Michał Michalak

„Charakterystyka mechanizmów regulacji kompleksu egzocystu
w komórkach roślinnych”
Michał Michalak
Stypendysta projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za
strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu
Operacyjnego Kapitał Ludzki
Egzocytoza jest procesem polegającym na transporcie pęcherzyków lipidowych z
wnętrza komórki i ich połączeniu z błoną komórkową. Zawartość pęcherzyków wydzielana
jest w ten sposób poza komórkę, natomiast błona pęcherzyka, w której jest zawartych wiele
białek, jest włączana do błony komórkowej. W ten sposób komórki zmieniają skład białek i
lipidów
błony,
a
także
dostarczają
poza
komórkę
niezbędne
składniki
matrix
zewnątrzkomórkowej. Za kierowanie i transport pęcherzyków w komórkach odpowiadają
specyficzne białka regulatorowe, szkieletowe oraz motoryczne, gdyż proces ten wymaga
ścisłej kontroli w czasie i przestrzeni. Regulacją procesu endocytozy zawiadują GTPazy
stanowiące białkowe przełączniki, które w stanie aktywnym uruchamiają procesy transportu,
natomiast zatrzymują je w stanie nieaktywnym. Zmiana stanu GTPaz realizowana jest
poprzez przyłączenie lub hydrolizę jednego z
komórkowych nośników energii – GTP.
GTPazy regulują aktywność dużych kompleksów białkowych odpowiedzialnych za transport,
kierowanie i fuzję pęcherzyków z błoną komórkową.
Na
szlaku
egzocytozy
kompleksem
wielobiałkowym
odpowiedzialnym
za
utrzymywanie pęcherzyków w pobliżu błony komórkowej jest egzocyst. Głównym zadaniem
kompleksu jest przyciągnięcie pęcherzyka w pobliże błony komórkowej, po czym kolejne
kompleksy białkowe łączą pęcherzyk z błoną. Egzocyst składa się z ośmiu podjednostek:
Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70 oraz Exo84, z których część dociera w
miejsce wydzielenia pęcherzyka na jego powierzchni, natomiast pozostałe oczekują
związane z błoną komórkową. Egzocyst jest kompleksem niezbędnym do prawidłowego
przebiegu takich procesów jak pączkowanie drożdży, rozgałęzienie neurytów, krążenie
receptorów błonowych, czy podział komórki.
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
U roślin odkryto powielenie większości genów kodujących podjednostki egzocystu,
podczas gdy u innych organizmów eukariotycznych każda reprezentowana jest przez
pojedynczy gen. Podobnemu powieleniu uległy także geny kodujące GTPazy roślinne.
Wiedza na temat kompletnych szlaków sygnałowych związanych z roślinną egzocytozą jest
ciągle niepełna, dlatego też trudno określić dokładną rolę egzocystu oraz mechanizm
regulacji formowania kompleksu u roślin. Dotychczas opisano zaangażowanie egzocystu w
roślinne procesy podziału komórki, wzrostu łagiewki pyłkowej i włośników, a także w
odpowiedź na grzybowe czynniki patogenne.
Celem badań w ramach mojego doktoratu jest ustalenie jakie interakcje
międzybiałkowe prowadzą do formowania kompleksu egzocystu u roślin. Poszukiwanie
oddziaływań pomiędzy wybranymi białkami planuję przeprowadzić z użyciem techniki
multicolor BiFC polegającej na fuzji genów kodujących badane białka z N- lub C- końcową
częścią białek fluorescencyjnych. W przypadku oddziaływań, badane białka łącząc się ze
sobą, doprowadzą do zbliżenia dwóch części białka fluorescencyjnego, co widoczne jest w
postaci
emisji
fluorescencji
o określonym
widmie.
Ilościowy
i
jakościowy
pomiar
zidentyfikowanych oddziaływań przeprowadzony zostanie przy użyciu techniki FRET-FLIM,
polegającej
na
rejestracji
zmian
pomiędzy
czasem
fluorescencji
pary
białek
fluorescencyjnych o zachodzącym na siebie widmie emisji (tzw. donor) i wzbudzenia
(tzw. akceptor). Otrzymane krzywe spadku emisji fluorescencji pozwalają na obliczenie
bezwzględnej wydajności oddziaływania.
Badania nad roślinną egzocytozą są prowadzone od niedawna. Wymagane jest
przeprowadzenie badań podstawowych o charakterze poznawczym i znacznej wartości
merytorycznej. Poznanie mechanizmów obronnych u roślin może przyczynić się w
przyszłości do skuteczniejszego zwalczania patogenów z jednoczesnym ograniczeniem
użycia chemicznych środków ochrony roślin i poprawy kondycji środowiska w sferze
gospodarki wodnej, ze szczególnym uwzględnieniem postępującego procesu stepowienia.
Wyjaśnienie mechanizmów kontroli wzrostu i rozwoju roślin z udziałem egzocystu pozwoli na
opracowanie roślin o zwiększonej tolerancji na niekorzystne warunki atmosferyczne czy
glebowe.
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego