docRusza pierwsza w Polsce poradnia bioetyczna,Anty CD73
download 
Reklamacja Transkrypt
Rusza pierwsza w Polsce poradnia bioetyczna,Anty CD73
Nietoksyczne lekiem nanokapsułki z Liposomy mogą być używane w przemyśle farmaceutycznym jako nośniki leków. Niestety rozpoznawane są one jako obce antygeny przez układ odpornościowy. Bazując na dotychczasowej wiedzy na ich temat, naukowcy z uniwersytetu w Bazylei i Fryburgu pokazali, że specjalnie spreparowane przez nich liposomy nie wywołują szkodliwych dla zdrowia reakcji. Liposomy to małe, kuliste struktury, zbudowane z dwuwarstwy lipidowej. Dzięki wyjątkowym cechom można ich używać jako mikroskopijnych kapsułek na leki. Są one przede wszystkim biokompatybilne czyli zbudowane z takich samych składników jak błony komórek naszego organizmu. Ich niewielkie rozmiary pozwalają naprzechodzenie przez ściany naczyń krwionośnych w miejscach rozwijania się stanu zapalnego, gdzie przestrzenie międzykomórkowe są większe. Dzięki temu możliwy jest tzw. pasywny targeting czyli bierna akumulacja liposomów w miejscu docelowym np. w regionie występowania guza nowotworowego, infekcji bakteryjnej czy wirusowej. Ponadto mają one długi okres półtrwania wynoszący od kliku godzin – tzw. klasyczne liposomy, do kilku dni – tzw. liposomy długokrążące, co z kolei pozwala na utrzymanie stałego poziomu leku we krwi. Badania potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji immunologicznej Źródło pixabay, licencja CC0 Obecnie stosowane technologie pozyskiwania nośników leków na bazie liposomów wciąż nie są do końca satysfakcjonujące. Nie wiadomo jaki procent liposomów wchłaniają np. komórki nowotworowe. Problemem jest także reakcja organizmu na liposomy. Wychodząc naprzeciw potrzebom naukowcy z Uniwersytetu we Frubyrgu opracowali soczewkową formę liposomu, która pozwala na efektywne dostarczanie leku do zwężonych tętnic wieńcowych. Krew płynie przez zwężenia naczyń z dużą prędkością. W tych warunkach liposomy otwierają się i uwalniają swoją zawartość. Z powodu faktu, iż nasz układ odpornościowy rozpoznaje liposomy jako ciała obce, może to prowadzić do powstania skutków ubocznych takich jak szok anafilaktyczny. W związku z tym naukowcy skoncentrowali się na stworzeniu sztucznych fosfolipidowych pęcherzyków, tzw. Pad-PC-Pad vesicles, jako maleńkich “kapsułek” z lekiem. Osiągnięto sukces – zaprojektowane liposomy nie wywołały aktywacji składowych dopełniacza w surowicy ludzkiej i świńskiej w warunkach in vitro. Idąc dalej, przetestowano liposomy Pad-PC-Pad in vivo, na żywych organizmach. W tym celu wstrzyknięto je świniom i monitorowano różne parametry życiowe takie jak tętno, ciśnienie krwi oraz wykonano EKG. Nawet wysokie dawki nie wywołały niekorzystnych reakcji. Co więcej, biopsja nerek, płuc, serca i wątroby zwierząt potwierdziły brak toksycznych zmian. Badania in vitro oraz in vivo potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji anafilaktycznych, co rzutuje pozytywnie na przyszłość leczenia miażdżycy i innych schorzeń za ich pomocą. Według WHO choroba wieńcowa odpowiada aż za 30% zgonów na świecie. Skala problemu uwidacznia potrzebę wyprodukowania wydajnych leków możliwych do zastosowania w segmencie pozaszpitalnym. Pęcherzyki PadPC-Pad, ze względu na swoją bezinwazyjność i brak aktywowania odpowiedzi immunologicznej organizmu, są idealnym kandydatem na zastosowanie ich jako nośników leków. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Bugna S. et al. Surprising lack of liposome-induced complement activation by artificial 1,3-diamidophospholipids in vitro. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2016; 12. Rusza pierwsza w Polsce poradnia bioetyczna 19 marca w Krakowie zostanie uruchomiona Poradnia Bioetyczna. Jest ona adresowana do specjalistów i osób prywatnych potrzebujących pomocy w rozwiązaniu trudnych dylematów bioetycznych. Zapytania dotyczące między innymi tematyki badań na pacjentach, bioetyki w diagnostyce, zapłodnienia in vitro, pracy z embrionalnymi komórkami macierzystymi, badań na ludzkich embrionach, uporczywej terapii, eutanazji, etc. – można składać drogą elektroniczną lub poprzez kontakt osobisty. Organizatorami inicjatywy są Międzywydziałowy Instytut Bioetyki Uniwersytetu Papieskiego Jana Pawła II w Krakowie i fundacja Jeden z Nas. W Poradni będzie można też konsultować aspekty bioetyczne dotyczące transplantacji, etyki lekarskiej, a także opieki nad pacjentem w stanach terminalnych. W ramach działania poradni będzie można również uzyskać bezpłatną poradę prawną. Kto udziela porad? Porad w zakresie bioetyki udzielać będzie wykwalifikowany zespół bioetyków, wśród których znajdują się pracownicy służby zdrowia (lekarze, pielęgniarki, farmaceuci), prawnicy, teolodzy i filozofowie. Badania potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji immunologicznej Źródło pixabay, licencja CC0 Jak uzyskać poradę? Poradnia Bioetyczna będzie świadczyła swoje usługi nieodpłatnie. Informacje lub poradę będzie można uzyskać osobiście w siedzibie poradni przy ul. Bernardyńskiej 3 w Krakowie lub elektronicznie, za pomocą formularza dostępnego na stronie www.poradniabioetyczna.pl . W przyszłości poradnia planuje uruchomienie poradnictwa drogą telefoniczną. Anty CD73 – nowa nadzieja w terapii przeciwnowotworowej Po okresie sceptycyzmu immunoterapia w leczeniu nowotworów powraca do łask. Dzięki intensywnym badaniom nad zrozumieniem skomplikowanych oddziaływań układu odpornościowego w walce z nowotworem udało się zidentyfikować kluczowe molekuły decydujące o kierunku tych interakcji. Nadzieją na skuteczniejszą walkę z nowotworem są przeciwciała celowane w ekto-5’-nukleotydazę, znaną pod nazwą CD73. Immunoterapia pierwszej generacji (molekułami IFN-α i IL-2) stosowana była przez wiele dekad w leczeniu zaledwie kilku typów nowotworów. Terapie te nie wykazywały wystarczającej skuteczności, gdyż nie cechowały się specyficznością, czego wynikiem były liczne skutki uboczne u pacjentów im poddanych. Immunoterapia drugiej generacji cechuje się większymi możliwościami bazującymi na dokładniejszym poznaniu środowiska