pobierz

Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 4, str. 457–462
PRACA ORYGINALNA – Original Article
DONATA URBANIAK-KUJDA1,2, KATARZYNA KAPELKO-SŁOWIK1,
DARIUSZ WOŁOWIEC,1 IWONA PRAJS1, JAROSŁAW DYBKO1, MAREK
KIEŁBIŃSKI1 STANISŁAW POTOCZEK1, KAZIMIERZ KULICZKOWSKI1
Ekspresja receptorów NKG2A i NKG2D w subpopulacji
limfocytów T u chorych na indolentne chłoniaki złośliwe
nieziarnicze
Expression of NKG2A and NKG2D receptors on lymphocytes T
in patients with indolent non-Hodgkin lymphomas
1
Z Katedry i Kliniki Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku A.M. we Wrocławiu
Kierownik: Prof. dr hab. med. Kazimierz Kuliczkowski
2
Z WyŜszej Szkoły Fizjoterapii we Wrocławiu
Kierownik: Dr Andrzej Czamara
STRESZCZENIE
Komórki NK-CTLs (Natural-killer-cytotoxic T lymphocytes) stanowią frakcję cytotoksycznych
limfocytów CD8+ krwi obwodowej, których aktywność moŜe być skierowana przeciwko komórkom zainfekowanym wirusem lub stransformowanym nowotworowo. Ich funkcja cytotoksyczna
jest modulowana poprzez receptory aktywujące lub hamujące obecne na ich powierzchni. Do receptorów aktywujących zalicza się NKG2D, do hamujących zaś NKG2A. Nie jest znana rola
cząsteczek NKG2D i NKG2A obecnych na limfocytach T CD8+ w regulacji odpowiedzi przeciwnowotworowej u chorych na nieziarnicze chłoniaki złośliwe. Celem badań była ocena ekspresji cząsteczki NKG2A i NKG2D komórek NK na limfocytach T CD8+ krwi obwodowej pacjentów chorych na indolentne chłoniaki złośliwe nieziarnicze, uprzednio nie leczonych oraz w fazie
oporności na leczenie cytostatyczne. Badaniami objęto 27 pacjentów 17 kobiet i 10 męŜczyzn w
wieku od 19 do 70 lat oraz 10 osób zdrowych. Średni odsetek limfocytów CD8+ wykazujących
ekspresję NKG2A był istotnie wyŜszy w grupie pacjentów z chłoniakiem nieziarniczym opornym na leczenie, w porównaniu z chorymi badanymi w chwili rozpoznania oraz z grupą kontrolną (p=0,002, p=0,001), nie wykazano natomiast róŜnic pomiędzy grupą pacjentów nie leczonych
oraz osobami zdrowymi. Średni odsetek komórek CD8+ wykazujących ekspresję NKG2D był
istotnie wyŜszy w grupie chorych badanych w chwili rozpoznania niŜ w grupie kontrolnej
(p=0,003). Wykazane zwiększenie ekspresji receptora NKG2A w zaawansowanych chłoniakach
złośliwych indolentnych moŜe być przedmiotem celowanej immunoterapii dla wzmocnienia
efektu leczniczego podawanej chemioterapii.
SŁOWA KLUCZOWE: Receptor NKG2A – Receptor NKG2D – Limfocyty T – Chłoniak złośliwy
nieziarniczy indolentny
SUMMARY
NK-CTLs cells (Natural killer-cytotoxic T lymphocytes) are a subset of cytotoxic CD8+ lymphocytes. The main targets of their activity are virus infected or tumor cells. This cytotoxic activity can be regulated by specific expression of stimulatory surface receptors NKG2D and inhibitory ones NKG2A. The role of the expression and activity of those receptors in antitumor re-
458 D. URBANIAK-KUJDA i wsp.
sponse in lymphoid malignancies remains unclear. We undertook then the study of the significance of the expression of molecules NKG2D and NKG2A on CD8+ lymphocytes in patients
with indolent lymphomas: untreated and chemiotherapy resistant. Twenty-seven patients: 17 females and 10 males, aged 19-70 years and 10 healthy controls were enrolled in the study. Mean
percentage of CD8+ lymphocytes displaying NKG2A expression was significantly higher in patients with resistant lymphomas as compared to untreated patients and controls (p=0,002,
p=0,001, respectively). No difference of NKG2A expression between untreated patients and controls was found. Mean percentage of CD8+ cells with NKG2D expression was significantly
higher in untreated patients than in controls (p=0,003). Overexpression of NKG2A receptor
found in patients with indolent lymphomas could be potently the aim for specific immunotherapy.
