Część I. Rozliczenie w zakresie rzeczowym 1. W jakim stopniu

Część I. Rozliczenie w zakresie rzeczowym
Zad. 2.4 „Poszerzenie puli genetycznej buraka cukrowego przez doskonalenie procesu
gynogenezy oraz podnoszenie odporności na wirusy nekrotycznego żółknięcia nerwów
i tolerancji na suszę.”
1. W jakim stopniu planowane cele poszczególnych zadań zostały zrealizowane w danym
roku (podać także w %)
Celem zadania jest poszerzanie puli genetycznej buraka cukrowego do hodowli odmian dla
zrównoważonych systemów rolniczych. Prace badawcze realizowane w tym kierunku obejmują
doskonalenie procesu gynogenezy, podnoszenie odporności na wirus nekrotycznego żółknięcia
nerwów oraz tolerancji na suszę.
Prace realizowano poprzez:
1)
selekcję potencjalnych komponentów rodzicielskich (P0) o wysokim i niskim potencjale
gynogenetycznym oraz ocena stopnia zróżnicowania genetycznego wybranych linii,
2)
utrzymanie cennych genotypów w kulturach in vitro, szklarni oraz polu,
3)
zastosowanie markerów molekularnych segregujących z odpornością (podatnością) na
rizomanię, wyselekcjonowanych w toku uprzednio prowadzonych badań na materiałach
dzikich buraków w celu oceny ich potencjalnej użyteczności w ocenie materiałów
hodowlanych buraka cukrowego (reakcje PCR, HRM),
4)
wdrożenie reakcji PCR na wcześniejszych etapach porażania materiału wirusem nekrotycznego
żółknięcia nerwów buraka BNYVV zamiast standardowo stosowanego testu ELISA, w celu
skrócenia cyklu hodowlanego – w zakresie analiz początkowych,
5)
wybór wielonasiennych linii diploidalnych z poszczególnych typów użytkowych buraka
cukrowego do zaplanowanego cyklu badań,
6)
założenie doświadczeń laboratoryjnych, ocena cech morfologicznych roślin oraz przyrostów
liści i korzeni w zależności od wilgotności gleby, oznaczenie parametrów jakości
technologicznej korzeni buraka cukrowego,
7)
wybór najlepszych pojedynków do rozmnożeń przez chów krewniaczy.
Cel zadania został zrealizowany w 70%.
2. Opis wykonania zadań (z uwzględnieniem informacji o wyjazdach zagranicznych)
Ad. 1. Materiałem wyjściowym do badań były heterozygotyczne, wielonasienne diploidalne
zapylacze buraka cukrowego – typu cukrowego (5 genotypów) i normalnego (5 genotypów).
Po sterylizacji kwiatostanów niezapłodnione zalążki izolowano z 5 zamkniętych pąków kwiatowych
znajdujących się na pędzie kwiatostanowym powyżej kwiatu w stadium antezy. Wykładano je na
pożywkę indukcyjną Murashige i Skooga (MS) zawierającą 1 mgdm-3 BAP. Inkubację zalążków
prowadzono w pokoju hodowlanym w temperaturze 25oC, w ciemności przez dwa tygodnie,
a następnie w 16-godzinnym oświetleniu o natężeniu ok. 40 mol-3m-2s-1. Ogółem na pożywkę
w okresie kwitnienia buraków cukrowych wyłożono 1000 zalążków typu cukrowego i 1000 zalążków
typu normalnego. Na podstawie liczby regenerujących zalążków określono potencjał gynogenetyczny
badanych genotypów. Po 5 – 8 tygodniach inkubowane w kulturach in vitro zalążki tworzyły zarodki.
Zalążki pochodzące z roślin typu normalnego (6,5%) charakteryzowały się wyższą zdolnością do
gynogenezy w porównaniu do zalążków typu cukrowego (5,5%).
Do oceny zmienności genetycznej roślin donorowych buraka cukrowego wykorzystano system
markerowy RAPD oraz ISSR. Izolację genomowego DNA przeprowadzono wg zmodyfikowanej
metody Davisa , a także wykonano elektroforetyczną i spektrofotometryczną ocenę czystości oraz
stężenia DNA w otrzymanych izolatach. Analizę polimorfizmu DNA badanego materiału wykonano
z zastosowaniem wyselekcjonowanych, a zarazem najbardziej polimorficznych starterów ISSR oraz
RAPD. Na podstawie uzyskanych wyników reakcji PCR wyznaczono współczynnik podobieństwa
genetycznego wg Nei'a i Li oraz opracowano dendrogram metodą UPGMA (analiza średnich
połączeń). Zastosowanie markerów molekularnych typu RAPD oraz ISSR pozwoliło na dokonanie
oceny zmienności genetycznej roślin donorowych buraka. W wyniku przeprowadzonych reakcji
w obrębie badanej populacji zdefiniowano właściwe dla danego typu buraka cukrowego wzory
prążkowe oraz określono unikalne produkty. Stwierdzono również polimorficzne różnice między
liniami matecznymi w typie cukrowym i normalnym na podstawie opracowanego dendrogramu.
Ad. 2. Z jednego zalążka tworzy się tylko jedna roślina, dlatego konieczne jest ich rozmnożenie
w kulturach in vitro dla otrzymania większej liczby materiału. Uzyskane regeneraty rozmnażano i po
drugim pasażu oznaczono stopień ploidalności badanych materiałów przy użyciu cytometru
przepływowego Partec CCA. Oznaczono stopień ploidalności 295 roślin uzyskanych z zalążków
wielonasiennych zapylaczy. Prawidłowo rozwinięte haploidy pochodzące z różnych zalążków po
rozmnożeniu, po trzecim pasażu poddano diploidyzacji poprzez traktowanie kolchicyną w warunkach
in vitro. Wierzchołki wzrostu wykładano na pożywkę zawierającą 250 mgdm-3 kolchicyny. Po
3 dniach eksplantaty przenoszono na świeżą pożywkę dla regeneracji pędów. Obecnie otrzymane po
kolchicynowaniu pędy są rozmnażane na pożywkach regeneracyjnych.
Ad.3. Założono pięć doświadczeń laboratoryjnych w warunkach porażenia BNYVV oraz dwa
doświadczenia w ziemi nieporażonej wirusem. Analizowano następujące materiały hodowlane
dostarczone przez hodowców buraka cukrowego:
1 - Homo RR RWD11 18, 2 - Homo RR RWD11 10, 3 - Homo RR RWD10 143, 4 - Homo RR
RWD11 28, 5 - Homo RR RWD10 121, 6 - Homo RR RWD10 125, 7 - Homo RR RWD11 8, 8 Homozyg rr FMS 07 1, 9 - Homozyg rr FMS 08 4, 10 - Hetero Rr FMS 07 1 x RWD10 125, 11 Hetero Rr FMS 084 x RWD 11 8, 12 - Hetero Rr FMS 071 x RWD 10 143, 13 - Hetero Rr FMS 084
x RWD11 28, 14 - Hetero Rr FMS 084 x RWD 11 18, 15 - Hetero Rr FMS 071 x RWD10 121, 16 Hetero Rr FMS 084 x RWD11 10.
Dokonano charakterystyki w/w materiałów rodzicielskich celem zbadania ich zróżnicowania
wewnętrznego (po 4 genotypy w poszczególnych obiektach oraz próbach zbiorczych). Z materiałów
po pełnym okresie porażenia (8 tygodni) pobierano do analiz DNA oraz RNA liście i korzenie.
Izolację DNA prowadzono wg metody Davisa, izolację RNA metodą kolumienkową. Odwrotną
transkrypcję prowadzono z zastosowaniem startera oligodT. PCR z zastosowaniem wybranych
uprzednio sekwencji prowadzono w następujących warunkach: 1ng/µl DNA, 2,5 mM MgCl2
(Thermo Scientific), 0,2 mM dNTP (Thermo Scientific), 1 µM specyficznych starterów (Genomed),
0,56 u DreamTaq Polymerase (Thermo Scientific), 1x Taq bufor z (NH4)2SO4 (Thermo Scientific)
i woda PCR w do 10 µl reakcji. Produkty PCR rozdzielano na 1,5% żelu agarozowym,
a dokumentację rozdziału wykonywano w systemie Gel Doc 2000 Gel Documentation System (BioRad). Analiza real-time PCR została wykonana z zastosowaniem modułów względnej analizy
ilościowej z użyciem LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Applied Science), względem
genu aktyny. Analiza HRM była prowadzona w module skanowania genu (LightCycler 480)
z użyciem Luminaris Color HRM Master Mix (Thermo Scientific). Z zastosowaniem programu
RestrictionMapper wersja 3 dokonano projektowania cięcia restrykcyjnego wybranych produktów
PCR celem weryfikacji obecności oczekiwanych wariantów sekwencyjnych (identyfikacja
haplotypów wyodrębnionych w toku HRM). Produkty cięcia rozdzielano na 2,7% żelu agarozowym.
W badanych materiałach wykazano obecność wybranych polimorfizmów sekwencji w regionach
istotnych dla różnych źródeł odporności na rizomanię, jednocześnie jednak dowiedziono
zróżnicowania genetycznego w kluczowych regionach dla wybranych z dostarczonych materiałów.
W toku fenotypowania wykazano obecność materiałów o zróżnicowanym poziomie wirusa oraz
Polymyxa betae, przy czym poziomy te nie zawsze były zgodne z oczekiwanym fenotypem,
natomiast analizy pojedynków wskazują na możliwość korelacji z genotypem w tym zakresie.