nowotworowego. W środowisku nowotworowym panują surowe warunki, w których aby dana komórka przetrwała musi reprogramować swoją maszynerię metaboliczną. W przypadku komórki rakowej jedną z ważniejszych i wpływowych zmian jest zwiększona ekspresja ekto-5’-nukleotydazy. Jest to enzym kataboliczny, który odgrywa decydującą rolę w progresji nowotworu poprzez nadprodukcję pozakomórkowej adenozyny. Poprzez interakcje ze specyficznymi GPI (zakotwiczonymi receptorami) adenozyna nadaje nowy kształt komórkom w otoczeniu nowotworowym, jednocześnie rozregulowując system odpornościowy i promując unaczynienie nowotworu. W ten sposób nowotwór może łatwo dawać przerzuty. Badania potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji immunologicznej Źródło pixabay, licencja CC0 W terapii celowanej przeciw CD73 stosuje się małej masy cząsteczkowej inhibitory takie jak APCP (adenozyno-5′-(α,β-methylene)difosforan, analog adenozyno-5′difosforanu), których zaletami są m.in. łatwa doustna aplikacja leku, lepsze oddziaływanie na mikrośrodowisko nowotworu, możliwość różnicowania receptur leku na potrzeby farmakokinetyczne i farmakodynamiczne oraz niskie koszty zakupu leku. Z kolei przeciwciała monoklonalne wykazują wyższą specyficzność i dłuższy okres półtrwania w porównaniu do inhibitorów. Ponadto nieocenioną zaletą użycia przeciwciał jest fakt, że celują one nie tylko w działanie katalityczne CD73, ale także inne czynniki, które pełnią istotną rolę w metastazie. Różnica w stosowaniu odpowiedniego leku bazuje na typie nowotworu – przeciwciała CD73 sprawdzą się lepiej w walce z inwazyjnym nowotworem, podczas gdy terapia inhibitorami będzie bardziej skuteczna w leczeniu nieinwazyjnego typu. Niezależnie od typu leku blokada CD73 stanowi doskonały cel terapeutyczny w walce z nowotworami. W szczególności pozwoli ona na zwiększenie skuteczności nowatorskich terapii bazujących na manipulacji efektorowych limfocytów T poprzez blokadę punktów kontrolnych układu immunologicznego przeciwciałami takimi jak ipilimuman (przeciwciało anty-CTLA 4) i nivoluman, (przeciwciało anty-PD1). Aby poszerzyć zakres działania i skuteczności terapii wiele badań wskazuje na połączenie powyższych dwóch sposobów z tradycyjnymi metodami leczenia nowotworu (radioterapia, chemioterapia i inne). Ponadto, relacja pomiędzy nadekspresją CD73 i typem raka, a także prognoza i reakcja pacjenta na chemioterapię, wspierają potencjalną wartość CD73 jako biomarkera w spersonalizowanej terapii nowotworowej. Pomimo wielu obiecujących perspektyw, jak każdy naturalnie występujący związek w organizmie człowieka, białko CD73 pełni także znaczące funkcje w procesach takich jak bariera nabłonkowa, regulacje procesów resorpcji i wydzielania na poziomie jelitowym. Chociaż badania na myszach pozbawionych CD73 lub leczonych lekami anty CD73 nie pokazały znaczących skutków ubocznych, to wdrażając nowy lek w fazę badań klinicznych, należy zachować ostrożność. Terapia anty CD73 może wywołać u pacjenta nadmierną aktywność układu odpornościowego, co z kolei grozi zwrotem przeciw własnemu organizmowi i wywołaniem różnego rodzaju chorób autoimmunologicznych. Zachęcające wyniki badań faz przedklinicznych pozwalają szacować, że terapie przeciw CD73 wkrótce wejdą w fazę badań klinicznych. Obecnie celem naukowców jest wyprodukowanie przeciwciał humanizowanych. Wstępne wyniki pokazują, iż jeden z leków anty CD73 (MEDI9447) może zostać użyty w terapii w połączeniu z anty PD-1 u pacjentów z zaawansowanymi guzami litymi. Nie ulega wątpliwości, że wykorzystanie CD73 w immunoterapii nowotworowej jest gorącym tematem w środowisku naukowym. Daje to nadzieję, że dzięki nowym możliwościom i opracowaniu nowatorskich terapii coraz więcej walk z rakiem skończy się wygraną pacjenta. Adrianna Grzelak Piśmiennictwo: Antonioli L. et al. Anti-CD73 in Cancer Immunotherapy: Awakening New Opportunities. Trends in Cancer, 2016; 2, 2: 95-106. Przebiegłe komórki nowotworowe Najnowsze badania wskazują, że komórki nowotworowe mogą wpływać na otaczające zdrowe komórki zmuszając je do produkcji zwiększonej ilości białek wspierających wzrost naczyń krwionośnych guza. Nowoczesne nauki znane jako proteomika i transkryptomika pomogły zrozumieć nieprawidłowości w procesach molekularnych komórek, które prowadzą do rozwoju nowotworu. Warto wspomnieć, że transkrypromika zajmuje się określeniem miejsca i czasu aktywności genów poprzez badanie transkryptomu, natomiast proteomika bada strukturę, funkcje i zależności między białkami. Badania potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji immunologicznej Źródło pixabay, licencja CC0 Naukowcy z Institute of Cancer Research w Londynie oraz Cancer Research UK Beatson Institute w Glasgow w oparciu o tą wiedzę odkryli, że sedno problemu może tkwić w tRNA. Sugeruje się, że tRNA inicjator obciążony metioniną (tRNAiMet) odgrywa istotną, aczkolwiek zaskakującą rolę – wpływa na produkcję białka kolagenowego, które promuje angiogenezę w guzie. W zdrowych tkankach fibroblasty wytwarzają kolagen, zwykle typu 1. Okazało się, że fibroblasty znajdujące się w pobliżu guzów nowotworowych wytwarzają kolagen typu 2, znacząco wspierając wzrost naczyń krwionośnych w zmianie. Przeprowadzono różne badania na ludzkich i mysich fibroblastach, a także na prawidłowych i nowotworowych tkankach pobranych od chorych na raka piersi. Odkryto, że fibroblasty aktywowane przez guzy złośliwe miały wyższy niż w tkankach prawidłowych poziom tRNAiMet oraz niektórych białek takich jak kolagen typu 2. Uzyskane rezultaty wskazują że podwyższony poziom tRNAiMet przyczynia sie do progresji nowotworowej poprzez zwiększenie zdolności fibroblastów zrębu do syntezy i wydzielania macierzy zewnątrzkomórkowej bogatej w kolagen typu 2, który z kolei wspiera migrację komórek nabłonkowych i angiogenezę. Naukowcy podkreślają kluczową rolę środowiska otaczającego guz w jego rozwoju, sugerując że nowotworzenie jest czymś więcej niż wzrostem produkcji białek celem zwiększenia ilości komórek tworzących guz. Wśród głównych wniosków wynikających z badania wymienia się związek między tRNA a progresją nowotworu oraz pomiędzy tRNA a sekrecją macierzy międzykomórkowej przez fibroblasty zrębu, selektywną kontrolę sekretomu przez zmiany poziomu tRNAiMet, a także powstanie nowego transgenicznego modelu reasumującego główne aspekty nowotworowego tRNA. Odkrycie może utorować drogę dla nowych możliwości terapeutycznych takich jak leki zaprojektowane do zaburzania zdolności nowotworu do manipulowania otaczającym je środowiskiem. