Dodatni BTA — choroba hemolityczna noworodka, ostry i opóźniony

Dodatni BTA — choroba hemolityczna noworodka, ostry i opóźniony

Podstawy cytometrii przepływowej
– materiały do nauki
Jeżeli chcecie pogłębić Waszą znajomość podstaw cytometrii
przepływowej, zapraszamy do przeczytania naszego artykułu oraz
obejrzenia kilku bardzo fajnych filmów, które przybliżą Wam podstawy
metody oraz analizy danych. Jest to bardzo cenna pomoc przy
przygotowaniu
do
egzaminu
czy
kolokwium.
https://www.youtube.com/watch?v=2P7YsJ0Zkio
https://www.youtube.com/watch?v=sfWWxFBltpQ
https://www.youtube.com/watch?v=ccR5snuCE80
Dodatni
BTA
—
choroba
hemolityczna noworodka, ostry i
opóźniony odczyn hemolityczny
Bezpośredni test antyglobulinowy (BTA, ang. direct antiglobulin test,
DAT) stał się podstawowym badaniem w diagnozowaniu reakcji
poprzetoczeniowej, choroby hemolitycznej noworodka (ang. haemolytic
disease of the fetus and newborn, HDFN) i niedokrwistości
autoimmunohemolitycznej (ang. autoimmune haemolytic anemia, AIHA).
BTA oparty jest na zjawisku aglutynacji krwinek czerwonych, które mają na swojej
powierzchni cząsteczki IgG lub C3 w wyniku reakcji z przeciwciałami in vivo. Po
dodaniu odczynnika antyglobulinowego uwidacznia się reakcja aglutynacji.
W przypadku techniki probówkowej do wykonania testu potrzebne są gęste
krwinki 4-krotnie przemyte dużą objętością roztworu NaCl o temperaturze 4 –
8°C, z których sporządza 3 – 4% zawiesinę. Do probówki przenosi się 2 krople
zawiesiny, wiruje i dokładnie usuwa nasącz. Po dodaniu 2 kropli odczynnika
antyglobulinowego należy materiał odwirować. Po tej czynności należy delikatnie
wstrząsnąć osad krwinek i obserwować obecność aglutynatów.
BTA należy interpretować porównując wyniki do kontroli dodatniej i ujemnej,
wykonanych przy użyciu krwinek opłaszczonych przeciwciałami anty-D. W
przypadku dodatniej autokontroli można podejrzewać AIHA, HDFN oraz
powikłania poprzetoczeniowe.
Wykonanie BTA techniką mikrokolumnową wymaga małego nakładu energii i
technicznie jest dość łatwe.
Wśród przyczyn dodatniego wyniku BTA można wymienić:
— HDFN
— AHTR (ostry odczyn hemolityczny, ang. acute hemolytic transfusion reaction)
— DHTR (opóźniony odczyn hemolityczny, ang. delayed hemolytic transfusion
reaction)
— biernie nabyte przeciwciała
— limfocyty pasażerskie
— niespecyficzne wiązanie IgG
— dziedziczenie
— AIHA
— leki
— aktywację komplementu
Choroba hemolityczna noworodka
HDFN jest to zespół objawów klinicznych rozwijających się u noworodka lub płodu
w wyniku konfliktu matczyno – płodowego. Krwinki czerwone płodu mogą dostać
się do krwiobiegu matki w czasie porodu, poronienia czy w końcowym okresie
ciąży. Po przedostaniu się krwinek RhD-dodatnich do krwiobiegu matki RhDujemnej jej organizm zaczyna wytwarzać przeciwciała przeciw antygenowi D
obecnemu na erytrocytach dziecka. Odpowiedź pierwotna trwa nawet do kilku
miesięcy, stąd też po tym czasie w surowicy matki pojawiają się alloprzeciwciała
odpornościowe klasy IgG. Przeciwciała IgG mają zdolność przenikania bariery
łożyskowej w następnych ciążach. W przypadku płodu RhD-dodatniego
przeciwciała IgG matki niszczą jego krwinki czerwone prowadząc do głębokiej
niedokrwistości. Po porodzie nadal trwa niszczenie krwinek czerwonych dziecka,
co powoduje szybki wzrost poziomu bilirubiny we krwi. Kiedy stężenie bilirubiny
przekroczy próg bariery krew-mózg, może dojść do uszkodzenia mózgu
noworodka a nawet śmierci.
