Autoreferat rozprawy doktorskiej

INSTYTUT BADAWCZY LEŚNICTWA
Elżbieta Chomicz
Zmienność genetyczna
odnowień naturalnych świerka
(Picea abies (L.) Karst.)
w zamierających drzewostanach
Beskidu Śląskiego i Żywieckiego
Autoreferat rozprawy doktorskiej
Promotor:
Dr hab. Justyna Nowakowska, Prof. IBL
Recenzenci: Prof. dr hab. Wiesław Prus-Głowacki
Prof. dr hab. Tomasz Wodzicki
SĘKOCIN STARY 2013
1. WSTĘP
Naczelnym celem gospodarki nasiennej w Lasach Państwowych jest dążenie do
zachowania naturalnego bogactwa lasu na poziomie ekosystemowym, gatunkowym i
genetycznym (Zasady Hodowli Lasu, 2011). Podstawą różnorodności biologicznej na
wszystkich wymienionych poziomach organizacji przyrody jest różnorodność
genetyczna. W populacjach drzew leśnych, wysoki stopień zmienności genetycznej
oznacza większe możliwości ich adaptacji do zmieniających się warunków środowiska
przyrodniczego. W znacznym stopniu warunkuje to stabilność i trwałość lasu, mającą
największe znaczenie w przyjętym modelu leśnictwa wielofunkcyjnego. Zachowanie
jak najbardziej zróżnicowanych pul genetycznych poszczególnych gatunków drzew
leśnych jest zatem istotnym zadaniem dla leśnictwa, szczególnie w obliczu
obserwowanych zmian klimatycznych, o trudnych do przewidzenia konsekwencjach
przyrodniczych. Powszechnie stosowaną miarą zmienności genetycznej populacji jest
heterozygotyczność, której monitorowanie odgrywa szczególną rolę w ochronie
leśnych zasobów genowych.
Do najczęściej stosowanych w Lasach Państwowych metod zachowania
zasobów genowych in situ należy wybór i wyłączanie z wyrębu drzewostanów
nasiennych, charakteryzujących się najwyższą wartością hodowlaną i użytkową oraz
mających właściwe zdolności adaptacyjne. Według obowiązujących wytycznych
(Matras i Fonder 2006), w momencie likwidacji drzewostanu nasiennego, w miarę gdy
traci on zdolność do optymalnego pełnienia funkcji nasiennych ze względu na
zaawansowany wiek lub zaistniałe szkody, powinno pozostać po nim następne jego
pokolenie, o zbliżonej puli genowej. Należy przy tym dążyć do uzyskania go drogą
samosiewu, który uważa się za genetycznie znacznie bogatszy od pokolenia z
odnowienia sztucznego. Zasadę dotyczącą wyłączonych drzewostanów nasiennych
można odnieść także do pozostałych drzewostanów, których pula genowa ma być
zachowana w przyszłym pokoleniu.
Zjawisko zamierania drzewostanów świerkowych w Beskidzie Śląskim i
Żywieckim rodzi obawy związane z utratą lub ograniczeniem zasobów genowych
świerka w tym regionie, w tym najcenniejszych genotypów rasy istebniańskiej.
Przeważająca część drzewostanów świerkowych w Beskidach uległa rozpadowi
lub została w znacznym stopniu przerzedzona, pozostawiając jednocześnie po sobie
samorzutnie powstałe odnowienie. To nowe pokolenie drzew powstawało
2
spontanicznie, w miarę rozpadu drzewostanów dojrzałych, bez kierunkowego
przygotowywania drzew do obsiewu w roku największego urodzaju nasion poprzez
przeprowadzenie odpowiednich cięć. W związku z tym powstaje pytanie, na ile
odnowienie naturalne otrzymane w ten sposób, z udziałem nieznanej liczby drzew
rodzicielskich, odzwierciedla zasoby genowe drzewostanów, z których powstało?
Zatem – czy zasoby genowe świerka w Beskidach będą zachowane w następnym
pokoleniu drzewostanów?
Uwzględniając powyższe przesłanki przeprowadzono badania zmienności
genetycznej
odnowień
naturalnych
świerka
powstałych
w
zamierających
drzewostanach Beskidu Śląskiego i Żywieckiego. Struktura genetyczna odnowień
została porównana ze strukturą genetyczną odpowiednich populacji rodzicielskich,
określoną w czasie wcześniejszych badań przeprowadzonych przez Zakład Hodowli
Lasu i Genetyki Drzew Leśnych IBL w Sękocinie Starym. Pozwoliło to określić czy
wystąpiły istotne zmiany w pulach genowych populacji pomiędzy pokoleniami.
Analogiczne analizy zostały ponadto przeprowadzone dla drzewostanu
świerkowego o charakterze naturalnym (objętego ochroną rezerwatową), nie
wykazującego cech rozpadu, mogącego stanowić referencję dla zamierających
drzewostanów
beskidzkich.
Analiza
struktury
genetycznej
drzewostanu
rodzicielskiego i odnowienia w rezerwacie ścisłym pozwoliła odpowiedzieć na
pytanie, czy proces zamierania drzewostanów świerkowych w Beskidzie Śląskim i
Żywieckim wpłynął na przekazanie informacji genetycznej pomiędzy pokoleniami
drzewostanu w znacząco inny sposób niż procesy o charakterze naturalnym.
Na podstawie wyznaczonych celów pracy sformułowano następujące hipotezy
badawcze:
1. Zmienność genetyczna populacji potomnych drzewostanów świerkowych
w Beskidzie Śląskim i Żywieckim jest zbliżona do zmienności genetycznej populacji
rodzicielskich.
2. Różnice w pulach genowych pomiędzy populacją rodzicielską i potomną
drzewostanów świerkowych w Beskidzie Śląskim i Żywieckim są zbliżone do
obserwowanych w drzewostanie o charakterze naturalnym.