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Clarke CJ. et al. The Initiator Methionine tRNA Drives Secretion of Type II Collagen from Stromal Fibroblasts to Promote Tumor Growth and Angiogenesis. Curr Biol, 3 Mar 2016. Brokuły kontra rak wątroby Regularne spożywanie brokułów obniża ryzyko zachorowania na wiele typów nowotworów na czele z nowotworem piersi, prostaty czy okrężnicy. Najnowsze badania prowadzone na University of Illinois wskazują, że dieta bogata w to warzywo może nas chronić także przed rakiem wątroby. Dieta wysokotłuszczowa, bogata w cukry oraz nieprawidłowy wskaźnik BMI są związane z rozwojem niealkoholowego stłuszczenia wątroby, które nieleczone może prowadzić do marskości czy nowotworów złośliwych wątroby. W związku z intensywnym trybem życia współczesnego społeczeństwa i utrzymywaniem często nieprawidłowych nawyków żywieniowych, wzrost częstości występowania raka wątroby nie wydaje się być abstrakcją. W badaniach nazwano ten styl odżywiania dietą narzuconą przez zachodnią kulturę (ang. Westernized-style diet, WD). Badania potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji immunologicznej Źródło pixabay, licencja CC0 Wiadomo, że brokuły zawierają wiele związków bioaktywnych, które mogą utrudniać kumulację tłuszczu w wątrobie. Bazując na tej wiedzy naukowcy postanowili sprawdzić wpływ spożywania brokułów na metabolizm lipidów i progresję niealkoholowego stłuszczenia wątroby w raka wątrobowokomórkowego. W badaniu eksperymentalnym podzielono myszy na 4 grupy: kontrolną, myszy mające dietę WD oraz zwierzęta którym podawano lub nie podawano brokułów. Uzyskany rezultat określano po 6 miesiącach diety, biorąc pod uwagę ekspresję genów, stłuszczenie oraz guzy wątroby. U myszy na diecie WD zaobserwowano wzrost liczby i wielkości guzów nowotworowych wątroby. Dodatek brokułów do diety znacząco zmniejszał liczbę guzów, nie wpływając zasadniczo na ich wielkość. Co więcej, u myszy z WD stłuszczenie wątroby stopniowo postępowało w przeciwieństwie do grupy karmionej warzywem. Brokuły wydają się tutaj wykazywać rolę protekcyjną zatrzymując gromadzenie tłuszczu w wątrobie i zwiększając uwalnianie lipidów z narządu. Dodatek brokułów do diety nie wpłynął na masę ciała myszy, ale utrzymał je w lepszej kondycji zdrowotnej: zaobserwowano znacząco niższy poziom trójglicerydów w wątrobie, obniżone stężenie aminotransferazy alaninowej, supresję aktywacji makrofagów CD68+ a także spowolnioną inicjację i progresję neoplazji w narządzie. Naukowcy sugerują, że nie tylko brokuły, ale także inne pokrewne warzywa takie jak kalafior czy brukselka mogą wywoływać podobny efekt. Już we wcześniejszych badaniach udowodniono, że spożywanie brokułów po odpowiedniej obróbce: świeżo pokrojonych lub sporządzonych na parze, jest doskonałym sposobem na utrzymanie zdrowia. brokuły zawierają bowiem sulforafan – naturalny izotiocyjanian o właściwościach przeciwutleniacza. Brokuły wykazują wyjątkowe cechy prozdrowotne. Są niskokaloryczne, mają właściwości przeciwnowotworowe, korzystnie wpływają na funkcjonowanie wzroku, regulują poziom cukru we krwi. Najnowsze badania udowadniają także, że długoterminowe spożywanie tego warzywa wpływa znacząco na stan wątroby. Pomimo faktu, iż wpływ brokułów na organizm ludzki nadal wymaga dogłębnych badań, dotychczasowe wyniki badań eksperymentalnych są obiecujące. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Chen YJ. et al. Dietary Broccoli Lessens Development of Fatty Liver and Liver Cancer in Mice Given Diethylnitrosamine and Fed a Western or Control Diet. Am Soc Nutr, 2016; 146, 3: 542-550. Nowoczesna diagnostyka laboratoryjna raka jajnika W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat zapadalność na nowotwory złośliwe znacznie wzrosła. Wśród kobiet w średnim wieku nowotwory są przyczyną co drugiego zgonu. Rak jajnika jest jednym z nowotworów najczęściej występujących u kobiet, tuż po nowotworach piersi, płuca i jelita grubego, będąc przyczyną 6% zachorowań i 8% zgonów. W Polsce w 2011 roku odnotowano 3527 nowych zachorowań na raka jajnika, podczas gdy dekadę wcześniej zachorowalność wynosiła 3193. Na przestrzeni lat 2001-2011 śmiertelność wzrosła o ponad 18%. Amerykańska agencja National Cancer Institute oraz Centers for Disease Control and Prevention we współpracy z National Center for Health Statistics oceniły, że zapadalność na raka jajnika w Stanach Zjednoczonych w 2014 roku wyniesie 22 tysiące nowych przypadków, natomiast śmiertelność utrzyma się na poziomie ponad 14 tysięcy zgonów. W porównaniu do 1997 roku liczba nowych zachorowań zmniejszy się o 18%, natomiast śmiertelność wzrośnie o 0,5% [1,2,3].Trudna sytuacja epidemiologiczna zmusza do poszukiwania nowych metod wykrywających nowotwór we wczesnym stadium choroby. Aktualnie w skriningu raka jajnika wykorzystuje się zwykle dwa podstawowe badania: USG dopochwowe oraz marker CA125. USG pozwala na wykrycie masy, która może być guzem, ale nie stwierdza czy zmiana jest łagodna czy złośliwa. Ca125 to białko, którego poziom znacznie wzrasta raku jajnika. Marker jest pomocny w monitorowaniu leczenia i progresji nowotworu. Spadek poziomu CA125 świadczy o skuteczności leczenia. Niestety istnieje szereg czynników, niezwiązanych z rakiem jajnika, które mogą podwyższać poziom CA125. Zastosowanie CA125 ogranicza fakt, że rzadko wzrasta on w raku śluzówkowym i jasnokomórkowym oraz w guzach granicznych. Co więcej, jego poziom może być podwyższony w przebiegu innych nowotworów (płuc, wątroby i trzustki) oraz w innych chorobach (mięśniaki macicy, endometrioza, niezłośliwe guzy jajników, marskość wątroby, choroby zapalne w obrębie miednicy). Poziom