Wpływ dymu tytoniowego na strukturę nabłonka wielowarstwowego

PRACE ORYGINALNE
Anna BICZYSKO-MURAWA1
Monika SEGET2
Ewa DWOJAK-CIESIELSKA2
Janina STOPA1
Wp³yw dymu tytoniowego na strukturê
nab³onka wielowarstwowego p³askiego jamy
gêbowej u szczurów, badania doœwiadczalne
Tobacco smoke exposure on multistratum epithelium
of rats oral cavity, experimental studies
Klinika Stomatologii Zachowawczej
i Periodontologii
Katedra Stomatologii Zachowawczej
i Periodontologii
Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego
Kierownik: Prof. dr hab. Janina Stopa
1
Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej
Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego
Kierownik: Prof. dr hab. Przemys³aw Majewski
2
Dodatkowe s³owa kluczowe:
dym tytoniowy
nab³onek wielowarstwowy p³aski
szczury
Additional key words:
tobacco smoke
multistratum epithelium
rats
Adres do korespondencji:
Dr med. Anna Biczysko-Murawa
Centrum Klinik Stomatologicznych
Klinika Stomatologii Zachowawczej
60-812 Poznañ, ul. Bukowska 70
Tel. 61 85 70 26
email: [email protected]
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
U czynnych, jak i biernych palaczy
jama ustna ma bezpoœredni kontakt z
dymem tytoniowym. Zbadano wp³yw
dymu tytoniowego w stê¿eniu 1000
mgCO/m3 powietrza w œrodowisku, na
strukturê nab³onka wielowarstwowego p³askiego u szczurów podczas trzytygodniowej ekspozycji. Stwierdzono
zaburzenia struktury nab³onka o charakterze przybytku komórek w warstwach kolczystej, ziarnistej i rogowej
oraz epidermizacjê ujœæ gruczo³owych.
Tobacco smoke has direct influence on oral cavity in passive and active smokers. In this study we used
experimental model to check three
weeks exposure of environmental tobacco smoke 1000mgCO/m 3 on
multistratum epithelium structure in
rats. Morphological evaluation revealed structural changes in form of
increased number of cells in stratum
spinosum, granulosum and corneum,
also epidermisation of mucous glands
exits have been stated.
Wstêp
Zwiêkszaj¹ca siê stale konsumpcja papierosów wœród doros³ych i dzieci zmusza
œrodowisko medyczne do aktywnej walki z
na³ogiem. Komisja Ekspertów Œwiatowej
Organizacji Zdrowia okreœli³a palenie papierosów przez ludzi, jako uzale¿nienie od nikotyny [5]. Palenie tytoniu, jak dowodz¹ badania ostatnich trzydziestu lat, stanowi g³ówny œrodowiskowy czynnik ryzyka dla wielu
schorzeñ, szczególnie uk³adu oddechowego [2] i pokarmowego, w tym chorób nowotworowych [11,30,31]. Od lat trzydziestych
ubieg³ego wieku wiele prac epidemiologicznych [26,27,30] donosi³o o wzroœcie umieralnoœci z powodu raków i równolegle pojawi³y siê obszerne opracowania dotycz¹ce
przyczyn ich powstawania. W 1953 roku
Wynder, Croninger i Graham opublikowali
pierwsze doniesienie o wywo³ywaniu raka
p³askonab³onkowego w naskórku u myszy
przez substancje smoliste z dymu tytoniowego [27].
W dymie papierosowym wystêpuje ponad 4300 substancji powstaj¹cych w œrodowisku bogatym w wodór a ubogim w tlen.
Bior¹c pod uwagê skutki biologiczne najwiêksze znaczenie maj¹: substancje rakotwórcze (inicjatory i promotory takie jak policykliczne wêglowodory aromatyczne, nitrozoaminy, 2-naftylamina, 4-aminodwufenyl,
NNN, arsen, kadm, nikiel, chrom, izotopy
promieniotwórcze), substancje dra¿ni¹ce
(ketony, fenole, cyjanowodór, amoniak), nikotyna, tlenek wêgla [13,16,24].
Tlenek wêgla maj¹c dwustukrotnie wy¿sze powinowactwo do hemu ni¿ tlen, wypiera go z miejsc wi¹zania powoduj¹c niedotlenienie tkanek a nie wp³ywa na ciœnienie parcjalne tlenu [13,21]. Jego dzia³anie
cytotoksyczne jest zale¿ne od stê¿enia i
czasu trwania ekspozycji. Pod wp³ywem
tlenku wêgla dochodzi do znacznego spadku syntezy bia³ek, spadku pH w cytozolu
oraz zmniejszenia iloœci glikogenu w komórkach. Przy d³ugotrwa³ej ekspozycji i przy
znacznym stopniu niedotlenienia przenikanie jonów sodowych, wapniowych oraz wody
ulega zwiêkszeniu, co prowadzi do obrzêku
uk³adu siateczki endoplazmatycznej, potem
ca³ej komórki a na koñcu do jej œmierci.
Nastêpnym bardzo wa¿nym biologicznie sk³adnikiem dymu jest nikotyna. U palaczy g³ówn¹ drog¹ absorbcji nikotyny jest
powierzchnia pêcherzyków p³ucnych i b³ona œluzowa dróg oddechowych. Mo¿e byæ
jednak równie¿ wch³aniana poprzez nab³onek jelita i skórê [28]. Nikotyna ³atwo przechodzi przez œródb³onki do kr¹¿enia i przez
barierê krew-mózg do oœrodkowego uk³adu
nerwowego. W narz¹dach maj¹cych bezpoœredni kontakt z dymem tytoniowym nikotyna powoduje stres oksydacyjny przy
dawce 0,8 µM poprzez gromadzenie wolnych rodników i peroksydacjê lipidów [29].