KEY WORDS: NKG2A receptor – NKG2D receptor – Lymphocytes T – Indolent non-Hodgkin
lymphoma
WSTĘP
Aktywacja limfocytów krwi obwodowej moŜe być modyfikowana za pośrednictwem ekspresji występujących na ich powierzchni cząsteczek przekazujących sygnał.
Przykładowo, aktywacja lub zahamowanie limfocytów T zachodzi w zaleŜności od
ekspresji cząsteczek powierzchniowych CD28 lub CD152, modulowanych pod wpływem kontaktu z wirusem, cytokinami zapalnymi lub komórkami nowotworowymi (1,
2). W odpowiedzi przeciwnowotworowej istotną rolę odgrywają komórki NK (natural
killer) posiadające właściwości cytotoksyczne. Ich funkcja jest zaleŜna od reakcji odpowiednich ligandów z obecnymi na ich powierzchni dwoma typami receptorów: aktywujących i hamujących. Do receptorów aktywujących naleŜy m.in. NKG2D, którego
ekspresję stwierdzano równieŜ na limfocytach CD8+. Ligandami dla tego receptora są
cząsteczki MHC klasy I (2, 3). Receptorem hamującym jest NKG2A, obecny na aktywowanych limfocytach pamięci CD45RO/CD8+. NKG2A jest heterodimerem sprzęŜonym z antygenem CD94 o działaniu hamującym aktywność cytotoksyczną limfocytów
i komórek NK. Zwiększenie ekspresji CD94/NKG2A obserwowano u zwierząt
w przebiegu niektórych infekcji bakteryjnych i wirusowych (4). Stwierdzono teŜ, Ŝe
limfocyty CD8+ krwi obwodowej oraz obecne w nacieku czerniaka pod wpływem
IL-12 wykazują zwiększoną ekspresję NKG2A . Podobny wpływ na zwiększenie
ekspresji NKG2A wykazywały takŜe TGF beta (transforming growth factor, transformujący czynnik wzrostu) i IL-15 (5, 6). Zaobserwowano równieŜ, Ŝe znaczny odsetek
limfocytów T CD8+ naciekających tkankę nowotworową czerniaka i gwiaździaka wykazywał wysoką ekspresję receptora CD94/NKG2A, a jego zablokowanie za pomocą
przeciwciał monoklonalnych przywracało ich przeciwnowotworową aktywność cytotoksyczną (7). Badania nad rolą cząsteczek NKG2 w odpowiedzi przeciwnowotworowej w rozrostach hematologicznych były prowadzone głównie w szpiczaku mnogim.
W szczególności wykazano, Ŝe zablokowanie receptora NKG2D prowadziło do
zmniejszenia zdolności rozpoznawania plazmocytów szpiczakowych przez komórki
NK (8). Nie jest natomiast znana rola cząsteczek NKG2D i NKG2A obecnych na limfocytach T CD8+ w regulacji odpowiedzi przeciwnowotworowej u chorych na nieziarnicze chłoniaki złośliwe. Dlatego teŜ celem przedstawionych badań była ocena ekspre-
Ekspresja receptorów NKG2A I NKG2D
459
sji cząsteczki hamującej CD94/NKG2A i cząsteczki stymulującej NKG2D komórek
NK na limfocytach T CD8+ krwi obwodowej pacjentów chorych na chłoniaki złośliwe
nieziarnicze indolentne w chwili rozpoznania oraz przy stwierdzeniu oporności na
leczenie cytostatyczne.
MATERIAŁ I METODY
Pacjenci:
Badaniami objęto 27 pacjentów: 17 kobiet i 10 męŜczyzn w wieku od 19 do 70 lat,
(mediana 58 lat) chorych na chłoniaka złośliwego indolentnego (7 pacjentów z chłoniakiem immunocytowym, 6- z małych komórek B i 14 z chłoniakiem grudkowym).