CA125 u kobiet waha się w przebiegu cyklu miesiączkowego. Wartością graniczną jest 35 U/mL [4,5,6,8,14 ]. Niektóre nowotwory zarodkowe jajników powodują uwalnianie do krwi dużych ilości innych czynników takich jak gonadotropina kosmówkowa (HCG) oraz alfafetoproteina (AFP), stąd można wykorzystać te parametry do monitorowania leczenia [4,7]. Ponieważ oznaczenie poziomu Ca125 nie jest idealnym narzędziem diagnostycznym, naukowcy i klinicyści poszukiwali innych rozwiązań, czego efektem było zarejestrowanie w 2008 roku przez FDA antygenu HE4 jako nowego markera nowotworów jajnika. Pokładano w nim duże nadzieje na poprawę diagnostyki różnicowej oraz skriningowej [5,6]. Czułość HE4 ocenia się na 67%, a specyficzność na 96%. Marker ten ulega zwiększonej ekspresji w nabłonkowych rakach jajnika. Pomimo faktu, że czułość HE4 jest porównywalna do czułości CA 125, stężenie HE4 rzadziej bywa zwiększone u kobiet z chorobami nienowotworowymi i pozostaje stałe u 75% kobiet bez progresji choroby. Wartością graniczną HE4 jest 150 pmol/L. Marker ten może być wykorzystywany w różnych stadiach zaawansowania nowotworu. Jego poziom wzrasta o 25% lub więcej u 60% kobiet z nawrotem raka jajnika lub progresją choroby.Ponieważ niektóre histologiczne rodzaje raka jajnika nie wykazują ekspresji HE4 (nowotwory śluzowe i zarodkowe), oznaczenie poziomu HE4 nie może być stosowane jako bezwzględny dowód na obecność lub brak procesu nowotworowego. Ogranicza to zastosowanie testu w ustalaniu rozpoznania [5,8,14,16]. Dalszy postęp w diagnostyce nowotworów doprowadził do wprowadzenia dwóch nowych testów o dużej przydatności diagnostycznej: testu OVA1 oraz algorytmu ROMA [7]. Algorytm ROMA klasyfikuje kobiety z guzem przydatków do grup ryzyka raka nabłonkowego jajnika. Algorytm jest modelem matematycznym, łączącym oznaczanie HE4 i CA125, z uwzględnieniem statusu menopauzalnego pacjentki. Został on po raz pierwszy zaproponowany w 2009 roku przez Moore i wsp. [17]. Czułość testu jest wysoka i szacuje się ją na 92% u kobiet po menopauzie i 76% przed menopauzą, natomiast swoistość wynosi 75%. Wartości graniczne algorytmu różnią się w zależności od laboratorium oraz stosowanej metody analitycznej. Rozważa się wykorzystanie CA125 i HE4 jako wskaźników odpowiedzi na chemioterapię. Ich zastosowanie w tym zakresie jest ograniczone, niemniej jednak uzupełnienie oznaczeń o markery epigenetyczne, może znacznie zwiększyć czułość i specyficzność badania [6,10,15,16]. Test OVA1 jest nowoczesnym narzędziem diagnostycznym, wprowadzonym w 2009 roku, służącym do wykrywania raka jajnika. Test wykorzystuje fakt, że u chorych na raka jajnika poziom CA125 oraz β2-mikroglobuliny wzrasta, natomiast stężenie apolipoproteiny A1, prealbuminy i transferryny jest niższe, niż u zdrowych kobiet. OVA1 łączy oznaczenie tych 5 parametrów, pozwalając na określenie prawdopodobieństwa rozpoznania złośliwego nowotworu jajnika, zgodnie z uzyskaną liczbą punktów: u kobiet przed menopauzą 5,0 punktów oraz u kobiet po menopauzie 4,4 lub więcej punktów świadczy o wysokim ryzyku. Czułość testu określa się na 96%. Test jest rzadko wykorzystywany w diagnostyce, nie tylko ze względu na wysoką cenę, ale także fakt, że zarówno swoistość jak i powtarzalność wyników nie jest zadowalająca [9,11,16]. Wciąż trwają poszukiwania doskonalszych narzędzi diagnostycznych. W ciągu ostatnich dwóch lat ukazało się wiele badań dotyczących obiecujących kandydatów na markery nowotworowe raka jajnika. Wśród nich należy wymienić osteopontynę (sOPN), wariant 6 sCD44 (sCD44-v6) oraz białko adhezyjne sVCAM-1. Jerman i wsp. proponują określenie ich poziomu w płynie z jamy otrzewnej i płynie z zatoki Douglasa jako markerów wczesnego stadium raka jajnika oraz wskaźników progresji nowotworu [18]. Zespół badawczy Park zwraca uwagę na tioredoksynę 1 jako marker raka jajnika, który może być badaniem uzupełniającym CA125 [19]. Pojawiają się także sugestie wykorzystania markerów znanych i wykorzystywanych w innych nowotworach. Takim przykładem jest określenie stężenia CA19-9 w surowicy jako markera uzupełniającego CA125 w przypadkach wymagających różnicowania zmian łagodnych od złośliwych w obrębie jajników oraz braku wzrostu poziomu CA125 [20]. Li i wsp. sugerują wykorzystanie oznaczenia poziomu HMGB1 (ang. high mobility group box chromosomal protein 1) w surowicy jako markera oceny progresji choroby oraz wykorzystania go w celach prognostycznych [21]. Pojawiło się również wiele doniesień dotyczących wartości prognostycznych markerów molekularnych takich jak ekspresja białka Fli-1 (ang. Friend leukemia integration 1 transcription factor), mRNA APOA1 (ang. mRNA apolipoprotein A1), ROR1 (ang. receptor-tyrosine-kinase-like orphan receptor 1) i wielu innych [22,23,24]. Wiedza na temat immunologii nowotworów doprowadziła do opracowania nowych strategii leczenia. W latach 80. XX wieku klinicyści zainteresowali się rodziną przezbłonowych receptorów czynników wzrostu z własną aktywnością kinazy tyrozynowej. Do nadekspresji receptorów HER/ErbB dochodzi w nowotworach pochodzenia nabłonkowego, co wiąże się ze złym rokowaniem. Wykrywanie nadekspresji HER2/NEU w tkance stało się pomocne w stosowaniu przeciwciała monoklonalnego (znane jako herceptyna – trastuzumab), które blokuje przekazywanie sygnału aktywacji podziałów komórkowych. Pomimo, że większość doniesień związanych z nadekspresją receptorów HER2 dotyczy raka piersi, to amplifikację genu HER2/NEU z towarzyszącą nadekspresją receptorów p185 HER2 obserwowano także w nowotworach nabłonkowych jajnika, zwykle w zaawansowanych stadiach choroby oraz w rakach nisko zróżnicowanych. Ocena stężenia HER2/NEU w płynach torbieli i wysiękach istniejących w rakach jajnika jest dobrym wskaźnikiem biologicznej agresji nowotworu. Nadekspresję HER2 stwierdza się u 18-43 % chorych na raka jajnika. Obecnie ekspresję HER2 określa się rutynowo dzięki zastosowaniu immunohistochemii (IHC) oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Dzięki temu możliwa jest weryfikacja wątpliwych wyników IHC. Przy pomocy metody IHC wykrywa się obecność wewnątrzkomórkowej