QUANTA LiteTM dsDNA

QUANTA Lite® LKM-1 ELISA
708745
Do diagnostyki In Vitro
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
QUANTA Lite® LKM-1 jest to immunoenzymatyczny test (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał
LKM-1 w surowicy człowieka. Obecność przeciwciał LKM-1 można wykorzystać w powiązaniu z wynikami
klinicznymi oraz innymi testami laboratoryjnymi w celu wsparcia diagnozy autoagresyjnego zapalenia wątroby
typu 2.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Autoagresyjne zapalenie wątroby (AIH) jest heterogeniczną chorobą o nieznanej etiologii.1 Autoagresyjne
zapalenie wątroby typu 1 (martwicze AIH) jest częściej spotykanym typem AIH i charakteryzuje się
reakcyjnością wobec antygenów przeciwjądrowych (ANA), mięśnia gładkiego (SMA) oraz aktyny.
Autoagresyjne zapalenie wątroby typu 2 (AIH-2) charakteryzuje się obecnością przeciwciał mikrosomu (LKM1) wątroby/nerki, wykrywanych na skrawkach tkanki wątroby i nerki gryzoni za pomocą niebezpośredniej
immunofluorescencji. Reakcyjność LKM-1 charakteryzuje się zabarwieniem cytoplazmy hepatocytu oraz
proksymalnych (ale nie dystalnych) kanalików nerkowych. Pacjenci z chorobą AIH typu 2a to z reguły młode
kobiety, z poważną chorobą, z niskim poziomem IgA, z dobrą odpowiedzią na terapię immunosupresyjną oraz
z negatywnym wynikiem na wirusowe zapalenie wątroby C (HCV).1,2 Główny docelowy antygen przeciwciał
LKM-1 został zidentyfikowany jako cytochrom P450 2D6, mikrosomalne białko występujące w retikulum
endoplazmatycznym.3-6 Przeciwciała LKM-1 zostały stwierdzone u 8% pacjentów z przewlekłą infekcją
HCV.2,3,7-9 Epitopy uznawane przez surowicę od pacjentów z HCV różnią się od epitopów uznawanych przez
AIH-2 i mogą być autoprzeciwciałami wytwarzanymi podczas występowania przewlekłej infekcji HCV, a nie
prawdziwej choroby AIH typu 2.6,7,10,11 Z reguły pacjenci z pozytywnym wynikiem wobec LKM-1 i HCV są
starsi, częściej są to mężczyźni i najczęściej mają niższe poziomy przeciwciał LKM-1 niż pacjenci z AIH-2a.1,2
Pacjenci, którzy mają wynik pozytywny na HVC i pozytywny na LKM-1 mogą stwarzać dla lekarza trudną
sytuację, ponieważ leczenie HCV i AIH-2 bardzo się od siebie różni.9,11,12 Oprócz przeciwciał LKM-1, zostały
zidentyfikowane przeciwciała przeciwko cytochromowi P450 2C9 (LKM-2) powiązane z zapaleniem wątroby
wywołanym kwasem tienylowym oraz przeciwciała przeciwko transferazie glukoronosylu
urydynodwufosforanu (LKM-3), które zostały powiązane z infekcją zapalenia wątroby D.3 Przeciwciała
przeciwko rozpuszczalnemu antygenowi wątroby (SLA) lub antygenowi wątrobowo-trzustkowemu zostały
stwierdzone i niektórych pacjentów AIH, którzy mają negatywny wynik i mogą opisać inną podgrupę AIH.1
Zasada badania
Częściowo oczyszczony rekombinat ludzkiego cytochromu, o pełnej długości, P450 2D6 antygen jest
związany z dołkami polistyrenowej płytki mikrodołków pod warunkami, że zachowa antygen w jego natywnym
stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków
umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał przeciwko LKM-1 z unieruchomionym
antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego
enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG
znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do
mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych
enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc
intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i
porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków
kontrolnych.