W badaniach Maneckjee i Minna z 1994
roku ujawniono, ¿e nikotyna mo¿e tak¿e
wp³ywaæ na supresjê apoptozy poprzez wi¹zanie siê do nikotynowego typu receptora
acetylocholinowego [29]. Ta w³asnoœæ nikotyny polegaj¹ca na hamowaniu apoptozy i
stymulacji proliferacji mo¿e byæ argumentem potwierdzaj¹cym kancerogenne dzia³anie nikotyny [28]. Arredondo w badaniach
przeprowadzonych na ludzkich keratynocytach, które posiadaj¹ nikotynowy typ receptora acetycholinowego udowodni³ karcinogenne dzia³anie nikotyny [1]. Podanie nikotyny spowodowa³o podwy¿szenie poziomów
bia³ek markerowych dla cyklu komórkowego i dojrzewania komórkowego: p53 i p21.
Ekspozycja na dym tytoniowy wywo³uje zmiany chorobowe zarówno u czynnych
jak i biernych palaczy (osób nara¿onych na
701
wp³yw dymu tytoniowego w œrodowisku)[3].
Dym papierosowy dociera najpierw do
jamy ustnej wywieraj¹c wp³yw na strukturê
nab³onka.
Najbardziej znan¹ jednostk¹ chorobow¹
zwi¹zan¹ z paleniem jest leukoplakia.
Leukoplakia b³ony œluzowej jamy ustnej
opisana zosta³a przez Schwimmera w 1877
roku, charakteryzuje siê wyst¹pieniem bia³ych p³ytek lub plam nie mniejszych ni¿ 5
mm œrednicy, których nie da siê usun¹æ
przez œcieranie i klinicznie oraz histologicznie odpowiadaj¹ rozpoznaniu leukoplakii
[23]. Leukoplakie reprezentuj¹ 80% zmian
potencjalnie z³oœliwych wystêpuj¹cych w
jamie ustnej [25]. Etiologia zwi¹zana jest
œciœle z paleniem papierosów i ¿aden inny
czynnik etiologiczny podobnie czêsto leukoplakii nie wywo³uje [6,20]. Z badañ populacyjnych wynika i¿ 0,2-0,5 badanych populacji ma zdiagnozowane leukoplakie. Czasami mog¹ byæ dzielone na homogenne (z
g³adk¹ lub pofa³dowan¹ powierzchni¹) i niehomogenne (grudkowa, brodawkowata i nad¿erkowa). Nieleczone zmiany poszerzaj¹
siê, a blaszka w³aœciwa b³ony œluzowej le¿¹ca w obrêbie zmiany ulega pogrubieniu
g³ównie z powodu w³óknienia [9]. Opisane
zmiany w obrêbie nab³onka patolodzy nazywaj¹ keratoz¹. Potencja³ z³oœliwoœci zmiany okreœlany jest na podstawie oceny histologicznej stopnia dysplazji komórek nab³onka. Stopieñ dysplazji opisywany jest jako
ma³y, œredniego stopnia, znaczny, na podstawie wystêpuj¹cych zmian cytologicznych
i architektonicznych nab³onka [7]. U palaczy keratozy mog¹ byæ nazywane zapaleniem nikotynowym b³ony œluzowej (stomatitis nicotinica). W badaniach histologicznych zmiany powstaj¹ wskutek akantozy
nab³onka, to znaczy pogrubienia warstwy
kolczystej z powodu proliferacji komórek
warstwy podstawnej, które tworz¹ g³êbokie
wpuklenia w kierunku b³ony œluzowej w³aœciwej lub skóry w³aœciwej. W zmianach hiperkeratotycznych dochodzi do zwiêkszenia liczby warstw poszczególnych czêœci
nab³onka wielowarstwowego p³askiego,
³¹cznie ze zwiêkszeniem liczby warstw komórek zrogowacia³ych. Jeœli takim zmianom
towarzysz¹ powiêkszenia j¹der, obecnoœæ
aktywnych j¹derek, zaburzenia struktury
cytoplazmy w postaci zmiany iloœci i charakteru w³ókienek poœrednich a w szczególnoœci cytokeratyn, nieprawid³owe formowanie mostków cytoplazmatycznych, po³¹czeñ miêdzykomórkowych i zmiany kohezji, to mo¿emy myœleæ o pocz¹tkach zmian
dysplastycznych poprzedzaj¹cych nowotworzenie [22].
Wiele doœwiadczeñ na zwierzêtach dostarczy³o informacji na temat rodzaju uszkodzeñ powodowanych przez dym tytoniowy.
Celem pracy by³o stwierdzenie wp³ywu
krótkotrwa³ej trzytygodniowej ekspozycji na
dym tytoniowy na strukturê nab³onka wielowarstwowego p³askiego jamy gêbowej u
szczurów.
Materia³ i metody
W badaniach doœwiadczalnych, po uzyskaniu zgody lokalnej komisji bioetycznej nr (6/2005), wykorzystano 20 m³odych, zdrowych samców szczurzych szczepu
Wistar (12 tygodniowych, o wadze oko³o 210 g). Zwierzêta po umieszczeniu w klatkach metabolicznych, eks-
702
Tabela I
Wartoœci œrednie, odchylenie standardowe, min. i max. oraz wynik testu Manna- Withney'a dla poszczególnych
warstw komórkowych nab³onka wielowarstwowego p³askiego jamy gêbowej w grupie badanej i kontrolnej.
Average values, ods ratio, min. and max. and test of Mann-Withney for particular leyers in multistratum epithelium of
oral cavity in rats exposed to tobacco smoke and control group.
N
ŒR ED N I A
ODCH.STAND.
M IN
M AX
WARSTWA
KOLCZYSTA
GRUPA BADANA
540
3,74
0,95
2,00
7,00
GRUPA KONTROLNA
90
3,41
0,65
2,00
5,00
WARSTWA
ZIARNISTA
GRUPA BADANA
540
4,36
1,38
2,00
10,00
GRUPA KONTROLNA
90
3,52
0,71
2,00
5,00
WARSTWA
ROGOWA
GRUPA BADANA
540
4,66
1,46
1,00
8,00
GRUPA KONTROLNA
90
2,03
0,18
2,00
3,00
p TE S TU
0,0004
0,0001
0,0001
Rycina 1
Porównanie œredniej liczby warstw komórkowych w warstwie kolczystej nab³onka grupy kontrolnej i
badanej.