domeny receptora, natomiast FISH pozwala na bezpośrednią detekcję amplifikacji genu HER2 kodującego białko receptorowe. Nowoczesnymi metodami, alternatywnymi do FISH, jest chromogenna hybrydyzacja in situ (CISH) oraz hybrydyzacja srebrem in situ (SISH). Obie metody to kombinacja cech IHC oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ [25,26]. Odkrycie w latach 90-tych XX wieku genu BRCA1 oraz BRCA2 rzuciło nowe światło na diagnostykę dziedzicznych nowotworów piersi i jajnika. Powyższe geny są zaangażowane we wzrost komórek, ich podział oraz w naprawę uszkodzeń DNA. Pojawienie się mutacji w obrębie genów powoduje brak naprawy uszkodzonego DNA i może prowadzić do rozwoju niektórych typów nowotworów. Mutacje w BRCA1 oraz BRCA2 wiążą się zazwyczaj z nowotworami piersi i jajnika. Niemniej jednak, mogą one pojawiać się także w innych nowotworach. Przykładem są mutacje BRCA2 i ich związek z rakiem prostaty czy rakiem trzustki. Szacuje się, że 39% kobiet z mutacją w obrębie BRCA1 i 11-17% z mutacją BRCA2 zachoruje na raka jajnika, podczas gdy powyższe prawdopodobieństwo u kobiet ogólnej populacji wynosi zaledwie 1,4% [12,13]. Najnowsze badania kliniczne dowodzą, że uszkodzenia epigenetyczne takie jak metylacja DNA są ściśle powiązane z zapoczątkowaniem procesu nowotworowego w obrębie jajników. Hipermetylacja promotora genu BRCA1, RASSF1A, APC, p14ARF, p16INK4A lub DAPK była obserwowana w 41 na 50 przypadków raka jajnika. Określenie miejsc metylacji może pomóc w ukierunkowaniu badań na nowe biomarkery o dużym znaczeniu w prewencji, ocenie ryzyka, szybkim wykrywaniu zmian oraz wartościach prognostycznych [15]. Badania potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji immunologicznej Źródło pixabay, licencja CC0 Wybiórcze zastosowanie w diagnostyce oznaczania markerów nowotworowych oraz szersze wykorzystanie możliwości biologii molekularnej może przyczynić się do wykrywania złośliwych zmian nowotworowych na wczesnym etapie rozwoju. Pomimo faktu, że diagnostyka i monitorowanie nowotworów jajnika wciąż nie są doskonałe, już w chwili obecnej klinicysta posiada do dyspozycji szereg badań, które analizowane równocześnie mogą skutecznie ukierunkować leczenie. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: 1.National Cancer Institute. New directions in Ovarian Cancer Research. Report of the strategic planning conference, monograph, Dec 8-9, 1997. 2.Dane Zakładu Epidemiologii i Prewencji Nowotworów Centrum Onkologii – Instytut w Warszawie. 3.Didkowska J et al. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2011 roku. Wyd. Studio Mediana, Warszawa 2013. 4.National Cancer Institute. Ovarian epithelial cancer treatment. Access: 24-06-2014. 5.Kulpa JK. i wsp. HE4 i CA125 – porównanie metod oznaczeń. Diagn Lab, 2012; 48: 41-49. 6.Nowak-Markwitz E. Oznaczanie HE4, CA 125 i algorytm ROMA w diagnostyce i różnicowaniu guzów jajnika. LabForum, 2013; 55: 3-5. 7.National Cancer Institute. Genetics of breast and ovarian cancer. Access: 11-07-2014. 8.ARUP Laboratories. Human Epididymis Protein 4 (HE4). For monitoring recurrence of progressive disease in women with epithelial ovarian cancer. Salt Lake City, 2014. 9.Li AJ. Nowe markery biologiczne w raku jajnika. Przydatność OVA1 i ROMA w ustaleniu rozpoznania. Ginekologia po dyplomie, 2012; 7: 14-19. 10.Woźniak S. i wsp. Guz jajnika u kobiety w późnym wieku rozrodczym – jak ocenić ryzyko onkologiczne.Przegl Menopauzalny, 2013; 1: 78-82 . 11.Toss A. et al. Ovarian cancer: Can proteomics give new insights for therapy and diagnosis? Int J Mol Sci, 2013; 14: 8271-8290. 12.National Cancer Insitute. BRCA1 and BRCA2: Cancer Risk and Genetic Testing. Access: 22-01-2014. 13.Petrucelli N. et al. BRCA1 and BRCA2 Hereditary Breast and Ovarian Cancer [In:] Gene Reviews, ed. Pagon RA. et al. University of Washington, Seattle, 1993-2014. 14.Zhen S. et al. Comparison of serum human epididymis protein 4 and carbohydrate antigen 125 as markers in ovarian cancer: A meta-analysis. Mol Clin Oncol, 2014; 2, 4: 559-566. 15.Koukoura O. et al. DNA methylation profiles in ovarian cancer: Implication in diagnosis and therapy. Mol Med Rep, 2014; 10, 1: 3-9. 16.Menon U. et al. Ovarian cancer screening—Current status, future directions. Gynecol Oncol, 2014; 132, 2: 490-195. 17.Moore RG. et al. A novel multiple marker bioassay utilizing HE4 and CA125 for the prediction of ovarian cancer in patients with a pelvic mass. Gynecol Oncol, 2009; 12, 1: 40-46. 18.Jerman KG. et al. Control values of ovarian cancer tumor markers and standardisation of a protocol for sampling peritoneal fluid and performing washing during laparoscopy. World J Surg Oncol, 2012; 12: 278. 19.Park BJ. Et al. Thioredoxin 1 as a serum marker for ovarian cancer and its use in combination with CA125 for improving the sensitivity of ovarian cancer diagnoses. Biomarkers, 1 Sep 2014: 1-7. 20.Cho HY., Kyung MS. Serum CA19-9 as a predictor of malignancy in primary ovarian mucinous tumors: a matched case-control study. Med Sci Monit, 2014; 20: 1334-1339. 21.Li Y. et al. Serum high mobility group box protein 1 as a clinical marker for ovarian cancer. Neoplasma, 2014;61,5: 579-584. 22.Song W. et al. Oncogenic Fli-1 is a potential prognostic marker for the progression of epithelial ovarian cancer. BMC Cancer, 2014, 14: 424. 23.Tuft Stavnes H et al. APOA1 mRNA expression in ovarian serous carcinoma effusions is a marker of longer survival. Am J Clin Pathol, 2014; 142, 1: 51-57. 24.Zhang H. et al. ROR1 expression correlated with poor clinical outcome in human ovarian cancer. Sci Rep, 2014; 4:5811. 25.Sedlaczek P., Sobańska E., Gryboś M. i wsp. Ocena zależności między ekspresją HER2/NEU (C−ERBB−2) w tkance a stężeniem w surowicy i płynach nowotworowych u chorych na raka jajnika. Adv Clin Exp Med 2005; 14, 4: 663–669. 