3
2. MATERIAŁ I METODY
2.1. WYBÓR DRZEWOSTANÓW
Badaniami
objęto
cztery
drzewostany
świerkowe
z
występującym
odnowieniem naturalnym, w tym trzy drzewostany z obszaru Beskidu Śląskiego i
Żywieckiego, zlokalizowane na terenie nadleśnictw należących do najsilniej
dotkniętych zjawiskiem zamierania świerka oraz jeden drzewostan z obszaru ochrony
ścisłej zlokalizowany w Tatrzańskim Parku Narodowym. Drzewostany z obszaru
Beskidu Śląskiego i Żywieckiego reprezentowały najcenniejsze krajowe pochodzenia
świerka tzw. rasy istebniańskiej, charakteryzujące się wyjątkowo wysoką wartością
hodowlaną i dużą plastycznością, udokumentowanymi w licznych doświadczeniach
proweniencyjnych. W warunkach obserwowanego zamierania świerczyn w Beskidzie
Śląskim i Żywieckim drzewostany te znajdowały się w różnych stadiach rozpadu.
Dokładną
lokalizację
oraz
charakterystykę
obiektów
badawczych
(drzewostanów) z terenu Beskidu Śląskiego i Żywieckiego przedstawiono poniżej. W
prezentowanej rozprawie nazwy leśnictw zostały przyjęte jako nazwy znajdujących się
w nich obiektów badawczych.
Nadleśnictwo Wisła, Leśnictwo Bukowiec, wydzielenie 149 h
Był to wyselekcjonowany drzewostan nasienny świerka (numer w rejestrze
LMP: MP/2/31104/05). Drzewostan zajmował powierzchnię 7,88 ha, na siedlisku lasu
mieszanego górskiego (LMGśw), w I klasie bonitacji. Drzewostan położony był w reglu
dolnym, na wysokości 530-740 m n.p.m. Wiek drzewostanu dojrzałego oszacowano
na około 170 lat. Skład gatunkowy drzewostanu to 9 świerk i 1 jodła. Drzewostan
charakteryzował się luźnym zwarciem, ze znacznym udziałem odnowienia bukowego
w fazie podrostu. W 2010 r. na znacznej powierzchni wydzielenia obserwowano
rozpad dojrzałego drzewostanu świerkowego oraz obecność grup i kęp odnowienia
naturalnego świerka w powstałych lukach.
Nadleśnictwo Wisła, Leśnictwo Zapowiedź, wydzielenie 108f
Był to wyselekcjonowany drzewostan nasienny świerka (numer w rejestrze
LMP: MP/2/31107/05). Drzewostan zajmował powierzchnię 21,91 ha, na siedlisku
lasu mieszanego górskiego (LMGśw), w I klasie bonitacji. Drzewostan położony był w
reglu dolnym,
na wysokości
580-690 m n.p.m. Wiek drzewostanu dojrzałego
oszacowano na około 130 lat. Skład gatunkowy drzewostanu to 10 świerk.
Drzewostan charakteryzował się przerywanym zwarciem. W 2010 r. obserwowano
4
pojedyncze i grupowe zamieranie świerków w dojrzałym drzewostanie. Odnowienie
naturalne świerka występowało średnio obficie na powierzchni całego wydzielenia,
pod okapem przerzedzonego górnego piętra drzewostanu.
Nadl. Węgierska Górka, Leśnictwo Skrzyczne, wydzielenie 38g
Był to drzewostan gospodarczy. Drzewostan zajmował powierzchnię 6,28 ha,
na siedlisku lasu mieszanego górskiego (LMG), w I klasie bonitacji. Drzewostan
położony był w reglu dolnym, na wysokości 750-900 m n.p.m. Wiek drzewostanu
dojrzałego oszacowano na około 120 lat. Skład gatunkowy drzewostanu to 10 świerk.
Drzewostan charakteryzował się przerywanym zwarciem. W 2010 r. na znacznej
powierzchni wydzielenia obserwowano rozpad dojrzałego drzewostanu świerkowego.
Pozostające kulisy (pasy) starodrzewu sąsiadowały z dużą powierzchnią otwartą,
porośniętą trzcinnikiem. Odnowienie naturalne świerka występowało niezbyt obficie
pod przerzedzonym drzewostanem oraz na sąsiadującej otwartej powierzchni.
Czwartym obiektem badawczym był bór świerkowy o charakterze pierwotnym
znajdujący się w rezerwacie „Wyżnia Mała Łąka, Wantule” na terenie Tatrzańskiego
Parku Narodowego (w rozprawie przyjęto nazwę: Wantule). Badaniami
objęto
drzewostan na obszarze właściwych Wantuli, tj. około 25 ha boru świerkowego
porastającego złomy i bloki skalne (tzw. wanty) poniżej północnej krawędzi stopnia
Wielkiej Świstówki, na wysokości od 1170 do 1350 m n.p.m. (regiel górny).
Drzewostan był litą świerczyną, pochodzenia naturalnego, na siedlisku boru
wysokogórskiego (BWG). Drzewostan charakteryzował się znaczną rozpiętością wieku
drzew zarówno w górnej warstwie drzewostanu jak i w odnowieniu. Przeciętny wiek
drzewostanu dojrzałego oszacowano na 170 lat. Drzewostan charakteryzował się
umiarkowanym zwarciem. W 2010 r. obserwowano wydzielanie się posuszu (posusz
stojący), szczególnie w dolnych partiach drzewostanu. Odnowienie naturalne świerka
występowało pojedynczo pod okapem drzewostanu.
2.2. MATERIAŁ BADAWCZY
W każdym drzewostanie pobrano krótkie odcinki pędów (10-20 cm) pokrytych
igłami z 50 osobników rozmieszczonych losowo w populacji rodzicielskiej oraz z 50
osobników rozmieszczonych losowo w populacji potomnej. Zbiór materiału
roślinnego z populacji rodzicielskich drzewostanów z obszaru Beskidu Śląskiego i
Żywieckiego oraz odpowiednie analizy biochemiczne dla tych prób zostały
przeprowadzone w 2009 roku w ramach tematu badawczego realizowanego na
5
zlecenie Lasów Państwowych w Zakładzie Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych IBL
w Sękocinie Starym (Nowakowska i in. 2010). Pędy pozyskiwano ze świerków nie
przejawiających wyraźnych symptomów chorobowych, oddalonych od siebie o około
30 – 40 m. Zbiór materiału roślinnego z populacji potomnych oraz z populacji
rodzicielskiej drzewostanu Wantule przeprowadzono w roku 2010 w ramach tematu
badawczego realizowanego na zlecenie Lasów Państwowych w Zakładzie Gospodarki
Leśnej Regionów Górskich IBL w Krakowie (Niemtur i in. 2011). W populacjach
potomnych drzewostanów z obszaru Beskidu Śląskiego i Żywieckiego pędy
pozyskiwano z osobników w wieku uprawy (o wysokości około 50 cm), w populacji
potomnej drzewostanu Wantule także z nieco starszych osobników (od wieku uprawy
do młodnika). Odległość pomiędzy osobnikami, z których pobierano pędy była zależna
od sposobu występowania (grupowo, kępowo, pojedynczo) oraz obfitości
odnowienia i wynosiła co najmniej 10 m.