1
Odczynniki
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte częściowo oczyszczonym rekombinatem antygenu
P450 2D6 ludzkiego cytochromu (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej
osuszacze
Negatywna kontrola ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez
ludzkich przeciwciał przeciwko LKM-1, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml
Słabo pozytywne LKM-1 ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy
ludzkiej przeciwko rekombinatowi ludzkiego cytochromu P450 2D6, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml
Wysoko pozytywne LKM-1 ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała surowicy
ludzkiej przeciwko rekombinatowi ludzkiego cytochromu P450 2D6, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml
Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka – zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną
TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml
Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x – zabarwienie czerwone, zawiera sól
fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć
w sekcji Metody.
Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka – zabarwienie niebieskie, zawiera
bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml
Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml
Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka – bezbarwny, 10 ml
Ostrzeżenia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w
rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka.
Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu
zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają
przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie
zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też
względu słabo pozytywną LKM-1 ELISA, wysoko pozytywną LKM-1 ELISA i kontrolę negatywną
ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny.13
Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w
przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z
ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli
do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie
dopuścić do gromadzenia się azydku.
Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być
toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych,
należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania,
spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub
kontaktu ze skórą i oczami.
Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać
wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z
kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być
toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych
przepisów w zakresie utylizacji odpadów.
2
Środki ostrożności
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych In Vitro.
Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować
osiągnięciem niespójnych wyników.
Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA
wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła.
Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi
urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w
stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest
potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w
akceptowalnych limitach.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową
odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność
płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy
trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga
staranności i precyzji.
Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.
Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i
osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania.
Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może
spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne
jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP.
Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem
lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych,
takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację
koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie
wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia.
Warunki przechowywania
1.
2.
3.
Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać. Odczynniki są
trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami.
Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce
foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2–8°C.
Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do
próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne
zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub
lipemicznej surowicy albo próbek.
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca
następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej
niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 28°C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy
zamrozić ją w temperaturze -20°C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą
zostać dobrze wymieszane.
3
Badanie
Dostarczone materiały
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Płytka z mikrodołkami LKM-1 ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem
1,2 ml wstępnie rozcieńczona kontrola negatywna ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej LKM-1 ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej LKM-1 ELISA
50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP
25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x
10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG
10 ml chromogenu TMB
10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
Mikropipety na 5, 100, 200–300 i 500 µl
Jednorazowe końcówki mikropipet
Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości
Woda destylowana lub dejonizowana
Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania
Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla
odczytów przy dwóch długościach fali)
Sposób przygotowania
Przed rozpoczęciem
1.
2.
3.
4.
Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26oC) i dobrze wymieszać.
Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do
płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie
przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml
koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte.
Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8oC.
Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl
rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od
przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej LKM-1 ELISA, wysoko pozytywnej LKM-1
ELISA i kontroli negatywnej ELISA.
Oznaczanie obecności lub braku LKM-1, stosując jednostki umowne wymaga dwóch dołków dla
każdego z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest
wykonanie duplikatów próbek.
Procedura badania
1.
2.
3.
WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE
DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20–26°C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w
uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i
dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną.
Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej LKM-1 ELISA, wysoko
pozytywnej ELISA LKM-1, kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od
pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej
powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki.
Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać 200–300 µl rozcieńczonego
buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję
jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na
materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby
całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję
odsysania, jak w przypadku dodawania próbki.
4
4.
5.
6.
7.
8.
Do każdego dołka dodać 100 µl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z
zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych.
Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO
ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM
WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w
etapie 2.
Etap płukania: Powtórzyć etap 3.
Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w
temperaturze pokojowej.
do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas
dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać
płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków.
Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej
godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością
fali może być długość 620 nm.
Kontrola jakości
1.
2.
3.
4.
Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek
należy testować wraz ze słabo pozytywnym LKM-1 ELISA, wysoko pozytywnym LKM-1 ELISA i
kontrolą negatywną ELISA.
Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna LKM-1 ELISA, wysoko pozytywna LKM-1 ELISA oraz
kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w
przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek.
Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub
krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne
można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze
≤ - 20°C.
Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe
kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako
nieważne i powinno zostać powtórzone.
a.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli LKM-1 ELISA musi być
większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej LKM-1 ELISA, która z kolei
musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA.
b.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko pozytywnej kontroli LKM-1 ELISA musi być
większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie
może przekroczyć 0,2.
c.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli LKM-1 ELISA musi być ponad
dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż 0,25.
d.
Kontrola negatywna ELISA i wysoko pozytywna LKM-1 ELISA mają za zadanie wykazać
ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Wysoko pozytywna kontrola LKM-1
ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania.
e.
Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie
CLSI (NCCLS) C24-A.
5
Obliczanie wyników
W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność
każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość
optyczną słabo pozytywnej LKM-1 ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do
słabo pozytywnej LKM-1 ELISA, którą można znaleźć na etykiecie.
Gęstość optyczna próbki
Wartość próbki =
x słabo pozytywna LKM-1 ELISA
(jednostki)
gęstość optyczna słabo pozytywnej LKM-1 ELISA (jednostki)
Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał
u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie
jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli
wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić seryjne badanie
próbek otrzymanych od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno
być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta.
Interpretacja wyników
Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w
populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium
powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji
pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako
negatywna, niejednoznaczna lub pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą.
Jednostki
Negatywna
<20,0
Niejednoznaczne
20,1 – 24,9
Pozytywne
>25
Niejednoznaczne próbki powinny zostać ponownie przebadane przed przedstawieniem wyników.
1.
Wynik pozytywny wskazuje obecność przeciwciał IgG przeciwko rekombinatowi ludzkiego P450 2D6 i
sugeruje możliwość występowania autoagresyjnego zapalenia wątroby typu 2.
2.
W przypadku próbek o niejednoznacznym poziomie LKM-1 IgG nie można ustalić stanu przeciwciał.
Jeśli wyniki nadal są niejednoznaczne po powtórzonym badaniu, wynik należy zaraportować jako
niejednoznaczny i/lub pobrać dodatkową próbkę.
3.
Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgG przeciwko LKM-1 lub że ich
poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania.
4.
W przypadku próbek o gęstości optycznej przewyższającej zakres odczytu czytnika płytek, można je
zaraportować jako takie, których najwyższą mierzalną wartość gęstości optycznej dzieli się przez
gęstość optyczną kontroli słabo pozytywnej i mnoży przez 25, lub można je rozcieńczyć, przebadać
ponownie i wyliczyć pożądaną wartość.
5.
Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: „Poniższe wyniki
otrzymano przy wykorzystaniu zestawu INOVA QUANTA Lite® LKM-1 ELISA. Nie można stosować
zamiennie wartości LKM-1 uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów.
„Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu
końcowego”.
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
Negatywny wynik LKM-1 nie wyklucza obecności autoagresyjnego zapalenia wątroby typu 2.
Negatywny wynik przeciwciał LKM-1 nie wyklucza obecności przeciwciał LKM-1, ponieważ stężenie
przeciwciał może być poniżej granicy wykrywania dla tego testu.
Pozytywny wynik testu wskazuje jedynie obecność przeciwciał przeciwko ludzkiemu rekombinatowi
cytochromu P450 2D6 i niekoniecznie wskazuje na obecność autoagresyjnego zapalenia wątroby
typu 2.
6
4.
5.
6.
7.
Zdiagnozowanie autoagresyjnego zapalenia wątroby typu 2 wymaga zebrania dokumentacji
dotyczącej danych demograficznych pacjenta, manifestacji klinicznej oraz innych badań
diagnostycznych.
Przeciwciała LKM-1 mogą być wykrywane u pacjentów w podobnej liczbie jako rezultat infekcji HCV i
mogą nie być rezultatem AIH-2. Pozytywne próbki LKM-1 powinny być przetestowane pod kątem
infekcji HCV.
Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami
serologicznymi.
Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica.
