorotlenkiem sodu) tak, aby uzyskać odpowiednio:
 4: pH 4
 6: pH 6
 8: pH 8
- po uzyskaniu roztworów o odpowiednim pH przelać je do wyznaczonych
pojemników,
- na kawałku gazy umieścić siewki roślin (np. pomidora), tak aby korzenie zostały
zanurzone w cieczy,
Po 7 i 14 dniach określić wielkość przyrostu roślin oraz zmiany w morfologii liści.
Dokonać oceny pobierania przez rośliny metali ciężkich z gleby w zależności od pH.
Określić: zabarwienie, obecność chlorozy i nekrozy, marszczenie się liści, porównać
występujące objawy z próbką kontrolną.
Zad. 3: Określenie intensywności
węglowodory w środowisku
wzrostu
mikroorganizmów
Materiały:
- Kolby Erlenmeyera z roztworem fizjologicznym
- Ziemia ogrodowa
- Ziemia skażona związkami ropopochodnymi
- Probówki
- Olej napędowy
rozkładających
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
Wykonanie:
- 2 kolby Erlenmeyera zawierające po 90 cm3 sterylnego roztworu fizjologicznego
podpisać: K, ZR,
- do kolby podpisanej K wprowadzić odważone 10 g gleby ogrodowej,
- do kolby podpisanej ZR wprowadzić odważone 10g gleby wcześniej skażonej
związkami ropopochodnymi,
- obie kolby intensywnie zamieszać,
- kolby odstawić na kilka minut do sedymentacji,
- do 3 probówek zawierających po 10 cm3 podłoża płynnego wprowadzić po 1 cm3
cieczy nadosadowej z kolby opisanej K (gleba ogrodowa), probówki opisać K1,
K2, K3,
- do probówek wprowadzić olej napędowy w objętości:
o K1: 0,01 cm3,
o K2: 0,05 cm3,
o K3: 0,10 cm3,
- do 3 probówek zawierających po 10 cm3 podłoża płynnego wprowadzić po 1 cm3
cieczy nadosadowej z kolby opisanej ZR (gleba zanieczyszczona związkami
ropopochodnymi), probówki opisać ZR1, ZR2, ZR3,
- do probówek wprowadzić olej napędowy w objętości:
o ZR1: 0,01 cm3,
o ZR2: 0,05 cm3,
o ZR3: 0,10 cm3,
Probówki (K1, K2, K3, ZR1, ZR2, ZR3) inkubować w temperaturze 22oC przez co
najmniej 72h. Po czasie inkubacji określić wzrost bakterii w obecności związków
ropopochodnych na podstawie wielkości zmętnienia podłoża płynnego,
Dokonać porównania w zależności od pochodzenia drobnoustrojów: gleba
ogrodowa, gleba skażona. Dokonać oceny zdolności mikroorganizmów do
zasiedlania środowiska zanieczyszczonych olejem napędowym.
Zad. 4: Fitostabilizacja gleb skażonych metalami ciężkimi
Materiały:
- Pojemniki: moczówki
- Węgiel brunatny
- Wapno ogrodowe
- Gleba skażona miedzią
a) węgiel brunatny
Wykonanie:
- glebę skażona miedzią umieścić w 4 pojemnikach po 100 g,
- pojemniki podpisać: K, 1, 2, 3,
- do pojemników dodać węgiel brunatny, w stosunku wagowym, tak aby uzyskać
stężenia:

pojemnik 1: 1%,

pojemnik 2: 5%,
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki

pojemnik 3: 10%,
- we wszystkich pojemnikach K (kontrola), 1, 2 i 3 wysiać po tyle samo ziaren
pszenicy,
b) wapno ogrodowe
Wykonanie:
- glebę skażona miedzią umieścić w 3 pojemnikach po 100 g,
- pojemniki podpisać: 4, 5,
- do pojemników dodać wapno ogrodowe, w stosunku wagowym, tak aby uzyskać
stężenia:

pojemnik 4: 1%,

pojemnik 5: 2%,
- we wszystkich pojemnikach 4 i 5 wysiać po tyle samo ziaren pszenicy,
Po 7 i 14 dniach określić wielkość przyrostu roślin (w pkt a i b) i porównać
względem siebie i próbki kontrolnej. Określić przydatność stosowania wapna
ogrodowego i węgla brunatnego do fitostabilizacji gleb skażonych metalami
ciężkimi.