A comparison of average number of cell leyers in stratum spinosum in epithelium of rats exposed to tobacco smoke
and control group.
Rycina 2
Porównanie œredniej liczby warstw komórkowych w warstwie ziarnistej grupy kontrolnej i badanej.
A comparison of average number of cell leyers in stratum granulosum in epithelium of rats exposed to tobacco
smoke and control group.
ponowano na dym tytoniowy w stê¿eniu 1000 mg CO/
m3 powietrza przez 8 godzin dziennie, 5 dni w tygodniu,
przez 3 tygodnie. W czasie ca³ego badania zachowano
prawid³owe stê¿enie tlenu w powietrzu. Po zakoñczeniu czêœci doœwiadczalnej, wykonano znieczulenie poprzez podanie domiêœniowe ksylazyny z ketamin¹ w
dawce 40 mg/kg m.c +5 mg /kg m.c. i pobierano do ba-
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
dañ wycinki b³ony œluzowej policzków od jamy gêbowej
do nosogardzieli. Materia³u kontrolnego, który stanowi³y
4 samce szczurze o odpowiadaj¹cych grupie badanej
parametrach wiekowych i wagowych, nie poddano ekspozycji na dym tytoniowy.
Ca³y materia³ zosta³ utrwalony w sposób standardowy i zabezpieczony do dalszych badañ histologicz-
A. Biczysko-Murawa i wsp.
Rycina 3
Porównanie œredniej liczby warstw komórkowych w warstwie rogowej grupy kontrolnej i badanej.
A comparison of average number of cell leyers in stratum corneum in epithelium of rats exposed to tobacco smoke
and control group.
nych. Preparaty do badañ œwietlno-mikroskopowych zatopione zosta³y w parafinie. Dla otrzymania prawid³owej
p³aszczyzny skrawania badanych tkanek, wycinki tkankowe by³y orientowane prostopadle i równolegle do powierzchni bloczka parafinowego, co pozwoli³o na systematyczn¹ ocenê liczby warstw i wielkoœci komórek w
poszczególnych warstwach nab³onków. Preparaty barwione standartowo H+E oceniano w powiêkszeniu 60 x
(Olymphus CH-1) i sporz¹dzono dokumentacjê w postaci zdjêæ.
Poddano analizie liczbê warstw komórkowych w
poszczególnych warstwach nab³onka wielowarstwowego p³askiego. W preparatach pó³cienkich u ka¿dego
szczura poddanego eksperymentowi naliczono liczbê
warstw komórkowych w poszczególnych warstwach nab³onka w 1 miejscu (wybranym jako prawid³owy poprzeczny przekrój nab³onka) na 30 ró¿nych fotografiach
cyfrowych, wykonanych w powiêkszeniu 60 x. Warstwê podstawn¹, le¿¹c¹ na b³onie podstawnej ³atwo da³o
siê rozpoznaæ, warstwa kolczysta charakteryzowa³a siê
ciemniejsz¹ cytoplazm¹, natomiast warstwa ziarnista posiada³a ciemnobarwliwe ziarnistoœci, odró¿niaj¹ce j¹ od
warstwy le¿¹cej poni¿ej, warstwa rogowa wyraŸnie oddzielaj¹ca siê od pozosta³ych znajdowa³a siê na wolnej
powierzchni nab³onka.
Materia³ do badañ ultrastrukturalnych zosta³ zatopiony w ¿ywicy epoksydowej Epon 812, przygotowane
skrawki by³y oceniane i fotografowane w kolumnie transmisyjnego mikroskopu elektronowego ZEISS EM 100.
W nab³onku wielowarstwowym p³askim jamy gêbowej
oceniono jakoœæ po³¹czeñ miêdzykomórkowych, keratynizacjê nab³onka oraz strukturê blaszki w³aœciwej b³ony œluzowej.
Fotografia 1
Mikrografia przedstawia epidermizacjê ujœæ
gruczo³ów œluzowych b³ony œluzowej policzka u
zwierzêcia poddanego inhalacji dymem tytoniowym.
Preparat barwiony H+E; pow.60x
Photo shows changes in structure of multistratum
epithelium of animal exposed to tobacco smoke:
epidermisation of exits of mucous glands are shown.
Magnification 60x; H+E stained material.
Fotografia 2
Fragment nab³onka wielowarstwowego p³askiego
policzka zwierzêcia doœwiadczalnego. Wewn¹trz
nab³onkowo obecna per³a rogowa. Preparat
barwiony H+E; pow .60x
Photo shows change in structure of multistratum
epithelium of rat exposed to tobacco smoke: keratin pearl
exists within the multistratum epithelium. Magnification
60x; H+E stained material.
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
703
Wyniki
Badania œwietlnomikroskopowe:
Nab³onek wielowarstwowy p³aski jamy
gêbowej u szczurów poddanych doœwiadczeniu jak i kontrolnych ró¿ni³ siê zasadniczo gruboœci¹, zale¿nie od topografii i funkcji jak¹ pe³ni w trakcie prze¿uwania pokarmów. W obrêbie policzków by³ nab³onkiem
wielowarstwowym p³askim rogowaciej¹cym,
wyraŸnie grubszym z wiêksz¹ iloœci¹ warstw
komórek w poszczególnych warstwach. Œledz¹c ten nab³onek w kierunku nosogardzieli,
krtani i tchawicy liczba warstw kolczystych,
ziarnistych oraz rogowych ulega³a redukcji,
a ca³y nab³onek zcieñczeniu. W obszarze
poni¿ej chrz¹stki nalewkowatej krtani nab³onek wielowarstwowy p³aski przechodzi³ w
cylindryczny, gruczo³owy. W celu uzyskania
prawid³owej oceny porównawczej nab³onków wielowarstwowych p³askich w czêœci
¿uj¹cej policzków u zwierz¹t kontrolnych i
poddanych wp³ywowi dymu wykonano zliczenia warstw komórkowych w ka¿dej z
wy¿ej wymienionych warstw nab³onka u ka¿dego zwierzêcia. W materiale doœwiadczalnym stwierdzono, i¿ w obrêbie policzków w
warstwie kolczystej wystêpowa³o wiêcej
warstw (œrednia wartoœæ w grupie badanej
3,74±0.95; w grupie kontrolnej 3,41±0,65
tabela I, rycina 1) oraz pojawi³o siê wiêcej
warstw ziarnistych (œrednia wartoœæ w grupie badanej 4,36±1,38; w grupie kontrolnej
3,52±0,71 tabela I, rycina 2 ). Warstwa rogowa by³a znacznie grubsza w materiale
doœwiadczalnym i sk³ada³a siê od 1 do 8
warstw ca³kowicie zkeratynizowanych komórek, pozbawionych j¹der, pouk³adanych
typowo jedne nad drugimi (wartoœci œrednie w grupie badanej 4,66±1,46; w grupie
kontrolnej 2,03±0,18, tabela I, rycina 3). Porównania ocenione testem Withney'a Manna wyra¿aj¹ znamiennoœæ statystyczn¹ wyników: dla warstwy kolczystej p=0,0004, dla
warstwy ziarnistej p=0,0001 i dla warstwy
rogowej p= 0,0001 (tabela I). Histogramy
zestawiaj¹ce liczby warstw komórkowych w
kolejnych warstwach nab³onka wielowarstwowego p³askiego, odzwierciedlaj¹ najwiêksze ró¿nice w obrêbie warstwy ziarnistej
i rogowej pomiêdzy grup¹ kontroln¹ a grup¹
badan¹ (rycina 2 i rycina 3).