Spodziewane wartości
Występowanie autoagresyjnego zapalenia wątroby typu 2 zostało oszacowane jako 5–30 przypadków na
milion. Choroba nie jest zbyt powszechna w wieku 2–14 lat i częściej występuje u kobiet niż u mężczyzn
(8:1).14,15
Normalny zakres
Panel 194 próbek zebranych od 151 dorosłych i 43 dzieci został przebadany przy użyciu zestawu QUANTA
Lite® LKM-1 ELISA. Jedna próbka była niejednoznaczna/na granicy zakresu wyników (20,7 jednostki).
Pozostałe 193 próbki zostały zinterpretowane jako negatywne. Po wykluczeniu próbek niejednoznacznych
swoistość wyniosła 100% (193/193). Wartość średnia dla tej populacji wynosiła 6,3 jednostki, wartość
mediany wynosiła 5,7 jednostek, a najwyższa wartość wyniosła 20,7 jednostki. Zakres wiekowy osób wynosił
od 1 roku do 75 lat.
Charakterystyka swoista
Badania kliniczne
W ramach pierwszego badania przygotowano i przetestowana w zewnętrznej placówce klinicznej panel
składający się z 84 klinicznie zdefiniowanych próbek. Szczegóły przetestowanych próbek oraz wyniki badania
zostały podsumowane na rys. 1. Test QUANTA Lite® LKM-1 ELISA wykazał 100% (22/22) czułości w
przypadku próbek, które miały pozytywny wynik na autoagresyjne zapalenie wątroby typu 2, pozytywny wynik
na LKM-1 IFA oraz negatywny wynik na HCV. Niskie poziomy reakcyjności LKM-1 zostały stwierdzone u
pacjentów z pozytywnym wynikiem na HCV. Test QUANTA Lite® LKM-1 ELISA wykazał, że 70% (14/20)
wybranej grupy próbek LKM-1 IFA+/HCV+ miało wynik pozytywny w ramach QUANTA Lite® LKM-1 ELISA.
Test QUANTA Lite® LKM-1 ELISA był w 100% swoisty (34/34) w przypadku 34 próbek, które uzyskały wyniki
pozytywny na LKM-1 IFA, ale które były klinicznie pozytywne na AIH-2 i nie były pozytywne na HCV. Oprócz
tego 3 pacjentów z pozytywnym wynikiem halotanu na LKM-2 oraz 5 pacjentów na LKM miało negatywny
wynik w ramach QUANTA Lite® LKM-1 ELISA. Drugie zewnętrzne badanie objęło panel zawierający 4
udokumentowane próbki pacjentów z AIH-2 (w wieku 2, 2, 4 1/2 oraz 6 lat) oraz 41 innych próbek z
chorobami autoagresyjnymi i chorobami wątroby. Wszystkie 4 próbki AIH-2 zostały zinterpretowane jako
pozytywne. Trzy pozytywne próbki HCV miały wynik pozytywny dla LKM-1 ELISA oraz IFA, a jedna miała
wynik pozytywny tylko dla LKM ELISA. Informacje na temat innych przebadanych próbek można znaleźć w
punkcie „reakcyjność krzyżowa”.
7
Rys 1
QUANTA LITE LKM-1 ELISA
Evalutation z próbek klinicznych
140
120
100
U
N
I
T
S
80
60
40
20
0
LKM-1 Positive
Autoimmune
Hepatitis 2
pozytywny
HCV negatywnc
n=22
LKM-1
Pozytywny HCV
posytywny
n=20
LKM-1 Pozytywny
- NOT
Autoagresyjne
zapalenie wątroby 2
LKM-2
Pozytywny
n=3
LKMHalothane
pozytywny
n=5
- HCV Negatywnc
n=34
Table 1:
Badanie wewnętrzne poddało testom kompleksowy panel składający się z 79 złożonych próbek z
laboratoriów referencyjnych oraz z magazynów placówki. Wyniki badań wg testu QUANTA Lite® LKM-1
ELISA oraz LKM-1 IFA zostały podsumowane w tabeli 1.