W HDFN dochodzi do hemolizy w wyniku wiązania się matczynych przeciwciał z
antygenem na krwinkach czerwonych dziecka i przy łączeniu się fragmentu Fc
przeciwciała z receptorem na makrofagach, znajdujących się w śledzionie płodu.
Hemoliza wykazuje zależność stopnia jej nasilenia od podklasy przeciwciał IgG
(silna hemoliza przy IgG1 i IgG3), miana przeciwciał oraz ekspresji antygenów na
powierzchni erytrocytów. Występowanie choroby hemolitycznej noworodka
zostało zminimalizowane dzięki wykonywaniu podstawowych badań
diagnostycznych w czasie ciąży i po porodzie oraz profilaktyce z wykorzystaniem
immunoglobuliny anty-D.
Należy pamiętać, że konflikt serologiczny oraz choroba hemolityczna noworodków
mogą dotyczyć innych antygenów niż antygen D. Wszystkie przeciwciała z układu
Rh mają potencjalny wpływ na HTR (eng. hemolytic transfusion reaction) i HDFN.
Przy czym przeciwciała anty-c są najważniejsze zaraz po anty-D, występując
7/10000 porodów i wywołując HDFN, natomiast przeciwciała anty-C, anty-E oraz
anty-e rzadko wywołują HDFN.
Konflikt serologiczny może także wystąpić w innych układach grupowych
przykładowo z powodu przeciwciał anty-K z układu Kell, anty-Fya z układu Duffy
czy anty-s z układu MNS. Wyjątkowo niebezpieczne są przeciwciała anty-K klasy
IgG działając supresyjnie na erytropoezę. W tym przypadku statystyki mówią o
tym, że 1/1000 badanych kobiet wytwarza te przeciwciała, 1/20000 ciąż występuje
HDFN, 1/600000 porodów występuje zgon płodu.
HDFN może mieć podłoże związane z brakiem zgodności w układzie ABO. U matki
z grupą krwi O może dojść do konfliktu matczyno-płodowego z dzieckiem grupy A
lub B, gdy kobieta wytworzy przeciwciała anty-A lub anty-B klasy IgG. Konflikt ten
jednak zazwyczaj nie zagraża płodowi, gdyż antygeny A i B osiągają prawidłową
ekspresję w okresie okołoporodowym lub po porodzie. HDFN występuje już w
pierwszej ciąży i jeżeli się rozwinie, ma często łagodny przebieg. Statystycznie w
1/150 porodów pojawia się patologiczna żółtaczka, 1/3000 porodów ciężka postać
HDFN i konieczność transfuzji wymiennej. Podczas poszukiwania przeciwciał
odpornościowych anty-A lub anty-B w surowicy matki należy pamiętać, że nie
wykrycie przeciwciał IgG bezpośrednio po porodzie nie wyklucza HDFN.
Reakcje poprzetoczeniowe
Reakcje poprzetoczeniowe stanowią różnorodną grupę niekorzystnych reakcji na
przetoczenie składników krwi, pojawiając się zazwyczaj w trakcie transfuzji, lub w
krótkim czasie po jej zakończeniu. Istnieje wiele podziałów odczynów
poprzetoczeniowych. W tej pracy zostanie przytoczony podział według AABB.
Reakcje poprzetoczeniowe mogą być wczesne (w trakcie lub do 24 godzin po
przetoczeniu) i opóźnione (po 24 godzinach od przetoczenia).
Reakcje wczesne można podzielić na immunologiczne (ostry odczyn hemolityczny,
niehemolityczny odczyn gorączkowy, pokrzywka, reakcja anafilaktyczna, ostre
poprzetoczeniowe uszkodzenie płuc -TRALI) oraz nieimmunologiczne (posocznica
poprzetoczeniowa, hipotensja związana ze stosowaniem inhibitorów ACE,
przeciążenie krążenia, hemoliza nieimmunologiczna, zator powietrzny,
hipokalcemia, hipotermia).
Reakcje późne można podzielić na immunologiczne (alloimmunizacja do
antygenów krwinek czerwonych, białych, płytkowych lub białek osocza, opóźniony
odczyn hemolityczny, poprzetoczeniowa choroba „przeszczep przeciw biorcy”
(GvHD, małopłytkowa plamica poprzetoczeniowa, immunomodulacja) oraz
nieimmunologiczne (przeciążenie żelazem).