Nab³onek wielowarstwowy p³aski rogowaciej¹cy u zwierz¹t doœwiadczalnych wystêpowa³ równie¿ w ujœciach gruczo³ów œluzowych (fotografia 1).
W nab³onku policzków wystêpowa³y
ogniskowo per³y rogowe (fotografia 2).
Warstwa podstawna nab³onka zwierz¹t
poddanych doœwiadczeniu le¿a³a na b³onie
podstawnej, która tworzy³a nieregularne,
ró¿nie g³êbokie (od p³ytkich do g³êbokich),
papilarne wpuklenia blaszki w³aœciwej b³ony œluzowej w kierunku nab³onka. B³ona
podstawna mia³a niejednakow¹ gruboœæ a
ogniskowo dochodzi³o do przerwania jej ci¹g³oœci (fot. 3).
Tak¿e nieregularnie wystêpowa³y w niej
mierne lub wyraŸne pogrubienia a tylko sporadycznie b³ona podstawna sk³ada³a siê z
kilku warstw.
Badania ultrastrukturalne:
Badania mikroskopowo-elektronowe w
pe³ni potwierdzi³y zmiany zaobserwowane
badaniem œwietlno-mikroskopowym. Nab³o704
Fot. 3 Fragment nab³onka wielowarstwowego p³askiego i b³ony œluzowej w³aœciwej. W czêœci centralnej
fotografii widoczny ubytek b³ony podstawnej (strza³ka). Jedna z komórek warstwy podstawnej jest w trakcie
mitozy. J¹dra komórkowe pozosta³ych komórek nab³onka zawieraj¹ euchromatynê i powiêkszone aktywne
j¹derka. Preparat ME pow. 8750x
Photo shows part of mucousa covered by multistratum epithelium of animal exposed to tobacco smoke. In central part
of picture one basal cell is in mitosis. All other epithelial cells have nuclei of irregular shape with fully euchromatinised
chromatine and enlarged active nucleoi. Basement membrane is thin and focally disrubted (arrow). ElMi 8750x
nek wielowarstwowy p³aski jamy gêbowej
zwierz¹t poddanych dzia³aniu dymu tytoniowego by³ wyraŸniej grubszy ni¿ nab³onek
zwierz¹t kontrolnych. Tak jak opisano powy¿ej najgrubszy by³ w czêœci ¿uj¹cej policzków, z najwiêksz¹ iloœci¹ warstw komórek kolczystych, ziarnistych i rogowych (Tabela I). Warstwy komórkowe ulega³y stopniowej redukcji w kierunku tylnym. W rejonie tylnym jamy gêbowej i w obrêbie nosogardzieli w wyniku stopniowej redukcji
warstw, zmniejszeniu ulega³a wysokoœæ nab³onka wielowarstwowego p³askiego rogowaciej¹cego. Stale utrzymywa³a siê warstwa
rogowa a¿ do obszaru krtani, przy czym ulega³a zmniejszeniu liczba warstw komórek
zrogowacia³ych do 2 lub 3 warstw.
Warstwa podstawna nab³onka
Dolny biegun komórek warstwy podstawnej nab³onka u zwierz¹t poddanych
doœwiadczeniu nie odbiega³ od normy, przylega³ do blaszki w³aœciwej b³ony œluzowej
(Fot.3), le¿a³ na b³onie podstawnej, posiada³ liczne, rytmicznie i prawid³owo rozmieszczone pó³desmosomy, przytwierdzaj¹ce komórki do b³ony podstawnej (fot. 3). Struktura pó³desmosomów by³a prawid³owa (fot. 3).
W materiale pobranym od zwierz¹t doœwiadczalnych w³ókienka cytokeratyn w
cytoplazmie by³y miernie liczne i tylko ogniskowo formowa³y pêczki. J¹dra komórkowe zajmowa³y stosunkowo du¿y obszar cytoplazmy, mia³y nieregularn¹, nieznacznie
pofa³dowan¹ otoczkê i by³y euchromatynowe, nieomal ca³kowicie pozbawione heterochromatyny. W j¹drach znajdowano du¿e
aktywne j¹derka, czêsto podwójne oraz liczniejsze w porównaniu do grupy kontrolnej
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
ziarnistoœci perichromatynowe. Aktywne j¹derka mia³y wyraŸnie przemieszane elementy
fibrylarne i ziarniste bez cech segregacji (fot.
3). W ca³ym badanym materiale wœród komórek warstwy podstawnej, znaleziono kilka komórek w podziale mitotycznym (fotografia 3).