2.3. METODY BIOCHEMICZNE
2.3.1. Izolacja DNA
DNA każdego osobnika izolowano z około 100 mg igieł rozdrobionych
w ciekłym azocie. Izolację wykonano za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji
całkowitego DNA z materiału roślinnego DNeasy Plant Mini Kit firmy Qiagen, zgodnie
z procedurą podaną przez producenta (DNeasy Plant Handbook, July 2006, Qiagen).
Wydajność izolacji badano za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym
barwionym bromkiem etydyny o stężeniu 0,5 µg/ml. Dokumentację żeli wykonano w
systemie Bio-Rad Gel Doc™ 2000 (Bio-Rad Laboratories, USA) poprzez wizualizację w
świetle UV o długości fali 302 nm. Stężenie i czystość DNA w każdej próbie określano
spektrofotometrycznie, poprzez pomiar absorbcji światła o długościach fali 230 (A230),
260 (A260) i 280 (A280) nm, za pomocą aparatu NanoDrop® ND-1000 (Biotech,
Wilmington, USA).
Próbki z wyizolowanym DNA przechowywano w buforze stabilizującym TrisEDTA–TE (pH 7,0) w temperaturze -75°C.
6
2.3.2. Amplifikacja DNA mikrosatelitarnego
Zmienność genetyczną badanych populacji świerka wykonano na podstawie
analizy polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych (SSR) DNA jądrowego, przy
zastosowaniu trzech loci: SpAG2, SPAC1H8, SpAGD1 (tab. 1). Sekwencje
mikrosatelitarne stanowią proste, tandemowe powtórzenia 1-6 nukleotydowych
motywów, występujące z wysoką częstością w części niekodującej genomu. Wysokie
tempo mutacji i znaczna zmienność alleliczna powodują, że markery mikrosatelitarne
są idealnym narzędziem do badania procesów zachodzących w ekologicznej skali
czasowej i śledzenia zmian genetycznych, które zaszły w ostatniej przeszłości
populacji (Selkoe i Toonen 2006).
Tab. 1. Charakterystyka amplifikowanych loci mikrosatelitarnych (źródło: Pfeiffer i in. 1997)
Wielkość produktu
PCR [pz]
Locus
Motyw
Sekwencja starterów
SpAG2
(TC)16
F: GCTCTTCACGTGTACTTGATC
R*: TTCGAAGATCCTCCAAGATAC
57 - 122
SpAC1H8
(GT)27
F: CCCAAGAAAAAAGTCATGGAT
R*: TCATTGGGATATGTGATACTTCC
91 - 200
SpAGD1
(AG)25
F: GTCAACCAACTTGTAAAGCCA
R*: ACTTGTTTGGCATTTTCCC
114 – 253
R* - starter znakowany fluorescencyjną sondą
Sekwencje SSR amplifikowano w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) według
zmodyfikowanej procedury Pfeiffera i in. (1997) oraz Yazdani i in. (2003). Amplifikację
DNA prowadzono w 25µl następującej mieszaniny reakcyjnej (Qiagen): 1 x stężony
bufor PCR, 1x Q-Solution, 2mM MgCl2, 200 µM dNTP Mix, 0,15 µM (dla loci SpAG2,
SpAGD1) lub 0,24 µM (dla locus SPAC1H8) startera F, 0,135 µM (dla loci SpAG2,
SpAGD1) lub 0,216 µM (dla locus SPAC1H8) znakowanego fluorescencyjnie startera R,
0,03 U Taq polimerazy i 50 ng matrycy DNA. Całość inkubowano w termocyklerze
PTC-200™ (MJ Research, Inc.) zaprogramowanym na wstępne podgrzewanie prób
przez 5 min w temp. 95°C oraz 40 cykli amplifikacji DNA według schematu: 45 s w
94°C, 45 s w 56°C (dla loci SpAG2, SpAGD1) lub 60°C (dla locus SPAC1H8), 45 s w 72°C,
końcowe wydłużanie powielonych fragmentów DNA przez 10 min. w 72°C.
7
Po
zakończeniu
reakcji,
oceniano
jakość
powielonych
fragmentów
mikrosatelitarnego DNA poprzez elektroforezę produktów PCR w 1,5% żelu
agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wizualizację
żeli
w
świetle
UV
wykonano w systemie Bio-Rad Gel Doc™ 2000 (Bio-Rad Laboratories, USA).
2.3.3. Analiza polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych
Produkty PCR rozdzielano elektroforetycznie w 7% żelu akrylamidowym w
automatycznym sekwenatorze CEQ™ 8000 (Beckman-Coulter®, Fullerton, USA), w
celu określenia wielkości poszczególnych alleli. Próbki DNA przygotowano poprzez
dodanie wyznacznika masy DNA Size Standard Kit 400 Genome Lab™ oraz roztworu
SLS (Sample Loading Solution) według zaleceń producenta Beckman-Coulter®.
Wyznakowane fragmenty DNA były automatycznie denaturowane i rozdzielane
metodą
elektroforezy
kapilarnej.
Wielkość
powielonych
fragmentów
mikrosatelitarnego DNA, w parach zasad (pz), odczytano za pomocą oprogramowania
CEQ™ 8000 Series Genetic Analysis System Software v 9.0 (Beckman-Coulter®, USA).
2.4. ANALIZY STATYSTYCZNE
Na podstawie danych otrzymanych po genotypowaniu każdego z loci,
określono liczbę oraz częstość występowania (frekwencję) poszczególnych wariantów
(alleli) mikrosatelitarnego DNA. Podobieństwo rozkładów częstości alleli w
poszczególnych loci pomiędzy populacją rodzicielską i potomną przeanalizowano za
pomocą dokładnego testu Fishera (Fisher 1934) w programie SPSS Statistics 17.0
(Mehta i Patel 2010).