26. English DP., Roque DM., Santin AD. HER2 Expression Beyond Breast Cancer: Therapeutic Implications for Gynecologic Malignancies. Mol Diagn Ther, PMC 1 Apr 2014. Wczesny biomarker Alzheimera Naukowcy z Ludwig Maximilians Universitaet (LMU) w Monachium zidentyfikowali biomarker powiązany z aktywacją odpowiedzi immunologicznej na uszkodzenie nerwowe obserwowane podczas wczesnych stadiów choroby Alzheimera. Alzheimer to postępująca choroba neurodegeneracyjna wynikająca z akumulacji toksycznych dla neuronów depozytów białkowych w mózgu. Istnieje kilka hipotez powstawania choroby. Jedną z nich jest hipoteza amyloidowa głosząca, że najważniejszą rolę w jej patogenezie odgrywają depozyty β-amyloidu. Nierozpuszczalne agregaty zaczynają się formować wiele lat przed ujawnieniem jakichkolwiek objawów demencji. Najnowsze doniesienia sugerują, że stężenie białka sTREM2 w płynie mózgowordzeniowym wzrasta znacząco we wczesnych stadiach choroby Alzheimera, co łączy to białko z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Naukowcy wskazują TREM2 jako białko o wysoce istotnej roli w progresji choroby, przypuszczając, że może ono mieć duże znaczenie także w innych rodzajach demencji. Jest ono bowiem zaangażowane w mechanizm obronny, który eliminuje uszkodzone neurony i toksyczne depozyty białkowe jakie tworzy βamyloid. TREM2 jest receptorem powierzchniowym kluczowym dla funkcji fagocytów ośrodkowego układu nerwowego (mikroglej). Komórki mikrogleju rozpoznają i niszczą uszkodzone i toksyczne elementy m.in. poprzez wzrost poziomu czynników o funkcji immunologicznej. TREM2 uwalniane jest do przestrzeni zewnątrzkomórkowej w postaci rozpuszczalnej (sTREM2), której poziom może być mierzony w płynie mózgowo-rdzeniowym. Już wcześniej naukowcy udowodnili, że mutacje utraty funkcji w obrębie TREM2 zmniejszają zdolność mikrogleju do usuwania agregatów amyloidu i uszkodzonych fragmentów tkanek. Przebadali oni 400 pacjentów chorych na Alzheimera. Dzięki wnikliwej analizie biochemicznej odkryto, że osoby z łagodnym deficytem funkcji poznawczych miały wyższe stężenie poszczególnych fragmentów TREM2 niż osoby w zaawansowanym stadium choroby. Obecnie nie wiadomo czy wahania stężenia białka to przyczyna czy konsekwencja progresji schorzenia. Najnowsze badania wskazują, że zmiany poziomu sTREM2 znakomicie odzwierciedlają rozwój wczesnego stadium choroby Alzheimera, co lokuje białko na pozycji interesującej z terapeutycznego punktu widzenia. Co więcej, wzrastające stężenie sTREM2 w płynie mózgowo-rdzeniowym wykazuje związek z innymi markerami neurodegeneracyjnymi (stężenie całkowite białka tau i jego fosforylowana postać fosfo-tau181P) Badania potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji immunologicznej Źródło pixabay, licencja CC0 Naukowcy z LMU planują rozpoczęcie długofalowych badań klinicznych, w których określą stężenie TREM2 w płynie mózgowo-rdzeniowym chorych z mutacjami o udowodnionym związku z chorobą Alzheimera. sTREM2 jako nowy biomarker choroby mógłby posłużyć jako czynnik monitorujący wydajność odpowiedzi przeciwzapalnej w leczeniu Alzheimera oraz pomóc we wczesnym rozpoczęciu zwalczania lub kontrolowania schorzenia. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Suárez‐Calvet M. et al. sTREM2 cerebrospinal fluid levels are a potential biomarker for microglia activity in early‐stage Alzheimer’s disease and associate with neuronal injury markers. EMBO Molecular Medicine, 3 Mar 2016. Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR – algorytm postępowania Jak przeprowadzić „optymalizację” reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać? Proponujemy algorytm postępowania, który pozwoli na szybką i bezbolesną poprawę wyników waszych reakcji PCR. Schemat optymalizacji A. Zawsze po zamówieniu nowych starterów PCR zaczynamy od nastawienia próbnej reakcji– od jej wyniku będzie zależało dalsze postępowanie. Musimy znać temperaturę annealingu starterów (albo obliczoną teoretycznie, albo używaną przez inne grupy badawcze, jeżeli nasze startery są zamówione na podstawie już publikacji). Jeżeli korzystaliśmy wcześniej z danego zestawu do PCR, mamy już jakiś działający program amplifikacji i ustalone proporcje reagentów -wykorzystajmy je teraz. Jeżeli jesteśmy nieobeznani z zestawem, przeczytajmy ulotkę i na jej podstawie obliczmy ilości odczynników. Zwykle musimy w końcowej objętości mieć: * bufor 1x stężony * dNTP 200μM * MgCl2 1-2,5mM * startery po 200nM * polimerazę ok. 0,5-1U * matrycę: DNA w ilości 25-50 ng lub cDNA uzyskane z ok. 50-100ng RNA * wodę DEPC, którą uzupełniamy objętość reakcji. (nie podajemy tutaj konkretnych objętości, ponieważ zależnie od zastosowanego zestawu PCR będą one różne, w instrukcji do zestawu jest jednak zwykle wyszczególniony przepis w mikrolitrach) B. Jeżeli nie mamy ustalonego programu PCR, zastosujmy najprostszy, obejmujący : *5 minut denaturacji w 94 stopniach (jeżeli polimeraza nie jest typu HotStart) lub 10 minut w 95 stopniach (dla enzymu HotStart) *30 cykli: (30 sekund denaturacji+ 30 sekund annealingu w temperaturze zależnej od pary starterów + 30 sekund elongacji) *2 minuty elongacji końcowej. C. Po skończonej reakcji pobieramy 5ul, dodajemy obciążnik do elektroforezy i rozdzielamy na żelu agarozowym. Nie zapomnijmy rozdzielić produktu wobec markera mas, by móc zorientować się, czy otrzymany prążek jest tym, czego oczekiwaliśmy. W zależności od tego, czy otrzymamy prążek na żelu, postępujmy dalej zgodnie z poniższym algorytmem By uniknąć frustracji i niepotrzebnego „kręcenia się w kółko” podczas wprowadzania nowej metodyki opartej na reakcji PCR powinniśmy mieć jasny plan działania i przestrzegać kilku prostych zasad. 1. Stosujmy się do reguły małych kroków. Dążymy w pierwszej kolejności do otrzymania jakiegokolwiek śladu produktu, następnie powoli dopracowujmy reakcję korzystając po kolei ze wszelkich dostępnych metod i odczynników. Czasami od razu uda nam się trafić w idealne warunki, a czasem trzeba będzie dochodzić do nich dłużej. 2. Zapisujmy wszystkie żele, nawet te najbrzydsze. Sporządzajmy notatki dotyczące warunków reakcji i kolejnych rund optymalizacji. Moim zdaniem najlepsza metoda na takie notatki to zapisywanie bezpośrednio na elektronicznym zdjęciu żelu warunków, w jakich reakcja została wykonana. Czyli: kiedy ją wykonano, na jakim sprzęcie, na jakim zestawie do PCR (jeśli mamy kilka). Zapiszmy program PCR lub chociażby temperaturę annealingu oraz koniecznie stężenie magnezu. Jeżeli używaliśmy dodatków (np. DMSO) także nie zapomnijmy tego napisać. 