Warstwa komórek kolczystych
nab³onka
W ca³ym badanym materiale pobranym
od zwierz¹t poddanych dzia³aniu dymu liczba warstw komórek kolczystych uleg³a
zwiêkszeniu w stosunku do normy. Najliczniej wystêpowa³y warstwy komórek kolczystych w obrêbie policzków w czêœci ¿uj¹cej, œrednio 3,74 warstwy (tabela I). WyraŸnie mniejsza liczba warstw komórek warstwy kolczystej by³a widoczna w obszarze
nosogardzieli. G³ówna ró¿nica pomiêdzy
materia³em uzyskanym od zwierz¹t poddanych doœwiadczeniu a materia³em od zwierz¹t kontrolnych dotyczy³a liczby w³ókienek
cytokeratyn w kolejnych warstwach. Równolegle do przesuwania siê komórek kolczystych w warstwach, zwiêksza³a siê liczba
cytokeratyn. U zwierz¹t poddanych dzia³aniu dymu pojawia³y siê tak¿e bardzo gêste
zespo³y- pêczki w³ókienek cytokeratyn.
Warstwa komórek ziarnistych nab³onka
Warstwa ziarnista u zwierz¹t poddanych
dzia³aniu dymu mia³a tak¿e w porównaniu
do materia³u kontrolnego wiêcej warstw komórkowych od 2 do 10 (tabela I). Najmniejsz¹ liczbê warstw obserwowano w czêœci
b³ony œluzowej nosogardzieli, le¿¹cej nad
krtani¹. W koñcowych odcinkach b³ony œluzowej przylegaj¹cych do krtani warstwa ta
by³a jednokomórkowa. Budowa komórek nie
ró¿ni³a siê u zwierz¹t poddanych dzia³aniu
A. Biczysko-Murawa i wsp.
dymu w porównaniu do zwierz¹t kontrolnych.
Warstwa komórek rogowych nab³onka
Ponad warstw¹ ziarnist¹ wystêpowa³a
warstwa rogowa, która w grupie kontrolnej
mia³a ró¿n¹ wysokoœæ od 2 do 3 warstw
komórek (tabela I). WyraŸnie wiêcej warstw
od 1 do 8 komórek warstwy rogowej obserwowano u zwierz¹t doœwiadczalnych (tabela
I). Nale¿y podkreœliæ, i¿ w odcinkach, w których nab³onek tworzy³ brodawkowate uwypuklenia do blaszki w³aœciwej b³ony œluzowej liczba warstw komórek zrogowacia³ych
by³a wiêksza. W obszarze warstwy rogowej
nab³onka czêœci ¿uj¹cej policzków u zwierz¹t poddanych ekspozycji na dym tytoniowy znajdowano pojedyncze per³y rogowe,
siêgaj¹ce a¿ do warstwy kolczystej (fot. 2).
Tak¿e ogniskowo na d³ugich wielokomórkowych odcinkach, wystêpowa³o rozwarstwianie komórek warstwy rogowej, czasami siêgaj¹ce g³êboko do warstwy ziarnistej, powoduj¹c oddzielenie warstwy ziarnistej od
kolczystej. W ujœciach gruczo³ów œluzowych
warstwa rogowa by³a podobnej gruboœci jak
na powierzchni nab³onka, liczy³a od 2 do 3
szeregów p³ytek rogowych. Komórki tej warstwy ró¿ni³y siê miêdzy sob¹ gêstoœci¹ cytoplazmy co czêsto odzwierciedla³o upakowanie pêczkami cytokeratyn. Znajdowano
komórki, które mia³y cytoplazmê ogniskowo
przeziern¹ i z ma³¹ iloœci¹ cytokeratyn oraz
komórki ca³kowicie upakowane cytokeratynami. W warstwie rogowej najczêœciej wystêpowa³y komórki pozbawione j¹der.
B³ona œluzowa blaszka w³aœciwa
Naczynia w³osowate b³ony œluzowej w³aœciwej zarówno u zwierz¹t doœwiadczalnych
jak i kontrolnych mia³y szerokie œwiat³a a
œródb³onek czêsto by³ miernie wysoki z nielicznymi organellami i doœæ gêst¹ cytoplazm¹. Mitochondria wielu komórek œródb³onka u zwierz¹t poddanych dzia³aniu dymu
mia³y gêst¹ macierz i krótkie grzebienie. W
licznych przekrojach naczyñ w komórkach
œródb³onka obserwowano pêcherzyki mikropinocytarne. Komórki œródb³onka le¿a³y na
cienkich b³onach podstawnych. W materiale
pobranym od zwierz¹t poddanych ekspozycji na dym tytoniowy znajdowano pojedyncze komórki szeregu bia³okrwinkowego, w
tym limfocyty, monocyty, komórki tuczne i
komórki plazmatyczne w œwietle naczyñ i w
przestrzeniach oko³onaczyniowych. W macierzy pozakomórkowej znajdowano nieliczne fibrocyty, fibroblasty, komórki tuczne, w³ókienka kolagenu pojedyncze lub w pêczkach
oraz sieæ w³ókien elastycznych. W materiale doœwiadczalnym blaszka w³aœciwa zawiera³a wyraŸnie wiêcej w³ókienek kolagenu w
pêczkach, obecnego szczególnie licznie za
b³on¹ podstawn¹. W ocenionym materiale
znajdowano tak¿e odcinki b³ony œluzowej z
fragmentami uszkodzonych w³ókien elastycznych.
B³ona podœluzowa
Utworzona by³a przez tkankê ³¹czn¹ z
licznymi w³ókienkami kolagenu, ³¹cz¹cymi
siê œciœle z le¿¹cymi poni¿ej w³ókienkami
tkanki ³¹cznej otaczaj¹cej miêœnie poprzecznie pr¹¿kowane policzków i nosogardzieli.