Na podstawie przeprowadzonych analiz możliwe jest wyselekcjonowanie materiałów posiadających
polimorfizmy istotne dla odporności na BNYVV. Przeprowadzono analizę HRM dla detekcji SNP
w regionach polimorficznych związanych z odpornością na rizomanię, wyselekcjonowano główne
regiony różnicujące badane materiały. Za pomocą cięcia enzymami restrykcyjnymi dopracowano
metodę detekcji SNP, m.in. celem weryfikacji obecności pojedynczej substytucji A-T oraz
zweryfikowano warianty sekwencyjne w wybranych obszarach.
Ad. 4. Celem detekcji BNYVV oraz Polymyxa betae po skróconym okresie porażenia pobierano
korzenie roślin po 1,5 oraz 1 miesiącu wzrostu roślin w ziemi zawierającej wirus i wektor. Następnie
dokonano izolacji RNA oraz przeprowadzono odwrotną transkrypcję i PCR zgodnie z opisaną
powyżej metodyką. Stwierdzono obecność oraz różnice w poziomie badanych patogenów również
w przypadku skróconego okresu porażenia, dzięki czemu zoptymalizowano procedurę wcześniejszej
detekcji BNYVV oraz Polymyxa betae.
Ad. 5. W trakcie realizacji zadania prace badawczo-selekcyjne w kierunku tolerancji na suszę
prowadzone były na zróżnicowanym genetycznie materiale hodowlanym obejmującym diploidalne
wielonasienne formy buraka cukrowego w dwóch typach użytkowych: typ cukrowy (Z) i typ
normalny (N).
Ad. 6. W doświadczeniu wysiano nasiona 2 linii typu 2xZ, 2 linii typu 2xN oraz wzorzec (odmiana
Pewniak i Janosik). Doświadczenie z 6 obiektami w trzech powtórzeniach założono na początku
września. Do wypełnionych glebą pojemników o wymiarach 60cm x 40cm x 14,2cm wysiano po 100
nasion z każdego obiektu. Jako czynnik przyjęto dwa poziomy wilgotności gleby. Przeprowadzono
ocenę cech morfologicznych roślin oraz przyrostów liści i korzeni w zależności od wilgotności gleby.
W badanym materiale obserwowano zróżnicowanie w wielkości blaszek liściowych oraz masy
korzeni w zależności od genotypu. Stwierdzono, że genotypy typu cukrowego charakteryzowały się
wyższą tolerancją na stres suszy niż genotypy typu normalnego. Masa części nadziemnej
i podziemnej analizowanych roślin była wyższa w porównaniu do kontroli. Podczas wzrostu roślin
w warunkach niedoboru wody zaobserwowano zwiększenie intensywności zabarwienia w części
nadziemnej, prawdopodobnie w wyniku zwiększonej akumulacji chlorofilu oraz wyższą masę części
podziemnej w porównaniu do kontroli. Oznaczenie parametrów jakości technologicznej korzeni
buraka cukrowego- prace nie były realizowane.
Ad. 7. Wybór najlepszych pojedynków do rozmnożeń przez chów krewniaczy - prace nie były
realizowane.
3. Wymierne rezultaty realizacji zadań
 Uzyskano linie podwojonych haploidów buraka cukrowego z genotypów o różnym potencjale
gynogenetycznym stanowiące materiał do badań w przyszłym roku.
 Potwierdzono przynależność badanych materiałów do dwóch typów buraka cukrowego (typ
cukrowy i normalny) prowadząc ocenę zróżnicowania genetycznego osobników matecznych.
 Wyselekcjonowano do dalszych prac, materiały o wysokim stopniu homozygotyczności pod
względem badanych loci, jak również heterozygotyczne, na podstwie opracowanych
i przetestowanych 4 markerów SNP do detekcji kluczowych polimorfizmów związanych
z odpornością na rizomanię.
 Zidentyfikowano obecność przynajmniej dwóch różnych źródeł odporności w badanych
populacjach.
 Przetestowano procedurę wcześniejszej detekcji BNYVV oraz Polymyxa betae do zastosowania
celem skrócenia cyklu selekcyjnego oraz wspomagających poszukiwanie nowych źródeł
odporności.
 Wstępna selekcja prowadzona na zróżnicowanym diploidalnym wielonasiennym materiale
hodowlanym wskazuje na możliwości wyboru genotypów tolerancyjnych na stres suszy w typie
cukrowym.
6. Rola partnerów w realizacji zadań (ze szczególnym uwzględnieniem organów administracji
publicznej)
Na obecnym etapie prac, udział Kutnowskiej Hodowli Buraka Cukrowego polegał na dostarczeniu do
badań ziemi porażonej patogenem powodującym nekrotyczne żółknięcie nerwów liści (rizomania)
oraz nasion i korzeni różnych genotypów buraka cukrowego.