U 12 pacjentów rozpoznano III, a u 15 - IV stadium zaawansowania choroby wg klasyfikacji Ann Arbor . U 14 chorych (6 w stadium III, 8 w stadium IV) badanie wykonano w chwili rozpoznania, u pozostałych 13 natomiast (6 w stadium III, 7 w stadium
IV) po stwierdzeniu oporności na leczenie cytostatyczne za pomocą dwóch linii chemioterapii. Średni poziom hemoglobiny wynosił 11.5 g/dl (9.8g/dl do 13.2g/dl), liczba
leukocytów 8.5 G/l (5.0 G/l do 11.0G/l), płytek krwi 155.0 G/l (180.0 G/l do 300.0G/l),
surowicza aktywność LDH wynosiła 551 U/l (350 U/l do 750 U/l). Grupę kontrolną
stanowiło 10 zdrowych osób, wiekiem i płcią odpowiadającym grupie badanej.
METODY
Badania przeprowadzono na limfocytach krwi obwodowej uzyskanych od chorych
w celu przeprowadzenia rutynowych badań diagnostycznych. Po przeprowadzeniu lizy
erytrocytów w środowisku zawierającym chlorek amonu komórki jądrzaste krwi obwodowej były znakowane przeciwciałami anty-CD8 sprzęŜonymi z izotiocyjanianem
fluoresceiny (FITC) (DAKO Cytomation, Dania), anty-CD94/NKG2A sprzęŜonymi z
fikoerytryną (PE) (Becton Dickinson, USA) lub anty-NKG2D sprzęŜonymi z PE
(Beckman Coulter, Francja). Znakowanie komórek wykonywano za pomocą zestawów
przeciwciał: anty-CD8-FITC/anty-CD94-PE oraz anty-CD8-FITC/anty-NKG2D-PE.
Kontrolami izotopowymi były barwienia zestawami przeciwciał anty-CD8FITC/IgG1-PE oraz anty-CD8-FITC/IgG2B-PE. Analizę cytofluorometryczną tak znakowanych komórek wykonywano z uŜyciem cytometru przepływowego Daco-Galaxy
(Partec, Niemcy) wyposaŜonym w laser argonowy o mocy 20 mW i program do akwizycji/analizy danych FloMax 2,4b. KaŜdorazowo analizie poddawano 20000 komórek
i oceniano odsetek komórek CD8+ wykazujących ekspresję badanych receptorów
(NKG2A lub NKG2D) w stosunku do całej populacji limfocytów CD8+.
Analizę statystyczną wyników przeprowadzono przy pomocy testu U Manna –
Whitney`a.
WYNIKI
Odsetek limfocytów CD8+ wykazujących ekspresję CD94/NKG2A był istotnie
wyŜszy w grupie pacjentów z chłoniakiem złośliwym nieziarniczym opornym na le-
460 D. URBANIAK-KUJDA i wsp.
czenie cytostatyczne w porównaniu z chorymi na chłoniaka badanymi w chwili rozpoznania (p= 0,002) oraz z grupą kontrolną (p= 0,001). Nie wykazano natomiast róŜnic
w tym zakresie pomiędzy grupą pacjentów przed leczeniem a osobami zdrowymi. Odsetek komórek CD8+ wykazujących ekspresję NKG2D był istotnie wyŜszy w grupie
Tabela 1. Odsetek limfocytów CD8+ z ekspresją NKG2A i NKG2D w grupach badanych i w grupie kontrolnej
Table 1. Percentage of CD8+ lymphocytes displaying NKG2A and NKG2D expression in patients and in
controls
Grupa I
Grupa
Grupa kontrolna
p
(n=14)
II (n=16)
(III) (n=10)
II vs I = 0.002
NKG2A
4.24±2.12
11.97±2.90
4.65±1.17
II vs III= 0.001
NKG2D
22.45±9.92
15.99±12.13
12.25±6.03
I vs III = 0.003
Grupa I: pacjenci ze świeŜo rozpoznanym chłoniakiem badani w chwili rozpoznania, grupa II: pacjenci z
chłoniakiem nieziarniczym opornym na leczenie, grupa III – grupa kontrolna. Podano wartość średnią i
odchylenie standardowe.