Dyskusja
Nowotworzenie jest procesem wieloetapowym, wiele aspektów tego procesu naPrzegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
dal pozostaje niewyjaœnionych. St¹d podejmowanie prac maj¹cych na celu wyjaœnienie patogenezy i biologii procesów przednowotworowych jest w pe³ni uzasadnione. W
przeprowadzonym doœwiadczeniu zmiany w
b³onie œluzowej policzków u zwierz¹t poddanych inhalacji dymem tytoniowym mo¿na
sklasyfikowaæ na podstawie ich obrazu mikroskopowego do grupy hiperkeratoz i leukoplakii oraz leukoplakii w czêœci nale¿¹cej
do nosogardzieli. Leukoplakia, czyli rogowacenie bia³e jest najczêœciej stosowanym terminem klinicznym, okreœlaj¹cym przedz³oœliw¹ lub potencjalnie z³oœliw¹ zmianê w jamie
ustnej. W patologii cz³owieka d³uga lista stanów chorobowych, nale¿¹cych do grupy leukoplakii, zawiera w nazwie tak¿e czynnik
etiopatologiczny, nale¿¹ tutaj: keratozy zwi¹zane z paleniem papierosów, leukoplakia
idiopatyczna, leukoplakia ki³owa, przewlek³a
przerostowa kandydoza, leukoplakia w³ochata, zmiany powstaj¹ce w wyniku œcierania,
dra¿nienia, nagryzania. Zmiany indukowane dymem tytoniowym nazywane s¹ w Polsce zapaleniem nikotynowym (stomatitis nicotinica), podniebieniem palaczy albo
uszkodzeniem podniebienia wystêpuj¹cym
u tych, którzy rzucili palenie [25]. Keratozy u
palaczy papierosów wystêpuj¹ na podniebieniu twardym i miêkkim, a tak¿e na b³onie œluzowej policzków. W badaniu histologicznym
tych stanów dominuje obraz nadmiernego rogowacenia, ze zwiêkszeniem liczby warstw
nab³onka i najczêœciej bez cech dysplazji w
nab³onku [23]. Ze wzglêdu na to, ¿e leukoplakie wywo³ywane s¹ przez wiele ró¿norodnych czynników ocena kliniczna stopnia zaawansowania leukoplakii bierze pod uwagê
jej charakter (homogenny lub niehomogenny). Stopniowanie zmian mo¿na przedstawiæ nastêpuj¹co: stopieñ 1 to zmêtnienie nab³onka; stopieñ 2 to bia³a opalizuj¹ca plama
nieznacznie wynios³a ponad poziom b³ony
œluzowej z obecnoœci¹ bruzd, które s¹ makroskopowo niezmienionymi pasmami nab³onka; stopieñ 3 zawiera wyraŸnie wy¿sze
ponad powierzchnie nab³onka tarczki o chropowatej powierzchni, twarde z r¹bkiem zapalnym otaczaj¹cym zmianê i naciekaj¹cym
b³onê œluzow¹; w tym stopniu zmian mog¹
pojawiaæ siê nad¿erki i owrzodzenia; stopieñ
4 okreœlany jest na podstawie obecnoœci brodawkowatych rozrostów wystaj¹cych ponad
powierzchniê b³ony œluzowej z r¹bkiem zapalnym naciekaj¹cym b³on¹ œluzow¹ [23]. W
badaniach histologicznych leukoplakii dominuj¹ cechy hiperkeratozy z ró¿nie du¿ym
przybytkiem komórek w kolejnych warstwach
nab³onka. Mo¿e temu towarzyszyæ odczyn
zapalny lub obecnoœæ dysplazji, której wyst¹pienie, wi¹¿e siê z wiêkszym ryzykiem nowotworzenia. Uzyskane w przeprowadzonym doœwiadczeniu wyniki, w tym szczególnie ich ocena mikroskopowo-elektronowa,
ujawni³y ró¿nice w budowie j¹der komórkowych, warstwy podstawnej, kolczystej, a¿ po
ziarnist¹. W ca³ym materiale poddanym inhalacji dymem tytoniowym znajdowano zespo³y komórek, w których j¹dra by³y g³ównie
euchromatynowe z niewielk¹ iloœci¹ heterochromatyny umieszczonej podotoczkowo lub
j¹dra zawieraj¹ce tylko euchromatynê. W
warstwie podstawnej 3 krotnie znaleziono
komórki w trakcie podzia³u mitotycznego.
Pozosta³e komórki tej warstwy o euchroma-
tynowych j¹drach mia³y powiêkszone, aktywne i w czêœci komórek mnogie j¹derka.
Chromatyna j¹drowa zosta³a okreœlona w
piœmiennictwie, jako „DNA, któremu towarzysz¹ histonowe i niehistonowe nukleoproteiny”, co mo¿na uwidoczniæ odpowiednim
barwieniem [2]. Wiêkszoœæ j¹drowego DNA
jest nieaktywna( 90% w komórkach w fazie
G0). Chromatyna j¹der komórkowych wystêpuje w trzech umiejscowieniach: jako
czêœæ le¿¹ca w najbli¿szym s¹siedztwie
otoczki j¹drowej w postaci ró¿nie szerokiego pasa heterochromatyny o nieostrym
obrysie, która jest transkrypcyjnie nieaktywna; jako nieregularne zgrupowania chromatyny rozproszone w macierzy j¹drowej, w
regionach euchromatyny, która jest transkrypcyjnie aktywna; i jako chromatyna towarzysz¹ca j¹derkom [17]. Ta ostatnia postaæ chromatyny reprezentuje regiony organizatorów j¹derkowych i zawiera genetyczne miejsca, na których odbywaj¹ siê
syntezy rybosomalnego RNA . Jeœli j¹derka ulegaj¹ powiêkszeniu, to w ich obszarze
mo¿na wyró¿niæ gêste, fibrylarne struktury,
le¿¹ce wokó³ fibrylarnych centrów oraz
struktury ziarniste. WyraŸne przemieszanie
wszystkich sk³adników j¹derkowych, otoczonych organizatorami j¹derkowymi
œwiadczy o aktywacji syntez materia³u genetycznego [2,17]. W przeprowadzonym
doœwiadczeniu obok powiêkszenia i euchromatynizacji j¹der, w tych samych j¹drach znajdowano liczne powiêkszone j¹derka. Aktywowane j¹dra mia³y charakter
euchromatynowy, gdzie chromatyna by³a
rozproszona na ca³ym obszarze j¹der i nie
tworzy³a agregatów heterochromatyny. Nie
mo¿na jednoznacznie okreœliæ uk³adu przyczyn dla opisanego stanu aktywacji j¹der i
j¹derek, na podstawie obrazu ich ultrastruktury. W t³umaczeniu opisanego wy¿ej obrazu j¹der mo¿na braæ pod uwagê kilka
zmian w komórkach. Na pierwszym miejscu nale¿y wymieniæ przejœcie komórki z
fazy Go do fazy G1 lub wejœcie do fazy S
cyklu komórkowego. W obu tych fazach j¹dra komórkowe s¹ euchromatynowe i maj¹
powiêkszone aktywne j¹derka. W zebranym
materiale znaleziono kilka komórek warstwy
podstawnej w trakcie mitozy. Jest prawdopodobne, i¿ pozosta³e komórki mog¹ tak¿e
byæ komórkami, które wesz³y do cyklu podzia³owego.