3. Zanim zabierzemy się do nastawiania PCR zweryfikujmy stężenia naszych reagentów, ich termin ważności oraz (TO BARDZO ISTOTNE!) sprawdźmy sekwencje naszych starterów. Jeżeli pomyliliśmy się podczas zamawiania, zweryfikowanie tego drobnego szczegółu oszczędzi nam tygodni frustracji. 4. Jeśli jakaś metoda „nie chodzi” mimo wszystkich naszych działań, nie wypruwajmy sobie żył. Spróbujmy zmienić startery albo zestaw do PCR. Alternatywą jest poproszenie współpracownika o pomoc. Bywa że to pomaga D. Bogatsi o tę wiedzę możemy zacząć optymalizację. Spójrzcie na powyższy prosty schemat blokowy, którym możecie się posłużyć przy wprowadzaniu większości nowych reakcji. Podstawowym narzędziem pracy podczas optymalizacji jest gradient termiczny i gradient magnezu. Pozwalają one na wykonanie dokładnie tej samej reakcji w szeregu różnych temperatur i stężeń magnezu. Wykonanie gradientu temperatury jest możliwe na nowszych termocyklerach. Potrafią one nagrzać blok grzewczy tak, by w kolejnych rzędach dołków temperatura stopniowo wzrastała. Żeby uzyskać jednolite warunki PCR w każdej próbówce, musimy przygotować wspólną mieszaninę reakcyjną zawierającą wszystkie składniki, a potem rozporcjować ją na pojedyncze próbówki. Polecam wykonać na początku dość „szeroki” gradient, np. co 2 stopnie celcjusza zaczynając od temperatury dużo niższej od temperatury obliczonej jako optymalna (np. 0d ok. 50 stopni celcjusza przy optymalnej ok. 60), kończąc na temperaturze wyższej niż obliczona optymalna (np. 62 w naszym przykładzie). Jeżeli taki gradient da odpowiedź, w której temperaturze produkt jest najlepiej widoczny, możemy wykonać drugi PCR gradientowy w węższym zakresie temperatur, np. co ok. 1 stopień celcjusza wokół wcześniej wytypowanej przez nas optymalnej temperatury. E. Zwykle po pierwszej lub drugiej reakcji PCR otrzymujemy jakiś ślad pożądanego produktu, nawet jeśli jest on słaby i nawet jeśli są obecne produkty niespecyficzne. Po dokonaniu wyboru optymalnej temperatury, wykonujemy gradient magnezu. Przygotowujemy kilka próbówek PCR z różnymi stężeniami magnezu. Może to być trudne dla początkującego, proponuję więc poradzić się osoby bardziej doświadczonej, jeżeli mamy z tym problem. W próbówce nr 1 przygotujmy stężenie, które po dodaniu do MIXu da nam 0,5mM, w próbówce 2: 1mM, w próbówce 3 : 1,5mM itd. aż do 3,5mM ((instrukcja znajduje się u dou strony). Wykonujemy wspólny mix reakcyjny podobnie jak przy gradiencie temperatury, ale bez dodatku magnezu. Pipetujemy mieszaninę do osobnych próbówek, a potem dodajemy odpowiednio stężony magnez, osobno do każdej z próbówek. F. Po wykonaniu reakcji w gradiencie magnezu i rozdziale agarozowym produktów w 3/4 przypadków udaje nam się uzyskać w miarę czysty i dobrze widoczny produkt. W pozostałych przypadkach musimy wrócić do gradientu temperatury z już wybranym optymalnym stężeniem magnezu (o ile uda nam się takie wybrać). Jeżeli nie liczymy się z kosztami, możemy wykonać jednocześnie gradient 2D na płytce 96-dołkowej (w wymiarze szerszym gradient termiczny, w węższymmagnezu). Przeprowadzenie kolejne obu gradientów jest tańsze, ale bardziej czasochłonne niż wykonanie podwójnego gradientu. Jeżeli nie otrzymaliśmy w ogóle żadnego produktu, wykonajmy na użytych do optymalizacji odczynnikach inną reakcję PCR, o której wiemy że działa. Jeśli okaże się że równieżnie otrzymamy produktu, musimy zmienić zestaw do PCR, w przeciwnym razie dalej zmagamy się z optymalizacją na tych samych odczynnikach- możemy dodać więcej starterów lub więcej dNTP. O tym jak modyfikować te parametry i jak połaczyć kilka reakcji PCR w multiplex, przeczytacie w części III naszego opracowania. Jeżeli nie otrzymujemy produktu, możemy także dodać któregoś z dodatków do trudnych matryc (DMSO, betaina, DTT, albumina). O tym jak z nich korzystać- dowiemy się w części IV niniejszego cyklu artykułów. Życzymy samych udanych optymalizacji! *Krótka instrukcja wykonania gradientu (przykład dla reakcji o całkowitej objętości 25μl): Dodatek 3,5μl MgCl2 o standardowym stężeniu 25mM na 25μl całkowitej objętości reakcji daje nam finalne stężenie po sporządzeniu MIXu 3,5mM MgCl2. Żeby przygotować stężenia odpowiednio mniejsze w tej samej objętości 3,5μl, wystarczy odmierzyć odpowiednio mniej magnezu i uzupełnić wodą do 3,5μl. Tak więc żeby otrzymać: * 0,5mM końcowej reakcji dodajmy 0,5 μl MgCl2 + 3μl H20 * 1mM : 1μl MgCl2 + 2,5μl H20, * 1,5mM: 1,5μl MgCl2 + 2μl H20 *2mM: 2μl MgCl2 + 1,5μl H20 *2,5mM: 2,5μl MgCl2 + 1μl H20 *3mM: 3μl MgCl2 + 0,5μl H20 Osobno mix reakcyjny na 7 próbówek przygotowujemy bez magnezu o objętości 3,5μl, który mamy sporządzony zgodnie z powyższą instrukcją w 7 osobnych próbówkach. Mix dobrze mieszamy i dozujemy po 21,5μl do gotowych stężeń magnezu. Można oczywiście sporządzić większą objętość magnezu na więcej reakcji gradientowych (np. mnożąc objętości z powyższego przepisu x10) i odmierzać po 3,5μl gdy najdzie nas taka potrzeba. Piśmiennictwo: Doświadczenia własne Kolejny krok genetycznej inżynierii Naukowcy z Massachusetts Institute of Technology (MIT) zaprojektowali urządzenie wykorzystujące nowoczesną technikę mikrostrumieniową, które pozwala na stopniowe otwarcie porów w błonie komórkowej i „wpuszczene” DNA do środka bez szkody dla komórki. Elektroporacja jest metodą powszechnie znaną w biotechnologii. Używa się jej w celu dostarczenia do komórek leków, białek oraz/lub DNA. Pozwala ona na przenikanie makrocząsteczek z przestrzeni międzykomórkowej do wnętrza komórek poprzez tworzenie kanałów pod wpływem pola elektromagnetycznego. Mechanizm działania elektroporacji nie został jednak wyczerpująco poznany. Wiadomo, że tylko właściwie dobrana wielkość pola otworzy pory i pozwoli na wprowadzenie molekuł do środka. Istnieje cienka granica pomiędzy warunkami pola elektomagnetycznego niszczącego komórki i nie wpływającego na nie w ogóle. Penetracja błony komórkowej przez pole