Tabela 1:
n=79
LKM-1 IFA
POZ
NIEJED
NEG
QUANTA LITE®
POZ
41
1
1
LKM-1 ELISA
NIEJED
0
0
0
NEG
5
7
24
Zgodność całkowita = 91,5% (65/71) (wyniki niejednoznaczne zostały wykluczone)
Badanie reaktywności krzyżowej
Próbki od różnorodnych grup klinicznych zostały ocenione pod kątem potencjalnej reakcyjności krzyżowej
za pomocą QUANTA Lite® LKM-1 ELISA. Wyniki zostały podsumowane w tabeli 2.
Tabela 2: Badanie reaktywności krzyżowej
Grupa pacjentów
n=
HCV *
40
LKM-2
3
LKM-halotan
5
Rozpuszczalny antygen wątroby (SLA)
5
Autoagresyjne zapalenie wątroby typu 1
15
Choroba Leśniowskiego-Crohna
6
Ostre zapalenie jelita grubego
1
Marskość wątroby (jedna alkoholowa, jedna
nieokreślona)
2
Marskość wątroby pierwotna żółciowa
1
Krioglobulinemia
3
Niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby 1
Obstrukcyjne zapalenie trzustki
1
Celiakia
1
Twardzina
1
Choroba Addisona (adreal poz.)
1
8
Pozyt.
5**
0
0
0
0
0
0
Niejed.Neg
0
35
0
3
0
5
0
5
1
14
0
6
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1
3
1
1
1
1
1
Grupa pacjentów
n=
Pozyt.
Przeciwciała przeciwko komórkom wyspowym (ICA)2
0
Dekarboksylaza kwasu glutaminowego (GAD)
2
0
AMA
8
0
SMA
3
0
TPO
9
0
Sm
1
0
RNP
1
0
SS-A
1
0
SS-B
1
0
Scl-70
1
0
Jo-1
1
0
Rybosomalny P
1
0
Chromatyna
1
0
PCNA
1
0
ANA/DNA
9
0
Centromerowy
1
0
* Próbki pozytywne HCV (niewybrane dla reakcyjności LKM-1 IFA)
** 4/5 pozytywne dla LKM-1 IFA
Niejed.Neg
0
2
0
2
0
8
0
3
0
9
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
9
0
1
Precyzja i powtarzalność
Wyniki wewnątrz badania zostały ocenione na podstawie 12-krotnego testu 6 próbek, w tym negatywnej,
niejednoznacznej, pozytywnej na granicy, słabo pozytywnej, umiarkowanie pozytywnej i wysoko pozytywnej.
Wyniki zostały podsumowane w tabeli 3.
Tabela 3
Średnia
S,D,
C,V,%
Surowica 1
61,7
2,6
4,2
Surowica 2
13,5
0,8
5,8
Surowica 3
4,9
0,3
5,3
Surowica 4
12,9
0,4
3,2
Surowica 5
43,6
0,8
1,8
Surowica 6
66,2
2,8
4,3
Wyniki pomiędzy próbkami zostały ocenione poprzez 6-krotne przebadanie w ciągu 3 dni 10 próbek, w tym
negatywnej, słabo pozytywnej, umiarkowanie pozytywnej i wysoko pozytywnej. Przeprowadzono dwie serie
dziennie – jedną rano, a drugą po południu. Wyniki, które zostały podsumowane w tabeli 4, wykazują CV%
około 5% lub mniej w przypadku wszystkich próbek przy wartościach testu 5,5 lub powyżej.
Tabela 4
Średnia
S.D.
C.V.%
Surowica 1 Surowica 2 Surowica 3 Surowica 4 Surowica 5 Surowica 6 Surowica 7 Surowica 8 Surowica 9 Surowica 10
58,0
3,2
65,8
5,1
50,2
46,9
4,4
48,5
44,2
5,4
1,4
0,7
2,7
0,7
1,2
2,4
0,8
2,2
2,2
0,8
2,3
22,7
4,1
14,1
2,5
5,1
17,6
4,5
4,9
14,2
9
Powtarzalność pomiędzy laboratoriami została oceniona poprzez porównanie wyników losowo wybranych 20
elementów panelu w zewnętrznej klinice 2 oraz wyników uzyskanych wcześniej przez firmę INOVA
Diagnostics. Analiza regresji wykazała doskonałą zgodność z wartością R2 o wielkości 0,99.