Inne wyt³umaczenie dla stanu aktywacji j¹der i j¹derek bêdzie wi¹za³o siê z bezpoœrednim wp³ywem nikotyny na keratynocyty jamy gêbowej. Produkty zawieraj¹ce
nikotynê powstaj¹ z liœci tytoniu i s¹ u¿ywane najczêœciej poprzez palenie, jako proszki do inhalacji lub substancje do ¿ucia. W
kontakcie z nab³onkiem wielowarstwowym
p³askim wywo³uj¹ przerost nab³onka i nadmierne rogowacenie. Z badañ Grando [12]
i Nguyen [18,19] wynika i¿ keratynocyty nab³onków pokrywaj¹cych jamê ustn¹ i prze³yk posiadaj¹ dwie klasy receptorów acetylocholinowych: nikotynowy i muskarynowy.
Bezpoœredni wp³yw nikotyny na keratynocyty mo¿liwy jest, poprzez receptory nikotynowe acetylocholinergiczne (nACHRs),
wystêpuj¹ce w dwu postaciach (heteromerycznej i homomerycznej) tworz¹cych kana³y w b³onie komórkowej keratynocytów
jamy ustnej [10]. Ró¿norodnoœæ nikotyno705
wych receptorów acetylocholinowych w keratynocytach wp³ywa na szereg procesów
zachodz¹cych w tych komórkach. Nikotynowe acetylocholinergiczne receptory (nACHRs) opisane przez Grando w 1997 [12]
by³y pierwszymi nieneuronalnymi receptorami cholinergicznymi odkrytymi w komórkach nab³onka. To odkrycie ma istotne znaczenie dla rozumienia bezpoœredniego wp³ywu nikotyny na zachowanie siê kertynocytów. Heeschen i wsp. [14] wykazali bezpoœredni wp³yw nikotyny na komórkowy wzrost,
ruchliwoœæ i ró¿nicowanie. Chen i wspó³. [8]
w badaniach doœwiadczalnych na œwinkach
morskich wykazali istotn¹ rolê nikotyny ³¹cznie z niedotlenieniem na indukowanie procesów kancerogenezy. Z badañ Arredondo
i wsp. z 2001 roku [1] wynika, i¿ nikotyna
zmienia liczbê nACHRs keratynocytów jamy
ustnej i wp³ywa na kinetykê tych komórek
[1]. Autorzy ci ujawnili w doœwiadczeniu na
hodowanych keratynocytach, i¿ nikotyna wywo³uje zwiêkszenie iloœæi nACHRs w b³onach keratynocytów jamy ustnej oraz zmianê w budowie podjednostek sk³adaj¹cych
siê na receptor. Nikotyna zwiêksza iloœæ
mRNa dla wszystkich podjednostek buduj¹cych receptor a dla dwu z nich zwiêksza
nieomal 3 krotnie iloϾ mRNA, co kolejno
wp³ywa na zmianê struktury samego receptora. Zmiana nACHRs mo¿e wp³ywaæ na
¿yciowe funkcje keratynocytów. Uzyskane
przez tych autorów wyniki sugeruj¹, i¿ nikotynowe receptory cholinergiczne i zwiêkszenie ich liczby pod wp³ywem nikotyny,
maj¹ wp³yw dodatni wobec procesów keratynizacji nab³onka. Autorzy zademonstrowali
po raz pierwszy, i¿ stymulacja keratynocytów jamy ustnej przez nikotynê zmienia genetycznie determinowany program komórek, w sposób zale¿ny od ekspresji podjednostek nikotynowych receptorów cholinergicznych. Ten proces zwi¹zany jest równie¿
ze zmian¹ ekspresji genów cyklu komórkowego, co prowadzi do dynamicznych zmian
pomiêdzy wzrostem komórek i ich dojrzewaniem. Wywo³uj¹c wczeœnie znaczne rogowacenie nab³onków jamy gêbowej autorzy ci równie¿ dowiedli, i¿ budowa receptorów nikotynowych cholinergicznych u palaczy w porównaniu do niepal¹cych jest zdecydowanie ró¿na. Z badañ w³asnych wynika i¿ przebudowa nab³onka wielowarstwowego p³askiego u szczurów w kierunku przerostu i nadmiernej keratynizacji, mo¿e byæ
w pe³ni zrozumia³a w oparciu o wy¿ej cytowane badania. Zalet¹ wykonanych badañ
706
w³asnych jest szczegó³owe przeœledzenie
postêpuj¹cych zmian morfologicznych, tak
w oparciu o badania œwietlno jak i elektronowo-mikroskopowe. Przeprowadzone badania udowodni³y równie¿, i¿ zastosowana
dawka dymu tytoniowego (trzytygodniowa
ekspozycja na dym tytoniowy w dawce
1000mg CO/m3 powietrza), doprowadzi³a do
epidermizacji i nadmiernego rogowacenia
ujœæ gruczo³ów b³ony œluzowej jamy gêbowej i nosogardzieli.
Wniosek
Inhalacja dymem tytoniowym w nab³onku wielowarstwowym p³askim na ca³ej jego
powierzchni wyœcie³aj¹cej jamê gêbow¹ i
nosogardziel, wywo³uje jego przerost i nadmierne rogowacenie ³¹cznie z epidermizacj¹ ujœæ gruczo³owych b³ony œluzowej.