Zmienność genetyczną populacji rodzicielskiej, populacji potomnej oraz
całego drzewostanu (drzew z populacji rodzicielskiej i potomnej łącznie) określono za
pomocą następujących wskaźników: obserwowana liczba alleli na locus Na,
oczekiwana liczba alleli na locus Ne (wg Hartla i Clarka 1989), indeks różnorodności
Shannona I (wg Shannona i Weavera 1949), heterozygotyczność obserwowana Ho,
heterozygotyczność oczekiwana He (wg Levene’a 1949) oraz heterozygotyczność
według Nei (1973) h, jako miara różnorodności genetycznej.
Zróżnicowanie genetyczne pomiędzy populacją rodzicielską i potomną
w ramach drzewostanu oszacowano za pomocą współczynnika utrwalenia (fiksacji)
FST (wg Wrighta 1921). Określono także wartości pozostałych statystyk F opisujących
8
hierarchiczną strukturę populacji, tj. współczynnik wsobności FIS oraz współczynnik
heterozygotyczności FIT (wg Hartla i Clarka 1989).
Na podstawie współczynnika utrwalenia FST określono wartość wskaźnika Nm
(wg Wrighta 1978), określającego wielkość przepływu genów pomiędzy populacją
rodzicielską i populacją potomną. W prezentowanej rozprawie wskaźnik Nm był miarą
powtórzenia tego samego genotypu w populacji rodzicielskiej i w populacji potomnej
drzewostanu.
Podobieństwo genetyczne pomiędzy populacją rodzicielską i populacją
potomną wyrażono za pomocą dystansu genetycznego DN (wg Nei 1978).
Obliczenia wszystkich wymienionych parametrów opisujących strukturę
genetyczną populacji wykonano w programie PopGen 1.31 (Yeh i in. 1999).
3. WYNIKI
3.1. FREKWENCJA ALLELI
3.1.1. Locus SpAG2
Największą liczbę alleli na locus zaobserwowano w drzewostanie Skrzyczne (22
allele; ryc. 1C), zaś najmniejszą w drzewostanie Wantule (15 alleli; ryc. 1D). Istotne
różnice w rozkładzie częstości alleli pomiędzy populacją rodzicielską i populacją
potomną zanotowano w drzewostanach Zapowiedź (p = 0,001) i Skrzyczne (p <
0,000), natomiast nie stwierdzono różnic pomiędzy pokoleniami w drzewostanach
Bukowiec (p = 0,919) i Wantule (p = 0,462). W stosunku do populacji rodzicielskiej, w
populacji potomnej liczba alleli była niższa w drzewostanach Bukowiec (zanotowano
utratę 3 alleli oraz obecność 1 nowego allelu, frekwencje tych alleli mieściły się w
zakresie od 0,012 do 0,023; ryc. 1B) i Zapowiedź (zanotowano utratę 4 alleli o
frekwencji 0,014 oraz obecność 1 nowego allelu o frekwencji 0,064; ryc. 1A), wyższa
w drzewostanie Wantule (nie zanotowano utraty żadnego z alleli oraz obecność 1
nowego allelu o frekwencji 0,045; ryc. 1D) oraz pozostawała bez zmian w
drzewostanie Skrzyczne (zanotowano utratę 7 alleli oraz obecność 7 nowych alleli,
frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od 0,010 do 0,085; ryc. 1C).
9
3.1.2. Locus SpAC1H8
Największą liczbę alleli na locus zaobserwowano ponownie w drzewostanie
Skrzyczne (42 allele; ryc. 2C), zaś najmniejszą w drzewostanie Bukowiec (37 alleli; ryc.
2A). Istotne różnice w rozkładzie częstości alleli pomiędzy populacją rodzicielską i
populacją potomną zanotowano jedynie w drzewostanie Bukowiec (p < 0,000),
natomiast nie stwierdzono różnic pomiędzy pokoleniami w drzewostanach Zapowiedź
(p = 0,102), Skrzyczne (p = 0,072) oraz Wantule (p = 0,085). W stosunku do populacji
rodzicielskiej, w populacji potomnej liczba alleli była niższa jedynie w drzewostanie
Wantule (zanotowano utratę 13 alleli oraz obecność 8 nowych alleli, frekwencje tych
alleli mieściły się w zakresie od 0,010 do 0,033; ryc. 3A), a wyższa w drzewostanach
Bukowiec (zanotowano utratę 8 alleli oraz obecność 11 nowych alleli, frekwencje tych
alleli mieściły się w zakresie od 0,010 do 0,052; ryc. 2A)., Zapowiedź (zanotowano
utratę 11 alleli oraz obecność 12 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w
zakresie od 0,010 do 0,035; ryc. 2B) i Skrzyczne (zanotowano utratę 10 alleli oraz
obecność 15 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od 0,010 do
0,037 za wyjątkiem nowego allelu 109 pz o frekwencji 0,060; ryc. 2C).
3.1.2. Locus SpAGD1
Największą liczbę alleli na locus zaobserwowano w drzewostanie Bukowiec (47
alleli; ryc. 4A), zaś najmniejszą w drzewostanie Zapowiedź (42 allele; ryc. 4B). Istotne
różnice w rozkładzie częstości alleli pomiędzy populacją rodzicielską i populacją
potomną zanotowano w drzewostanach Bukowiec (p = 0,020), Zapowiedź (p = 0,047)
i Skrzyczne (p = 0,008), natomiast nie stwierdzono różnic pomiędzy pokoleniami w
drzewostanie Wantule (p = 0,861). W stosunku do populacji rodzicielskiej, w populacji
potomnej liczba alleli była niższa jedynie w drzewostanie Zapowiedź (zanotowano
utratę 9 alleli oraz obecność 5 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w
zakresie
od
0,010 do 0,043; ryc. 4B), a wyższa w drzewostanach Bukowiec
(zanotowano utratę 8 alleli oraz obecność 13 nowych alleli, frekwencje tych alleli
mieściły się w zakresie od 0,010 do 0,043; ryc. 4A), Skrzyczne (zanotowano utratę 7
alleli oraz obecność 13 nowych alleli, frekwencje tych alleli były mieściły się w
zakresie od 0,010 aż do 0,061 dla allelu 148 pz i 0,071 dla allelu 159 pz; ryc. 4C) i
Wantule (zanotowano utratę 5 alleli oraz obecność 13 nowych alleli, frekwencje tych
alleli mieściły się w zakresie od 0,010 do 0,030; ryc. 3B).
