oznaczanie alkalicznej fosfatazy
Transkrypt
oznaczanie alkalicznej fosfatazy
FAKULTET - FIZJOLOGIA BAKTERII Koordynator - dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW ĆWICZENIE: OZNACZANIE ALKALICZNEJ FOSFATAZY Autor i główny prowadzący dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW Asysta: mgr Marta Piotrowska, mgr Rafał Ostrowski Wstęp teoretyczny Fosfatazy należą do enzymów z klasy hydrolaz i podklasy esteraz. Katalizują rozkład estrów fosforanowych. Do tej grupy enzymów zaliczamy: fosfomonoesterazy, fosfodiesterazy oraz polifosfatazy, zależnie od typu rozkładanego estru. Najliczniejszą grupę stanowią fosfomonoesterazy, które dzieli się na: kwaśne (optimum działania w pH-5) oraz zasadowe (optimum działania w pH - 7-8). Alkaliczna fosfataza Jej rola polega głównie na katalizowaniu defosforylacji różnych estrów fosforanowych, w trakcie reakcji enzymatycznej uwalniane są fosforany. Optymalnie działa w środowisku zasadowym. Synteza tego enzymu jest indukowana brakiem fosforanów w podłożu. Przestrzeń peryplazmatyczna u bakterii gramujemnych Przestrzenią peryplazmatyczną nazywamy obszar pomiędzy błoną cytoplazmatyczną a peptydoglikanem. Jest to miejsce, w którym występują liczne białka, w tym enzymatyczne, oraz oligosacharydy, przebiega tu wiele reakcji biochemicznych. Ze względu na pełnione funkcje, białka peryplazmatyczne można podzielić na 3 grupy: 1. Białka chroniące komórkę przed szkodliwymi czynnikami zewnętrznymi - do tej grupy należą m.in. enzymy degradujace antybiotyki beta-laktamowe i aminoglikozydowe. 2. Białka degradujące duże i trudno przechodzące przez błonę cytoplazmatyczną cząsteczki do produktów mniejszych, łatwiej przedostających się do cytoplazmy. Typowe enzymy tej grupy to: -amylaza degradująca amylozę i dekstryny do glukozy, fosfodiesteraza, fosfataza, nukleotydaza, karboksypeptydaza i inne. 3. Białka uczestniczące w transporcie do wnętrza komórki takich składników odżywczych jak: cukry, pepetydy, witaminy i jony nieorganiczne. niektóre białka z tej grupy pełnią również funkcje receptorowe w procesach chemotaksji. Metody uwalniania białek peryplazmatycznych Białka peryplazmy mogą zostać uwolnione z komórki metodą szoku osmotycznego, przez wytrząsanie z chloroformem oraz, z niektórych bakterii gramujemnych, przez cykl zamrażania i rozmrażania w ściśle określonych warunkach zmiany temperatury. Metodą bezpośrednią, uwalniającą wszystkie białka z przestrzeni peryplazmatycznej, jest sferoplastyzacja w obecności lizozymu i EDTA. Alkaliczna fosfataza Pseudomonas aeruginosa i niektóre enzymy Escherichia coli są łatwo uwalniane z peryplazmy przez przemycie komórek roztworem chlorku magnezu lub odpowiednimi buforami. Metoda szoku osmotycznego - zasada działania Komórki zawieszone w stężonym roztworze sacharozy z dodatkiem EDTA należy szybko przenieść do środowiska o niskiej sile osmotycznej (zmiana środowiska z hipertonicznego na hipotoniczny). Zmiany te powodują nacisk błony cytoplazmatycznej w kierunku błony zewnętrznej i uwolnienie białek peryplazmy do środowiska. Nie jest to metoda skuteczna w przypadku izolacji niektórych białek, np. peryplazmatycznej -laktamazy i innych białek 15 wielkocząsteczkowych. Wadą tej metody jest uwalnianie niektórych białek błony cytoplazmatycznej, co stanowi zanieczyszczenie frakcji peryplazmatycznej. peryplazma cytoplazma błona cytolazmatyczna ściana komórkowa + 20% sacharoza + 20 MM EDTA peryplazma błona cytolazmatyczna H20 ściana komórkowa cytoplazma + H2 0 peryplazma cytoplazma błona cytolazmatyczna ściana komórkowa Celem tego ćwiczenia jest indukcja i izolacja, metodą szoku osmotycznego, alkalicznej fosfatazy z komórek E. coli oraz oznaczenie aktywności tego enzymu. Wykonanie ćwiczenia 1. Przygotować hodowlę logarytmiczną (inoculum 1:20, 50 ml), A600 – 0,8, Escherichia coli na podłożu: - niskofosforanowym (skład poniżej) - Davisa uzupełnionym glukozą 2. Hodowle (4 x 2 ml) odwirować (12 tys. rpm, 5 min) w probówkach typu Eppendofr z wykorzystaniem mikrowirówki typu Eppendorf. 3. Osad ze wszystkich probówek zawiesić w 1 ml buforu: 50 mM Tris/HCl o pH 7,4, zawierającego 30 mM NaCl i przenieść do jednej probówki typu Eppendorf, a następnie ponownie odwirować jw. 4. Po odwirowaniu osad zawiesić w 0,3 ml buforu: 50 mM Tris/HCl o pH=7,4, zawierającego 20% sacharozę, następnie dodać 50 l 20 mM EDTA o pH=8,0. 5. Próby wytrząsać na worteksie ok. 5-10 min. 6. Odwirować jw. 16 7. Osad zawiesić w 0,5 ml zimnej! wody destylowanej i ponownie wytrząsać na worteksie ok. 5-10 min. 8. Odwirować jw. 9. Supernatant jest źródłem enzymów – m.in. alkalicznej fosfatazy WYKONANIE OZNACZENIA Próba badana: Zmieszać 0,5 ml supernatantu i 0,5 ml substratu dla alkalicznej fosfatazy (fosforan pnitrofenolu*). Próbę inkubować 5-20 min w temp. 37oC. Kontrola: Zamiast 0,5 ml supernatantu dodać wodę destylowaną lub bufor Wynikiem dodatnim jest pojawienie się żółtego zabarwienia (nitrofenol), które świadczy o odszczepieniu grupy fosforanowej od fosforanu p-nitrofenolu w wyniku aktywności alkalicznej fosfatazy. *UWAGA! Roztwór (0,01 M) fosforanu p-nitrofenolu należy przygotować bezpośrednio przed ćwiczeniami z wykorzystaniem 0,04 M buforu glicynowego o pH=10,5. Skład podłoża niskofosforanowego, pH=7,4: Tris NaCl KCl Na2SO4 MgCl2 CaCl2 Bacto-peptone Woda dest. 14,53 g 4,67 g 1,49 g 0,425 g 0,2 g 0,01 g 5,0 g - do 1000 ml Literatura uzupełniająca: 1.Wykłady z Fizjologii Bakterii. Popowska M., Korsak D. 2.Biologia molekularna bakterii pod redakcją Baj J., Markiewicz Z., PWN 2006, 2015 (nowe wydanie) 3. Struktura i funkcje osłon bakteryjnych. Markiewicz Z., PWN 1993 4. Markiewicz Z., Popowska M. 2011. An Update on Some Structural Aspects of the Mighty Miniwall Pol. J. Microbiol. 60(3):181-186 17