AHTR należy do wczesnych immunologiczmych reakcji poprzetoczeniowych.
Przyczyną jego wystąpienia może być przetoczenie jednostek o nieprawidłowej
grupie krwi czyli niezgodność w zakresie antygenów krwinek czerwonych w
układzie ABO i antygenie D z układu Rh. Przykładem może być przetoczenie 2
jednostek koncentratu krwinek czerwonych grupy A pacjentowi z grupą O.
Odczyn objawia się dreszczami, gorączką, hemoglobinemią, hemoglobinurią,
hipotensją, niewydolnością nerek ze skąpomoczem, DIC, bólem pleców, bólem w
miejscu wkłucia, niepokojem. Istnieją jednak działania pozwalające na uniknięcie
wystąpienia problemu poprzez eliminację pomyłek przy przetoczeniu.
DHTR należy do opóźnionych reakcji poprzetoczeniowych. Może do niego dojść u
osób uczulonych poprzednimi przetoczeniami lub ciążami. Przyczyną jego
wystąpienia jest odpowiedź anamnestyczna na antygeny krwinek czerwonych.
Odczyn objawia się gorączką, obniżeniem stężenia hemoglobiny, zażółceniem
skóry oraz obecnością przeciwciał. DHTR pojawia się zazwyczaj między 3 a 21
dniem po transfuzji krwi zgodnej serologicznie. W takim przypadku ważna jest
identyfikacja wytworzonych przeciwciał i przetaczanie odpowiednio dobranej
krwi. W przypadku immunizacji w przeszłości, dotyczącej zwykle układów innych
niż ABO, kiedy poziom przeciwciał obniży się poniżej progowego, próba krzyżowa
będzie ujemna. Natomiast przy ponownym przetoczeniu powstanie odpowiedź
wtórna i przetoczone krwinki ulegną hemolizie pozanaczyniowej w śledzionie.
Przyczyn dodatniego bezpośredniego testu antyglobulinowego jest wiele.
Choroba hemolityczna noworodka oraz odczyny poprzetoczeniowe mogą
być niebezpieczne nie tylko dla zdrowia ale i dla życia. To uzmysławia nam
istotę wykonywania BTA.
mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny
Opracowano na postawie:
Kurs doskonalący dla diagnostów ‘Immunologia Krwinki czerwonej – aspekt
teoretyczny, diagnostyczny i kliniczny’. RCKiK, Katowice, 2010.
Daniels G., Bromilow I. Essential guide to blood groups. Blackwell Publishing,
Oxford, 2007.
Transfusion Science Course. DiaMed GmbH Switzerland, Cressier sur Morat,
April 2010
Protokół FISH na EGFR
W jaki sposób wykonać FISH? Do analizy techniką fluorescencyjnej
hybrydyzacji in situ (ang. Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)
wykorzystujemy w naszym laboratorium zatopione w parafinie fragmenty
tkanki. Tkanki kroimy cienko (5 mikronów) i poddajemy procedurze
odparafinowania w ksylenie, a następnie trawimy i utrwalamy jądra
komórkowe. Czasy trawienia (25 lub 30 minut) dobieramy w zależności od
preparatu tak, aby uzyskać dobrą jakość hybrydyzacji, ale bez
nadmiernego uszkodzenia jąder komórkowych.
Na tak przygotowane preparaty nakładamy sondę i po pięciominutowej
denaturacji DNA przeprowadzamy hybrydyzację przez 21 godzin w
hybrydyzatorze (u nas stoi tani, całkiem przyzwoity MP16 Genos-Hiperon, Polska)
w 37°C.
Następnego dnia nadmiar niezhybrydyzowanej sondy odpłukujemy, a jądra
komórkowe uwidoczniamy dzięki zastosowaniu barwnika DAPI – specyficznego dla
DNA, barwiącego jądra komórkowe. Preparaty obserwujemy pod mikroskopem
fluorescencyjnym
Dokładna procedura stosowanej metody zamieszczona jest poniżej:
Odparafinowanie tkanek
1. Preparaty umieścić w ksylenie I na 10 minut.
2. Przenieść do ksylenu II na 10 minut.
3. Umieścić w etanolu 100% na 5 minut – 2x.
4. Przenieść do szeregu etanolowego: 95%, 80%, 70% po 2 minuty, po czym
wysuszyć.