10
0,25
A
0,35
B
0,3
Frekwencja
Frekwencja
0,2
0,15
0,1
0,05
0,2
0,15
0,1
0,05
63
65
81
83
85
87
89
91
93
95
97
99
101
103
105
107
109
113
123
0
63
81
83
85
87
89
91
93
95
97
99
101
103
105
107
109
113
0
Allele [pz]
Allele [pz]
D
0,5
C
0,25
0,25
Frekwencja
0,4
0,3
0,2
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
83
85
87
89
91
93
95
97
99
101
103
105
107
111
113
0,1
74
77
79
81
83
85
87
89
91
93
95
97
99
101
103
105
107
109
111
113
115
117
Frekwencja
0,3
Allele [pz]
Allele [pz]
Populacja rodzicielska
Populacja potomna
Ryc. 1. Frekwencja alleli mikrosatelitarnego locus SpAG2 w drzewostanach: (A) Bukowiec, (B) Zapowiedź, (C) Skrzyczne, (D) Wantule
11
87
89
93
95
97
99
101
103
105
107
109
111
113
117
119
121
123
125
127
131
133
135
137
141
145
147
151
153
155
157
161
163
165
175
177
181
185
191
193
197
213
224
Frekwencja
89
93
95
97
99
101
103
105
107
109
111
113
117
119
121
123
125
127
129
133
137
139
143
147
149
155
159
161
163
165
167
171
177
179
183
191
195
209
213
215
Frekwencja
93
97
99
101
103
105
107
111
113
115
117
119
121
123
125
127
129
131
133
137
139
141
147
155
157
159
161
163
165
179
181
189
191
195
197
200
226
Frekwencja
A
B
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Allele [pz]
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
C
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Allele [pz]
Allele [pz]
Populacja rodzicielska
Populacja potomna
Ryc. 2. Frekwencja alleli mikrosatelitarnego locus SpAC1H8 w drzewostanach: (A) Bukowiec, (B) Zapowiedź, (C) Skrzyczne
12
B
127
129
131
133
135
137
139
142
146
148
150
152
154
157
159
161
163
167
169
171
173
176
178
180
182
184
186
188
192
194
197
199
201
203
205
207
209
211
213
215
217
219
221
232
236
250
Frekwencja
93
95
97
99
101
103
105
107
109
111
113
115
117
119
121
123
125
127
131
135
139
141
143
147
149
151
153
155
157
159
161
163
165
169
171
177
179
191
193
197
209
Frekwencja
A
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Populacja rodzicielska
Populacja potomna
Allele [pz]
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Populacja rodzicielska
Populacja potomna
Allele [pz]
Ryc. 3. Frekwencja alleli mikrosatelitarnych loci: (A) SpAC1H8, (B) SpAGD1 w drzewostanie Wantule
13
118
127
129
131
133
135
137
139
142
144
146
148
150
152
154
157
159
161
163
165
167
169
171
173
176
178
180
182
184
186
188
190
192
194
197
199
201
203
205
207
214
216
Frekwencja
B
118
127
129
131
133
135
137
142
144
146
148
150
152
154
157
159
161
163
165
167
169
171
173
176
178
180
182
184
186
188
190
192
194
197
199
201
203
205
207
209
211
215
221
223
229
242
C
Frekwencja
127
129
131
133
135
144
146
148
150
152
154
157
159
161
163
165
167
169
171
173
176
178
180
182
184
186
188
190
192
194
197
199
201
203
205
207
209
211
219
221
234
236
238
242
244
252
254
Frekwencja
A
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Allele [pz]
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Allele [pz]
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Allele [pz]
Populacja rodzicielska
Populacja potomna
Ryc. 4. Frekwencja alleli mikrosatelitarnego locus SpAGD1 w drzewostanach: (A) Bukowiec, (B) Zapowiedź, (C) Skrzyczne
14
3.1.5. Podsumowanie
Badane loci mikrosatelitarne charakteryzowały się wysokim polimorfizmem,
przy czym najbardziej zmienny był locus SpAGD1. Podobieństwo rozkładów częstości
alleli pomiędzy populacją rodzicielską i potomną kształtowało się odmiennie w
drzewostanach z obszaru Beskidu Śląskiego i Żywieckiego niż w drzewostanie o
charakterze naturalnym z rezerwatu Wantule. Brak istotnych statystycznie różnic w
rozkładzie częstości alleli dla wszystkich analizowanych loci zanotowano jedynie w
drzewostanie Wantule, w pozostałych drzewostanach brak różnic dotyczył tylko
jednego z trzech analizowanych loci. Jednocześnie we wszystkich drzewostanach
zaobserwowano zmiany w składzie puli genowej pomiędzy populacją rodzicielską i
potomną, dotyczące przede wszystkim alleli o niskiej frekwencji. Wyższy udział
rzadkich alleli, tym samym większą liczbę alleli na locus, obserwowano częściej w
populacjach
potomnych
aniżeli
w
populacjach
rodzicielskich
badanych
drzewostanów.
3.2. PARAMETRY ZMIENNOŚCI GENETYCZNEJ
Badane drzewostany charakteryzowały się wysokim poziomem zmienności
genetycznej (tab. 2), niezależnie od stopnia ich naturalności. We wszystkich
drzewostanach średnia obserwowana liczba alleli na locus (Na) była wyższa od
średniej efektywnej liczby alleli na locus (Ne) (tab. 2). Wartości indeksu różnorodności
genetycznej Shannona (I) oraz wysoki poziom heterozygotyczności obliczony według
wzoru Nei (h) wskazywały na wysoką polimorficzność badanych loci DNA w
analizowanych drzewach (tab. 2). Średnia dla 3 loci wartość współczynnika
heterozygotyczności
obserwowanej
(Ho)
była
niższa
od heterozygotyczności
oczekiwanej (He) we wszystkich drzewostanach (tab. 2), co wskazywało na nieznaczny
niedobór genotypów heterozygotycznych w stosunku do wartości oczekiwanej w
populacji znajdującej się w równowadze Hardy-Weinberga. Największy niedobór
heterozygot, tym samym najwyższą wartość współczynnika wsobności (FIS; tab. 5),
odnotowano w drzewostanach Zapowiedź (ok. 18%) oraz Wantule (ok. 15%).