Group I – patients with newly diagnosed lymphoma, group II – patients with resistant lymphoma, group
III –controls. Mean value and standard deviation are indicated.
p=0,003
Odsetek komórek pozytywnych
25
20
p=0,002
15
p=0,001
10
5
0
NKG2A
NKG2D
Grupa I
Grupa II
Kontrola
Ryc. 1. Porównanie ekspresji NKG2A i NKG2D w populacji CD8+ grup badanych (I i II) i grupy kontrolnej (III)
Grupa I – pacjenci ze świeŜo rozpoznanym chłoniakiem nieziarniczym; Grupa II – pacjenci z chłoniakiem
nieziarniczym opornym na leczenie; Grupa III – grupa kontrolna osób zdrowych
Fig. 1. Comparison of NKG2A and NKG2D expression in CD8+ population of patients groups (I and II)
and controls (III)
Group I – patients with newly diagnosed Non-Hodgkin Lymphoma; Group II – patients with resistant
Non-Hodgkin Lymphoma; Group III – healthy subjects
Ekspresja receptorów NKG2A I NKG2D
461
chorych badanych w chwili rozpoznania niŜ w grupie kontrolnej (p=0,003). U tych
chorych ekspresja NKG2D na limfocytach CD8+ była równieŜ wyŜsza w stosunku do
pacjentów opornych na leczenie cytostatyczne, lecz róŜnica nie osiągnęła progu istotności statystycznej (p=0,061). Ekspresja omawianej cząsteczki była natomiast podobna u chorych po nieskutecznym leczeniu przeciwnowotworowym i w grupie kontrolnej. Nie wykazano zaleŜności pomiędzy ekspresją cząsteczek NKG2A i NKG2D
a wiekiem chorych, podstawowymi parametrami hematologicznymi, typem histopatologicznym chłoniaka, stopniem zaawansowania choroby ani aktywnością LDH.
Wyniki przedstawiono w Tabeli 1 i na Rycinie 1.
OMÓWIENIE
Istotną rolę w odpowiedzi gospodarza przeciwko komórkom nowotworowym odgrywa aktywność limfocytów T cytotoksycznych i komórek NK. Ta aktywność zaleŜy
z kolei od ekspresji receptorów pobudzających czynność tych komórek, w tym
NKG2D, oraz receptorów hamujących, do których naleŜy NKG2A. Receptor NKG2D
ma zdolność wiązania się z adaptacyjnymi cząsteczkami DAP-10, DAP-12 obecnymi
w limfocytach T i działa jako kostymulator ich funkcji (9, 10, 11, 12). Wykazano, Ŝe
w niektórych nowotworach narządowych, np. raku płuca i jelita grubego dochodzi do
osłabienia ekspresji receptora NKG2D na powierzchni komórek nowotworowych, co
z kolei prowadzi do zmniejszenia odpowiedzi immunologicznej gospodarza na ich
antygeny (5,13). Receptor NKG2A z kolei wykazuje działanie hamujące aktywność
cytotoksyczną limfocytów T i komórek NK. Zwiększenie jego ekspresji obserwowano
w niektórych infekcjach bakteryjnych i wirusowych u zwierząt oraz na limfocytach
ludzkich CD8+ obecnych w nacieku czerniaka złośliwego i gwiaździaka, a zablokowanie tego receptora specyficznym przeciwciałem przywracało przeciwnowotworową
aktywność cytotoksyczną własnych limfocytów (7).
Pomimo licznych badań wykazujących zaburzenia odporności zaleŜne od zmienionej ekspresji receptorów rodziny NKG2 w chorobach nowotworowych, niewiele prac
poświęcono temu zagadnieniu w rozrostach hematologicznych. Jak wspomniano wyŜej, zaburzenia odporności zaleŜne od receptora NKG2D wykazano w szpiczaku mnogim, nie wiadomo jednak, jakie jest miejsce nieprawidłowej regulacji ich ekspresji
i/lub aktywności w innych chłoniakach złośliwych nieziarniczych (8,11). Dlatego teŜ
celem przedstawionych badań była ocena ekspresji receptora hamującego NKG2A
i pobudzającego NKG2D na limfocytach T CD8+ chorych na indolentne chłoniaki złośliwe przy rozpoznaniu oraz w fazie choroby zaawansowanej i opornej na leczenie
cytostatyczne. Wykazaliśmy, Ŝe u pacjentów z zaawansowaną chorobą ekspresja receptorów hamujących NKG2A jest istotnie wyŜsza w stosunku do osób zdrowych jak
równieŜ, choć statystycznie niezmiennie, w porównaniu z grupą chorych badanych
w chwili rozpoznania. PoniewaŜ nie zaobserwowaliśmy róŜnic pomiędzy pacjentami
przed leczeniem a osobami zdrowymi wydaje się moŜliwe, Ŝe omawiane cząsteczki
odgrywają istotną chorobę w progresji choroby i nabyciu oporności na leczenie cytostatyczne. Z kolei ekspresja cząsteczki stymulującej NKG2D była najwyŜsza u chorych
462 D. URBANIAK-KUJDA i wsp.
na chłoniaka w chwili rozpoznania, natomiast u pacjentów z chorobą zaawansowaną
wykazywała poziom porównywalny z osobami zdrowymi.