elektryczne zależy także od warunków środowiska otaczającego komórkę. Naukowcy muszą więc również dobrać właściwy roztwór oraz ustalić sposób dostarczenia pola. Odpowiedni wybór parametrów może zająć miesiące a nawet lata. Obecnie badacze mogą pracować na wielu dostępnych systemach wykorzystujących elektroporację. Każdy z nich jest wyposażony w instrukcje określające unikalne warunki dla mniej więcej 100 różnych organizmów takich jak szczepy bakteryjne czy drożdże. Jest to wciąż mała namiastka tego, co jest w naturze. Proste urządzenie opracowane przez MIT może być zastosowane w każdej komórce, przyspieszając pierwszy krok w inżynierii genetycznej organizmu. Nowe urządzenie może znacząco skrócić czas potrzebny do ustalenia idealnych warunków elektroporacji. Zawiera ono zwężony w środku kanał utworzony dzięki zastosowaniu miękkiej litografii. Gdy do urządzenia przykładane jest pole elektryczne, geometria kanału powoduje wytworzenie różnych potencjałów elektrycznych, największego w najwęższym regionie kanału. Komórki bakteryjne są wprowadzane w kanał i stosowany jest marker fluorescencyjny. Po dostarczeniu impulsu elektrycznego komórki świecą dzięki uruchomieniu przepływu transbłonowego po przerwaniu błon komórkowych. Obliczane jest krytyczne pole elektryczne dla elektroporacji. Dzięki tej wiedzy minimalizuje się ciepło określane w dżulach oraz maksymalizuje się żywotność komórek. W ten sposób doskonale scharakteryzowano szczepy bakteryjne o dużym znaczeniu terapeutycznym i przemysłowym, takie jak Escherichia coli BL21, Corynebacterium glutamicum oraz Mycobacterium smegmatis. Zespół najpierw przeprowadził serię eksperymentów związanych z otwarciem porów celem wprowadzenia do komórek znacznika fluorescencyjnego, a następnie DNA kodującego oporność na antybiotyki. Wyniki eksperymentu zostały sprawdzone dzięki zastosowaniu popularnego testu oznaczania wrażliwości bakterii na bakteriofagi (ang. streak–test) – bakterie które przejęły DNA mogły się namnażać, co oznaczało sukces: DNA zostało wbudowane, a membrany ponownie zamknięte. Badania potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji immunologicznej Źródło pixabay, licencja CC0 Nowe urządzenie może znacznie poszerzyć możliwości inżynierii genetycznej i znaleźć zastosowanie w obszarach medycyny regeneracyjnej, terapii nowotworowej, szczepionek DNA czy przy produkcji leków. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Garcia PA. et al. Microfluidic Screening of Electric Fields for Electroporation. Scientific Reports, 19 Feb 2016. Oznaczanie genetycznych markerów nowotworów Rozwiązanie jednego z największych ograniczeń w badaniach nad genetyką nowotworów, jakim jest heterogeniczność próbek pobieranych z guzów nowotworowych, stało się możliwe dzięki wykorzystaniu innowacyjnej technologii nazwanej DEPArray™. Naukowcy z Silicon Biosystems we Włoszech zaprezentowali światu rewolucyjną metodę, która dzięki sekwencjonowaniu nowej generacji (ang. next generation sequencing, NGS) pozwala z niesłychaną precyzją izolować komórki nowotworowe guza z niewielkich próbek tkanek utrwalonych w parafinie (ang. formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE). Nowoczesna onkologia potrzebuje dogłębnego zrozumienia genetycznej charakterystyki nowotworów. Materiał genetyczny uzyskany z tkanek FFPE charakteryzuje się niską jakością z powodu dużego stopnia degradacji (zachodzi ona przed zakończeniem procesu utrwalania w formalinie). Co więcej, samo utrwalanie powoduje powstawanie wiązań krzyżowych pomiędzy cząsteczkami kwasów nukleinowych i białek oraz modyfikuje kowalencyjnie RNA. Utrudnia to izolację oraz ilościową i jakościową analizę materiału genetycznego. Tymczasem technologie NGS mają olbrzymi potencjał, ale ich dokładność jest ograniczona z powodu mieszaniny odmiennych typów komórek w różnych proporcjach, jaką stanowią próbki tkanek z biopsji. Samo NGS daje niejasny obraz profilu genetycznego guza, nie pozwalając na wykrycie mutacji somatycznych czy utraty heterozygotyczności komórek nowotworowych. Zróżnicowanie komórek nowotworowych samo w sobie jest ograniczeniem w identyfikacji czynników indukujących rozwój nowotworu. Jeżeli czynniki te występują w niewielkich ilościach, ich genetyczne warianty mogą nie zostać wykryte z powodu rozcieńczenia próbek. Problem heterogeniczności próbek częściowo rozwiązują technologie takie jak laserowe pozyskiwanie mikroskrawków (ang. laser capture microdissection) oraz sortowanie za pomocą cytometrii przepływowej (ang. FACS sorting). Niestety nadal ich dokładność i czystość uzyskiwanych próbek nie jest wystarczająca, aby efektywnie zastosować je w warunkach klinicznych. Ogranicza je rozmiar i jakość dostarczanych próbek. System sortowania komórek DEPArray™, bazując na zawartości DNA i markerach fenotypowych komórek, rozdziela je ze 100% dokładnością. Stało się możliwe sortowanie różnych populacji komórek: zrębu, guzów diploidalnych czy hiperploidalnych. Zasada działania DEPArray™ została również zademonstrowana na próbkach FFPE z niską zawartością komórek (5%). Próbki takie są trudne do właściwej analizy genetycznej i zwykle wiążą się ze złym rokowaniem dla pacjenta. Nowa technika umożliwiła określenie prawdziwie pozytywnych wariantów sekwencji, utraty heterozygotyczności oraz ustalenie liczby kopii tych wariantów. Badania potwierdzają, że liposomy Pad-PC-Pad nie wywołują reakcji immunologicznej Źródło pixabay, licencja CC0 Technologia DEPArray™ w połączeniu z analizą NGS jest metoda czułą i specyficzną, pozwalającą na uzyskanie z próbek FFPE wyczerpującej informacji genetycznej, bez względu na ploidię komórek i wielkość pobranej próbki. W związku z tym, metoda ta może zrewolucjonizować badania nad nowotworami i przyczynić się do opracowania nowego złotego standardu dokładności w onkologii. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Bolognesi C. et al. Digital Sorting of Pure Cell Populations Enables Unambiguous Genetic Analysis of Heterogeneous Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tumors by Next Generation Sequencing. Scientific Reports, 11 Feb 2016.