Populacje potomne badanych drzewostanów charakteryzowały się większą
liczbą alleli na locus aniżeli populacje rodzicielskie (tab. 3). Wyjątek stanowił
drzewostan Zapowiedź, w którym zanotowano odwrotną sytuację.
15
Tab. 2. Współczynniki zmienności genetycznej
badanych drzewostanów – wartości średnie dla 3 loci
Nazwa
drzewostanu
Na
Ne
I
Ho
He
h
Bukowiec
33,667
19,313
3,082
0,844
0,940
0,935
Zapowiedź
33,667
17,500
3,016
0,754
0,932
0,927
Skrzyczne
36,667
17,924
3,100
0,848
0,934
0,929
Wantule
34,000
16,597
3,032
0,784
0,932
0,927
Na – obserwowana liczba alleli na locus, Ne – oczekiwana liczba alleli na locus,
I – indeks różnorodności Shannona, Ho – heterozygotyczność obserwowana,
He – heterozygotyczność oczekiwana, h – heterozygotyczność wg Nei (1973)
Tab. 3. Obserwowana (Na) i oczekiwana (Ne) liczba alleli na locus
w populacji rodzicielskiej (R) oraz populacji potomnej (P)
badanych drzewostanów – wartości średnie dla 3 loci
Na
Ne
Nazwa
drzewostanu
R
P
R
P
Bukowiec
25,333
27,333
15,000
17,726
Zapowiedź
27,333
25,667
16,040
14,373
Skrzyczne
25,333
28,667
14,293
15,890
Wantule
26,667
28,000
15,270
15,859
W stosunku do populacji rodzicielskich, populacje potomne charakteryzowały
się podobną zmiennością genetyczną opisywaną przez indeks Shannona (I) oraz
poziom heterozygotyczności (h) obliczonej według wzoru Nei (tab. 4), przy czym nie
odnotowano różnic w tym zakresie pomiędzy odnowieniem powstałym w
następstwie rozpadu drzewostanów w Beskidach a samosiewem występującym pod
drzewostanem o charakterze naturalnym. Indeks różnorodności Shannona (I) był
generalnie wyższy w populacjach potomnych aniżeli w populacjach rodzicielskich,
jedynie w drzewostanie Zapowiedź przyjmował nieznacznie niższą wartość w
populacji potomnej (tab. 4). Współczynnik heterozygotyczności (h) wskazywał na
niewielkie wzbogacenie puli genetycznej potomstwa w stosunku do pokolenia
rodzicielskiego we wszystkich badanych drzewostanach (tab. 4), przy czym największy
wzrost udziału osobników heterozygotycznych w pokoleniu potomnym wystąpił w
16
drzewostanie Skrzyczne (5%). Wzrost heterozygotyczności w pokoleniu potomnym
drzewostanu Skrzyczne należy przypisać przepływowi genów z drzewostanów
sąsiednich, któremu mogło dodatkowo sprzyjać znaczne zaawansowanie procesu
rozpadu drzewostanu Skrzyczne. W czasie zbioru materiału roślinnego z populacji
potomnej drzewostanu Skrzyczne, drzewostan rodzicielski reprezentowany był już
tylko przez przerzedzoną kulisę (pas) starodrzewu, natomiast odnowienie znajdowało
się w większości na sąsiadującej otwartej powierzchni. Przepływ genów w silnie
przerzedzonym drzewostanie mógł być większy aniżeli w zwartym kompleksie
leśnym, ponieważ dyspersja pyłku i nasion drzew mogła odbywać się na większe
odległości.
Tab. 4. Indeks różnorodności Shannona (I), heterozygotyczność obserwowana (Ho),
heterozygotyczność oczekiwana (He) oraz heterozygotyczność wg Nei 1973 (h)
w populacji rodzicielskiej (R) i populacji potomnej (P)
badanych drzewostanów – wartości średnie dla 3 loci
I
Ho
He
h
Nazwa
drzewostanu
R
P
R
P
R
P
R
P
Bukowiec
2,882
2,964
0,854
0,833
0,936
0,940
0,925
0,930
Zapowiedź
2,882
2,839
0,786
0,724
0,923
0,930
0,912
0,920
Skrzyczne
2,761
2,938
0,799
0,894
0,887
0,934
0,878
0,924
Wantule
2,903
2,929
0,730
0,833
0,930
0,934
0,919
0,924
Heterozygotyczność obserwowana (Ho) była niższa od heterozygotyczności
oczekiwanej (He) zarówno w populacji rodzicielskiej, jak i w populacji potomnej
wszystkich badanych drzewostanów (tab. 4). Największe różnice w tym zakresie
wystąpiły w drzewostanach Zapowiedź i Wantule. W drzewostanie Zapowiedź
niedobór heterozygot był większy w pokoleniu potomnym (21%) niż w rodzicielskim
(14%), natomiast odwrotna sytuacja wystąpiła w drzewostanie Wantule – niedobór
heterozygot w pokoleniu rodzicielskim (20%) był dwukrotnie wyższy niż w potomnym
(10%). Stwierdzone prawidłowości mogą wskazywać na przeciwne kierunki selekcji
zachodzącej w obu drzewostanach. W drzewostanie Zapowiedź byłaby to selekcja
eliminująca homozygoty i powodująca wzrost udziału genotypów heterozygotycznych
wraz z wiekiem drzewostanu, aż do ustalenia się równowagi Hardy-Weinberga w
wieku dojrzałości sukcesyjnej. Z kolei stwierdzony dwukrotnie większy niż w
17
potomstwie niedobór heterozygot w populacji rodzicielskiej, jak również najmniejsza
wartość heterozygotyczności obserwowanej w pokoleniu rodzicielskim drzewostanu
Wantule (tab. 4), mogą wskazywać na selekcję faworyzującą homozygoty, jako formę
adaptacji do specyficznych warunków regla górnego. Analizując przyczyny niedoboru
heterozygot w pokoleniu potomnym drzewostanu Zapowiedź należy też wziąć pod
uwagę możliwość wystąpienia tzw. efektu Wahlunda, tj. redukcji heterozygotyczności
populacji związanej z istnieniem wewnątrz niej subpopulacji różniących się
frekwencjami alleli. W populacji potomnej drzewostanu Zapowiedź młode osobniki
występowały średnio obficie na powierzchni całego wydzielenia, a zbiór prób
obejmował obszar większy niż w odnowieniu pozostałych drzewostanów. Istnieje
zatem prawdopodobieństwo, że odnowienie naturalne reprezentujące w badaniach
pokolenie potomne drzewostanu Zapowiedź stanowiło w rzeczywistości dwie
genetycznie odmienne populacje, czego wynikiem jest stwierdzony duży udział
homozygot.