Niniejsze obserwacje wymagają potwierdzenia badaniami na większej grupie chorych i uwzględniającymi czynnościową ocenę limfocytów T i komórek NK. Pozwalają
one jednak na sformułowanie hipotezy, Ŝe rozwój chłoniaka uruchamia mechanizmy
obrony immunologicznej angaŜujące cząsteczki NKG2D, w związku z czym ich ekspresja na limfocytach T cytotoksycznych się zwiększa. W miarę postępu choroby ten
mechanizm obronny ulega wyczerpaniu co, przy równoczesnym zwiększeniu ekspresji
cząsteczek hamujących aktywność limfocytów T i komórek NK, prowadzi do progresji
chłoniaka i jego oporności na leczenie cytostatyczne. Ponadto, wykazane w naszych
badaniach zwiększenie ekspresji receptora NKG2A w zaawansowanych chłoniakach
moŜe być przedmiotem celowanej immunoterapii dla wzmocnienia efektu leczniczego
podawanej chemioterapii.
PIŚMIENNICTWO
1. Labonte M., Letvin M. Variable NKG2 expression in the peripheral blood lymphocytes of rhesus
monkeys. Clin Exp Immunol 2004;138: 205-212.
2. Moser J., Gibs J., Jensen PE., Lukacher AE. CD94/NKG2A receptors regulate antiviral CD8+ T
cells responses. Nature Immunol 2002; 3: 189-195.
3. Moretta L., Romagnani C., Pietra G., Moretta A., Mingari MC. NK CTLs novel HLA-E restricted T cell subset. Trends Immunol 2003; 24:136-143.
4. Braud V., Aldemir H., Breart B., Ferlin WG. Expression of CD94/NKG2A inhibitory receptor is
restricted to a subset CD8+ T cells. Trends Immunol 2003; 2: 162-165.
5.
Lee JC., Lee KM., Kim DW., Heo DS. Elevated TGF –β1 secretion and down-modulation of
NKG2D underlies impaired NK cytotoxicity in cancer patients. J Immunol 2004; 172: 7335-7340.
6. Derre L., Corvaisier M., Pandolfino MC.,Diez E., Jotereau F., Gervois N. Expression of
CD94/NKG2-A oh human T lymphocytes is induced by IL-12: Implications for adoptive immunotherapy.
J Immunol 2002; 168: 4864-4870.
7. Lukacher A.: IFN- gamma suspends the killing license of anti-tumor CTLs. J Clin Investig 2002;
110: 1407-1409.
8. Carbone E., Neri P., Mesuraca M i wsp. HLA class I, NKG2D, and natural cytotoxicity receptors
regulate multiple myeloma cell recognition by natural killer cells. Blood 2005; 105: 251-258.
9. Jabri B., Selby J., Negulescu H. i wsp. TCR specificity dictates CD94/NKG2A expression by
human CTL. Immunity 2002; 17: 487-499.
10. Costello RT., Fauriat C., Sivori S., Marcenaro E., Olive D. NK cells: innate immunity against
hematological malignancies. Trends Immunol 2004; 25: 328-333.
11. Lanier LL. Natural killer cell receptor signaling. Curr Opin Immunol 2003;15: 308-314.
12. Bottino C, Castriconi R, Moretta L, Moretta A. Cellular ligands of activating NK receptors.
Trends Immunol 2005; 26: 221-225.
13. Speiser DE, Pittet MJ., Valmori D. i wsp. In vivo expression of NK cell inhibitory receptors by
human melanoma specific cytolitic T lymphocytes. J Exp Med 1999; 190: 775-782.
Praca wpłynęła do Redakcji 12.10.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 19.11.2007 r.
Adres Autora
Dr n.med. Donata Urbaniak-Kujda
Katedra i Klinika Hematologii Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku A. M. we Wrocławiu
50-367 Wrocław, ul. Pasteura 4