Przygotowanie – procedury poprzedzające trawienie:
5. Preparaty umieścić w 0,2N HCl na 20 minut.
6. Płukać w wodzie destylowanej przez 3 minuty.
7. Płukać w Wash Buffer przez 3 minuty.
8. Przenieść do Pretreatment Solution o temp. 80°C na 30 minut.
9. Płukać w wodzie destylowanej przez 1 minutę (delikatnie).
10. Płukać w Wash Buffer przez 5 minut – 2x.
11. W międzyczasie rozpuścić proteazę (25mg, gotowy proszek) w Protease Buffer
(37°C).
Trawienie proteazą
12. Preparaty wyjąć z Wash Buffer, odsączyć nadmiar buforu i wysuszyć.
13. Trawić w roztworze proteazy w 37°C przez 25-30 minut.
14. Płukać w Wash Buffer przez 5 minut – 2x, po czym wysuszyć na powietrzu.
Hybrydyzacja
15. Na preparaty nałożyć po 10 ul sondy. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym
(22x22mm) i zakleić.
16. Po wysuszeniu kleju preparaty umieścić w hybrydyzatorze.
Program: denaturacja (72°C,5 minut), hybrydyzacja: (37°C, 21 godzin).
Płukanie po hybrydyzacji (na następny dzień)
17. Preparaty zanurzyć na około 10-15s w Post Hybridization Buffer w
temperaturze pokojowej, po
czym usunąć szkiełko nakrywkowe.
18. Preparaty umieścić w Post Hybridization Buffer w 72°C na 2 minuty.
19. Po wysuszeniu nałożyć po 10 ul DAPI i przykryć szkiełkami nakrywkowymi.
Preparaty należy przechowywać w ciemności, w -20°C.
W badaniu genu EGFR metodą FISH my używamy sondy Vysis LSI EGFR (Abbott
Molecular) komplementarną do regionu 300kb chromosomu 7, obejmującego całą
sekwencję genu EGFR. Sonda jest wyznakowana barwnikiem Spectrum Orange,
który daje w mikroskopie fluorescencyjnym sygnał pomarańczowy. Dodatkowa
kontrolna sonda CEP7 wiąże się z alfa satelitarnym DNA w rejonie
centromerowym chromosomu 7 (7p11.1-q11.1), na którym zlokalizowany jest
gen EGFR. Dzięki barwnikowi Spectrum Green sonda ta świeci na zielono.
Pozwalało to na zweryfikowanie otrzymanego sygnału i wykluczenie potencjalnych
artefaktów. Obie sondy znajdują się w dostarczonym od producenta i gotowym do
użycia buforze hybrydyzacyjnym.
Przygotowane preparaty oglądamy pod mikroskopem fluorescencyjnym (Leica) i
sprawdzamy ilość sygnałów pomarańczowych i zielonych w poszczególnych
komórkach. Zliczanie sygnałów w pojedynczych komórkach jest możliwe dzięki
dodatkowemu wybarwieniu jąder specyficznym dla DNA barwnikiem DAPI
(niebieski). W przypadku prawidłowej liczby kopii genu EGFR i chromosomu 7
obserwuje się dwa pomarańczowe i dwa zielone punkty. Z kolei obecność trzech
lub więcej sygnałów pomarańczowych wskazuje na zwiększoną liczbę kopii genu
przy zachowaniu prawidłowej liczby chromosomów 7.
M.Z.
Piśmiennictwo:
Własne doświadczenie zawodowe
Gravity flow – krok naprzód w
dziedzinie izolacji DNA
Grawitację odczuwamy na co dzień. Jest ona zjawiskiem tak oczywistym i
powszechnym, że nie zastanawiamy się nawet nad jej istnieniem.
Naukowcy z firmy A&A Biotechnology postanowili skorzystać z siły
grawitacji aby znacznie uprościć i przyspieszyć proces izolacji DNA.
Jak to działa?
Tradycyjne metody wykorzystujące różnego rodzaju złoża do izolacji kwasów
nukleinowych wymagają specjalnych urządzeń takich jak: wirówki, pompy
próżniowe lub generatory pola magnetycznego. Urządzenia te są niezbędne do
wytworzenia sił napędzających kolejne etapy izolacji. Metoda przepływu
grawitacyjnego (Gravity flow) opracowana przez A&A Biotechnology korzysta
jedynie z naturalnej siły grawitacji i zjawisk kapilarnych. Dzięki specjalnie
opracowanej membranie jonowymiennej i probówce odbierającej możliwy jest
swobodny przepływ roztworów i elucja wyizolowanego DNA.