Najmniejszy deficyt heterozygot odnotowano w populacji potomnej silnie
przerzedzonego drzewostanu Skrzyczne (4%), co należy wiązać z intensywniejszym
napływem genów spoza lokalnej populacji. Przepływ genów z sąsiednich
drzewostanów skutecznie przeciwdziała redukcji zmienności genetycznej młodego
pokolenia drzewostanu Skrzyczne na skutek działania dryfu genetycznego, pomimo
znacznego zmniejszenia liczebności populacji rodzicielskiej.
3.3. PODOBIEŃSTWO GENETYCZNE I PRZEPŁYW GENÓW
W drzewostanach Bukowiec, Zapowiedź i Wantule populację rodzicielską i
potomną dzielił niewielki dystans genetyczny (DN; tab. 5), co świadczy o dużym
pokrewieństwie pomiędzy dwoma pokoleniami drzewostanu. Również wartość
współczynnika utrwalenia FST dla populacji rodzicielskiej i potomnej była bardzo
niska w tych drzewostanach (tab. 5), co potwierdza brak istotnego zróżnicowania
genetycznego pomiędzy osobnikami rodzicielskimi i ich potomstwem. Największe
podobieństwo genetyczne pomiędzy pokoleniami zanotowano w drzewostanie o
charakterze naturalnym. W drzewostanie Wantule badane odnowienie naturalne aż
w 93% odzwierciedlało pulę genetyczną drzewostanu, z którego powstało (wartość
podobieństwa genetycznego wynosiła 0,926). Nieco niższe, ale nadal bardzo wysokie
wartości podobieństwa wystąpiły w drzewostanach Bukowiec (86%) i Zapowiedź
(82%), reprezentujących najcenniejsze pochodzenia świerka
istebniańskiego.
18
Otrzymane wartości podobieństwa genetycznego pozwalają przypuszczać, że
korzystne cechy wymienionych drzewostanów beskidzkich zostały w dużej mierze
przekazane potomstwu.
Największym dystansem genetycznym pomiędzy pokoleniem rodzicielskim i
potomnym (DN; tab. 5) charakteryzował się z kolei drzewostan Skrzyczne. Odnowienie
naturalne w drzewostanie Skrzyczne odzwierciedlało pulę genetyczną populacji
rodzicielskiej w około 45% (wartość podobieństwa genetycznego wynosiła 0,445), co
wskazuje na znaczny udział osobników spoza lokalnej populacji w procesie
reprodukcji drzewostanu. W drzewostanie Skrzyczne zanotowano również największe
zróżnicowanie genetyczne pomiędzy populacją rodzicielską i potomną (FST; tab. 5),
kilkakrotnie wyższe niż w pozostałych drzewostanach, oraz najmniejszy przepływ
genów pomiędzy pokoleniami (Nm; tab. 5). Największy przepływ genów pomiędzy
pokoleniem rodzicielskim i potomnym wystąpił natomiast w drzewostanach
Bukowiec i Wantule (Nm; tab. 5).
Tab. 5. Wartości statystyk F, wskaźnik przepływu genów (Nm)
oraz dystans genetyczny (DN) pomiędzy populacją rodzicielską i potomną
badanych drzewostanów – wartości średnie dla 3 loci
Nazwa
drzewostanu
FIS
FIT
FST
Nm
DN
Bukowiec
0,090
0,096
0,008
50,285
0,156
Zapowiedź
0,176
0,184
0,010
23,819
0,197
Skrzyczne
0,061
0,092
0,032
21,520
0,810
Wantule
0,150
0,154
0,006
46,096
0,077
FIS -współczynnik wsobności, FIT - współczynnik heterozygotyczności,
FST - współczynnik utrwalenia, Nm – wskaźnik przepływu genów
Drzewostan Wantule charakteryzował się większą wsobnością (FIS; tab. 5) niż
badane drzewostany zagospodarowane z terenu Beskidów (za wyjątkiem
drzewostanu Zapowiedź), co najprawdopodobniej było skutkiem częstszego
krzyżowania pomiędzy spokrewnionymi osobnikami wewnątrz drzewostanu. Na
niewielki udział genów spoza lokalnej populacji w kształtowaniu puli genetycznej
potomstwa drzewostanu Wantule wskazuje także najmniejszy wśród badanych
drzewostanów dystans genetyczny (DN; tab. 5) i poziom zróżnicowania genetycznego
(FST; tab. 5) pomiędzy obydwoma pokoleniami drzewostanu. Ponadto, jedynie w
drzewostanie Wantule rozkłady częstości alleli w populacji rodzicielskiej i w populacji
19
potomnej nie różniły się istotnie od siebie we wszystkich badanych loci. Duże
podobieństwo
genetyczne
pomiędzy
populacją
rodzicielską
i
potomstwem
drzewostanu Wantule świadczy o wiernym przekazaniu informacji genetycznej
kolejnemu pokoleniu drzewostanu, co pozostaje w zgodzie z ideą zachowania
zasobów genetycznych chronionych populacji oraz ukształtowanych przez naturalne
procesy lokalnych adaptacji. Z drugiej strony, ograniczony dopływ genów spoza
badanej populacji może także przyczyniać się do większej wsobności w drzewostanie
Wantule,
prowadzącej
z
czasem
do
redukcji
zmienności
genetycznej
(heterozygotyczności) wsobnej populacji. Kwestią otwartą pozostaje pytanie, czy
potencjalnie częstsze krzyżowanie się pomiędzy spokrewnionymi osobnikami
wewnątrz populacji jest związane ze sposobem ochrony drzewostanu Wantule
(rezerwat ścisły) czy raczej z lokalizacją w reglu górnym, charakteryzującym się
specyficznymi warunkami środowiska.