Piœmiennictwo
1. Arredondo J., Nguyen V.T., Chernyavsky A.I. et
al.: A receptor-mediated mechanisms of nicotine toxicity in oral keratinocytes. Lab Invest 2001, 81, 1653.
2. Azar H.A.: Attributes of neoplasms: ultrastructural and
functional considerations. Pathology of human neoplasms. Raven Press 1988, 1.
3. Barker E., Haverson A., Stokes C.R. et al.: The
larynx as an immunological organ: immunological
architecture in the pig as a large animal model. Clin.
Exp. Immunol. 2006, 143, 6.
4. Barnes P.J.: Chronic obstructive pulmonary disease.
N. Engl. J. Med. 2000, 343, 269.
5. Benowitz N.L.: Pharmacologic aspects of cigarette
smoking and nicotine addiction. Drug Therapy 1988,
319, 1318.
6. Bielecki M., M³ynarczyk W.: Metaplazja p³askonab³onkowa w drogach oddechowych u chorych na
przewlek³e zapalenie oskrzeli. Pneumonol. i Alergol.
Pol. 1996, 64, 842.
7. Bouquot J.E., Speight P.M., Farthing P.M.: Epithelial dysplasia of the oral mucosa - diagnostic problems and prognostic features. Curr. Diag. Pathology
2006, 12, 11.
8. Chen Y.P., Johnson G.K., Squier C.A.: Effects of
nicotine and tobacco-specific nitrosoamines on hamster cheek pouch and gastric mucosa. J. Oral. Pathol.
Med. 1994, 23, 251.
9. Chiang C.P., Lang M.J., Liu J.T. et al.: Expression
of p 53 protein in oral submucous fibrosis, oral epithelial hyperkeratosis and oral epithelial hyperkeratosis and oral epithelial dysplasia. J. Formos Med.
Assoc. 2000, 99, 229.
10. Conti-Tronconi B.M., McLane K.E., Raftery M.A.
et al.: The nicotinic acetylcholine receptor: structure
and autoimmune pathology. Crit. Rev. Biochem. Mol.
Biol. 1994, 29, 69.
11. Florek E.: Toksyczny wp³yw dymu tytoniowego i diety
na p³odnoœæ, zdolnoœæ rozrodcz¹ i potomstwo w
badaniach eksperymentalnych. Rozprawa habilitacyjna Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego Poznañ 1995.
12. Grando S.A.: Biological functions of keratinocyte
Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10
cholinergic receptors. J. Invest. Dermatol. Symp.
Proc. 1997, 2, 41.
13. Green C.R., Rodgman A.: The Tobacco Chemists'
Research Conference: a half century forum for advances in analytical methodology of tobacco and its
products. Recent Adv. Tobacco Sci. 1996, 22, 131.
14. Heeschen C., Jang J.J., Weis M.: Nicotine stimulates angiogenesis and promotes tumor growth and
atherosclerosis. Nat. Med., 2001, 7, 833.
15. Hutchison S.J., Glantz S.A., Zhu B.-Q. et al.: InUtero and neonatal exposure to secondhand smoke
causes vascular dysfunction in newborn rats. JACC
1998, 32, 5, 1463.
16. IARC Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans. Tobacco Smoking vol. 38. International Agency for Research on
Cancer Lyon 1986, 83.
17. Kirszenbaum A.L.: Histology and cell biology. An
introduction to pathology. Mosby 2002, 53.
18. Nguyen V.T., Hall L.L., Gallacher G.: Choline
acetylotransferase, acetylcholinesterase, and nicotinic acetylocholine receptors of human gingival and
esophageal epithelia. J. Dent. Res., 2000 a, 79, 939.
19. Nguyen V.T., Ndoye A., Grando S.A.: Novel human ? 9 acetylcholine receptor regulating keratinocyte adhesion is targeted by pemphigus vulgaris
autoimmunity. Am. J. Pathol., 2000 b, 157, 1377.
20. Paterson I.C., Eveson J.W., Prime S.S.: Molecular
changes in oral cancer may reflect aetiology and ethnic origin. Oral Oncol. Eur. J. Cancer 1996, 32 B,
150.
21. Roughton F.J., Darling R.C.: The effect of carbon
monoxide on the oxyhemoglobin dissociation curve.
Am. J. Physiol., 1944, 141, 17.
22. Sawhney M., Rohatgi N., Kaur J. et al.: MGMT
expression in oral precancerous and cancerous lesions: correlation with progression, nodal metastasis and poor prognosis. Oral Oncology 2007, 43, 515.
23. Sieñko E.: Leukoplakia - stan przednowotworowy
b³ony œluzowej jamy ustnej. Onkol. Pol. 1992, 2, 1.
24. Topping D.C., Pal B.C., Martin D.H. et al.: Pathologic
changes induced in respiratory tract mucosa by polycyclic hydrocarbons of differing carcinogenic activity. Am. J. Pathol. 1978, 93, 311.
25. Van der Waal I., Schepman K.P., van der Meij E.H.,
Smeele L.E.: Oral leukoplakia: a clinicopathological review. Oral Oncol. 1997, 33, 21.
26. Wingo P.A., Giovino G.A., Miler D.S., et al.: Annual report to the nation on the status of cancer 19731996, with special section on lung cancer and tobacco smoking. J. Natl. Cancer Inst. 1999, 91, 675.
27. Wynder E.L., Graham E.A., Croninger A.B.: Experimental production of carcinoma with cigarette tar.
Cancer Res. 1953, 13, 855.
28. Yildiz D., Ercal N., Armstrong D.W.: Nicotine
enantiomers and oxidative stress. Toxicology 1998,
130, 155.
29. Yildiz D.: Nicotine, its metabolism and an overview
of its biological effects. Toxicon, 2004, 43, 619.
30. Zatoñski W.: Europejski kodeks walki z rakiem. Med.
Prakt. 2007.
31. Zanetti F., Gambi A., Bergamaschi A. et al.: Smoking habits, exposure to passive smoking and attitudes
to a non - smoking policy among hospital Staff. Public
Health, 1998, 112, 57.
A. Biczysko-Murawa i wsp.