Liniowość
Roztwory 3 próbek wykazały, że badanie wykazało dobrą liniowość w przypadku testowania roztworów od
1:50 do 1:51,200 (rys. 2).
Rys 2
10
11
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
McFarlane IG. The Relationship between autoimmune markers and different clinical syndromes in autoimmune
hepatitis. Gut 42: 599-602, 1998.
Manns MP. Liver/kidney microsomal autoantigens. In: Autoantibodies, eds: Peter JB and Shoenfeld Y. Elsevier.
pp 462-466, 1996.
Manns MP and Obermayer-Straub P. Cytochromes P450 and uridine triphosphate-glucoronosyltransferases:
model autoantigens to study drug-induced, virus-induced, and autoimmune liver disease. Hepatology
26(4):1054-1066,1997.
Zanger UM, Hauri HP,Loeper J, Homberg JC and Meyer UA. Antibodies against human cytochrome P450 dbl in
autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8256-8260,1988.
Manns MP, Johnson EF, Griffin KJ, Tan EM and Sullivan KF. Major antigen of liver kidney microsomal autoantibodies in idiopathic autoimmune hepatitis is cytochrome P450 dbl. J. Clin. Invest. 83:1066-1072,1989.
Gueguen M, Yamamoto AM, Bernhard O and Alvarez F. Anti-liver-kidney microsome antibody type 1 recognizes
human cytochrome P450 dbl. Biochem. Biophys. Res. Commun. 159:542-547, 1989.
Miyakawa H, Kitazawa E, Abe K, Kawaguchi N, Fuzikawa H, Kikuchi K, Kako M, Komatsu T, Hayashi N and
Kiyosawa K. Chronic hepatitis C associated with anti-liver/kidney microsome-1 antibody is not a subgroup of
autoimmune hepatitis. J. Gastroenterol. 32(6): 769-776, 1997.
Clifford BD, Donahue D, Smith S, Cable E, Luettig B and Manns MP. High prevalence of serological markers of
autoimmunity in patient with chronic hepatitis C. Hepatology 231:613-619, 1995.
Gregorio GV, Pensati P, Iorio R, Vegnente A, Mieli-Vergani G and Vergani D. Autoantibody prevalence in
children with liver disease due to chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Clin. Exp. Immunol. 112(3): 471-6,
1998.
Declos-Valee JC, Hajoui O, Yamamoto AM, Jacqz-Aigrin E and Alvarez F. Conformational epitopes on CYP2D6
are recognized by liver/kidney microsomal antibodies. Gastroenterology 108: 470-467, 1995.
Dalekos GN, Wedemeyer H, Obermayer-Straub P, Kayser A, Barut A, Frank H and Manns MP. Epitope
mapping of cytochrome P450 2D6 autoantigen in patients with chronic hepatitis C during alpha-interferon
treatment. J. Hepatol. 30(3):366-375, 1999.
Todros L, Saracco G, Durazzo M, Abate ML, Touscoz G, Scaglione L, Verme G and M Tissetto. Efficacy and
safety of interferon alfa therapy in chronic hepatitis C with autoantibodies to liver-kidney microsomes.
Hepatology 22:1374-1378, 1995.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of
Health, 2007, Fifth Edition.
Beaune P, Pessayre D, Dansette P, Mansuy D and Manns MP. Autoantibodies against cytochromes P450: a
role in human diseases. Adv. Pharmacol. 30:199-245, 1994.
Homberg JC, Abuaf N, Bernard O, Islam S, Alvarez F, Khalil SH, Poupon R, Darnis F, Levy VG, Grippon P, et
al. Chronic active hepatitis associated with antiliver/kidney microsome antibody type 1: a second type of
“autoimmune hepatitis.” Hepatology 7(6): 1333-9, 1987.
12
QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc.
Copyright 2012. Wszelkie prawa zastrzeżone©
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady):877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628745POL
Czerwiec 2012
Wersja 0
13