4. PODSUMOWANIE I WNIOSKI
Przedstawione w rozprawie wyniki badań wskazują na pozytywny stan
zachowania zmienności genetycznej zamierających drzewostanów świerkowych z
Beskidu Śląskiego i Żywieckiego w powstałym samorzutnie odnowieniu naturalnym
tych drzewostanów. Radykalne ograniczenie liczebności drzew w zamierających
świerczynach beskidzkich nie wpłynęło w znaczący sposób na jakość informacji
genetycznej przekazanej potomstwu. Stwierdzony w badaniach wysoki poziom
zmienności genetycznej powstałych samosiewów pozwala sądzić, że wykorzystanie
ich w procesie odnawiania lasu w Beskidach nie przyczyni się do zubożenia zasobów
genetycznych przyszłych drzewostanów.
Na podstawie wyników przedstawionych w prezentowanej rozprawie
sformułowano następujące wnioski:
Zmienność genetyczna zamierających drzewostanów świerkowych w Beskidzie
Śląskim i Żywieckim została zachowana w powstałym samorzutnie odnowieniu
naturalnym. Populacje potomne świerczyn beskidzkich utrzymują podobny
poziom zmienności genetycznej jak populacje rodzicielskie, przy czym
odnotowano nieznaczne wzbogacenie puli genetycznej potomstwa w stosunku
do pokolenia rodzicielskiego w każdym z badanych drzewostanów.
20
Nie stwierdzono negatywnego wpływu zjawiska zamierania drzewostanów
świerkowych w Beskidzie Śląskim i Żywieckim na zmienność genetyczną
powstałych odnowień naturalnych. Różnice w zakresie zmienności genetycznej
pomiędzy pokoleniem rodzicielskim i potomnym świerczyn beskidzkich są
zbliżone do stwierdzonych w drzewostanie świerkowym o charakterze
naturalnym, w innych drzewostanach świerkowych opisanych w literaturze,
a także w odnawiających się naturalnie drzewostanach innych gatunków.
Pule genetyczne odnowień naturalnych nie są zupełnie tożsame z
reprezentowanymi
przez
pokolenie
rodzicielskie.
We
wszystkich
drzewostanach odnotowano zmiany w obecności rzadkich alleli pomiędzy
populacją rodzicielską i potomną. Jedynie w przypadku drzewostanu o
charakterze naturalnym nie stwierdzono różnic w rozkładzie frekwencji alleli
pomiędzy pokoleniem rodzicielskim i potomnym.
Podobieństwo genetyczne pomiędzy populacją rodzicielską i potomną było
wysokie w większości badanych drzewostanów. Największe podobieństwo
pomiędzy pokoleniem rodzicielskim i potomnym odnotowano w drzewostanie
o charakterze naturalnym, niewiele mniejsze w wyłączonych drzewostanach
nasiennych świerka istebniańskiego, zaś umiarkowane w drzewostanie
gospodarczym z terenu Beskidów.
W drzewostanie o charakterze naturalnym odnotowano nieznacznie wyższą
wsobność niż w większości drzewostanów świerkowych z Beskidu Śląskiego i
Żywieckiego. Problematyka kształtowania się zmienności genetycznej i
systemu kojarzenia w drzewostanach o charakterze naturalnym wymaga
dalszych badań.
5. LITERATURA
Zasady Hodowli Lasu obowiązujące w Państwowym Gospodarstwie Leśnym Lasy Państwowe.
2011. Centrum Informacyjne Lasów Państwowych, Warszawa.
Matras J., Fonder W. 2006. Wytyczne w sprawie ochrony leśnych zasobów genowych na
potrzeby nasiennictwa i hodowli drzew leśnych. Załącznik nr 1 do Zarządzenia nr 7A z 7
kwietnia 2006 r. dyrektora generalnego LP w sprawie ochrony leśnych zasobów genowych na
21
potrzeby nasiennictwa i hodowli drzew leśnych (znak sprawy: ZG/7130/7/2006). IBL, DGLP,
Warszawa.
Nowakowska J., Aniśko E., Bieniek J., Kantorowicz W., Klisz M., Michalska A., Przyborowski J.,
Sułkowska M., Zawadzka A. 2010. Określenie struktury genetycznej populacji sosny
zwyczajnej i świerka pospolitego w wybranych regionach pochodzenia z weryfikacją granic
regionów po uwzględnieniu zróżnicowania genetycznego populacji. Sprawozdanie końcowe z
tematu BLP-309, Instytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary.
Niemtur S., Sierota Z., Głaz J., Nowakowska J., Jachym M., Małecka M., Matras J., Piszczek
M., Wójcik J., Chomicz E., Kapsa M., Kowalik W. 2011. Kierunki zagospodarowania lasów
beskidzkich na terenach poklęskowych. Sprawozdanie końcowe z tematu BLP-340, Instytut
Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary.
Selkoe K. A., Toonen R. J. 2006. Microsatellites for ecologists: a practical guide to using
and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters 9: 615-629.
Pfeiffer A., Olivieri A. M., Morgante M. 1997. Identification and characterization of
microsatellites in Norway spruce (Picea abies K.). Genome 40: 411-419.
Yazdani R., Scotti I., Jansson G., Plomion C., Mathur G. 2003. Inheritance and diversity of
simple sequence repeat (SSR) microsatellite markers in various families of Picea abies.
Hereditas 138: 219–227.
Fisher R. A. 1934. Statistical methods for research workers (5th ed.). Edinburgh: Oliver and
Boyd.
Mehta C. R., Patel N. R. 2010. IBM SPSS Exact Tests. SPSS.
Hartl D. L., Clark A. G. 1989. Principles of population genetics. Sinauer Associates.
Shannon C. E., Weaver W. 1949. The mathematical theory of communication. University of
Illinois Press, Urbana.
Levene H. 1949. On the matching problem in genetics. Annals of Mathematical Statistics 20:
91-94.
Nei M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 70: 3321-3323.
Wright S. 1921. Systems of mating. Genetics 6: 111-178.
Wright S. 1978. Variability within and among natural populations. W: Evolution and the
genetics of populations. University of Chicago Press, Chicago, USA.
Nei M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small
number of individuals. Genetics 89: 583-590.
Yeh F. C., Yang R., Boyle T. 1999. POPGEN Version 1.31. Microsoft Window based for
population genetic analysis. Department Renewable Resources, University of Alberta,
Edmonton, Alberta, Canada.
22