Metoda Gravity flow.
Specjalnie opracowana membrana i probówka lub płytka odbierająca pozwala na
swobodny przepływ roztworów pod wpływem siły grawitacji. Tak zaprojektowany
układ pozwala zredukować do minimum wszelkie czynności manualne oraz
potrzebę stosowania dodatkowych urządzeń. Dzięki temu metoda jest wyjątkowo
prosta, szybka i płynna.
Dodawanie i przepływ kolejnych roztworów w metodzie Gravity flow przebiega
płynnie, bez potrzeby wirowania i wymiany probówek odbierających.
Porównanie izolacji DNA metodą wirówkową oraz Gravity flow
Ilość czynności manualnych potrzebnych do przeprowadzenia izolacji metodą
grawitacyjną w porównaniu do metody wirówkowej jest znacznie mniejsza.
Gravity flow na żywo
Manualna izolacja DNA metodą Gravity flow.
Izolacja DNA metodą Gravity flow z wykorzystaniem Stacji Pipetującej
epMotion®.
Cztery powody, dla których warto izolować DNA metodą Gravity flow.
1. Wyjątkowa prostota, szybkość i płynność procedury
Po przeprowadzeniu lizy do izolacji potrzebny jest jedynie statyw i pipeta. Aż do
momentu elucji reszta czynności polega jedynie na dodawaniu kolejnych
roztworów. Jest to najprostsze i bardzo wygodne dla każdego rozwiązanie,
niezwykle pomocne do celów dydaktycznych oraz dla osób zabezpieczających
próbki poza laboratorium np.próbki środowiskowe. Wszystkie kroki izolacji, aż do
samej elucji odbywają się z wykorzystaniem jednej probówki odbierającej. To
znacznie zmniejsza ilość czynności manualnych i tym samym okazji do popełnienia
pomyłki lub kontaminacji próbek. Mniejsza ilość probówek to także mniejsza ilość
plastikowych odpadów.
2. Elastyczność
Metoda Gravity flow uniezależnia nas od planowania i oczekiwania na zajęte
urządzenia laboratoryjne. Kolejne etapy izolacji nie wymagają nadzoru, a w razie
potrzeby można robić pomiędzy nimi przerwy.
3. Większa wydajność
W porównaniu do innych metod izolacji, metoda Gravity flow pozwala na
uzyskanie do 50 % więcej czystego DNA z tej samej ilości materiału.
4. Łatwość automatyzacji
Z uwagi na wyjątkowo nieskomplikowaną procedurę i małą ilość kroków, metoda
Gravity flow jest idealna do zastosowania w wielu, nawet najprostszych modelach
urządzeń typu liquid handler, na przykład w formacie płytek 96.
Właściwy czas, żeby się przekonać
Firma A&A Biotechnology do końca roku ustala 40 % rabat na wszystkie
swoje zestawy do izolacji DNA metodą grawitacyjną. Ponadto oferujemy
darmowe zestawy demonstracyjne oraz nagrody za wypróbowanie tej
innowacyjnej metody i podzielenie się z nami swoją opinią. Więcej na
www.aabiot.com/gravity Zapraszamy!
Labowe „know-how” — rozdział
białek SDS-PAGE (Schagger & von
Jagow)
Przedstawiamy sprawdzony przepis na elektroforezę białek w żelu
poliakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności SDS (SDSPAGE) w systemie Schagger & von Jagow.
Używane bufory
Bufor katodowy 5x (na 1 L):
61 g Tris
89,5 g tricyna
5,0 g SDS
nie korygować pH
Bufor anodowy 5x (na 1 L):
0,5 M
0,5 M
0,5%
121,1 g Tris-HCl
1M
pH 8.9
doprowadź do odpowiedniego pH stosując 10 M HCl
Roztwory do polimeryzacji żelu poliakrylamidowego
Bufor do żelu (na 100 ml):
36,35 g Tris base
0,3 g SDS
3M
0,3%
pH 8.45
Akrylamid/bis do białek, 5-100 kDa (na 100 ml):
49,5% T, 3% C
48 g akrylamidu
1,5 g N,N’-metylenobisakrylamidu
Akrylamid/bis do peptydów (na 50 ml):
49,5% T, 6% C
23,25 g akrylamidu
1,5 g N,N’-metylenobisakrylamidu
Uwaga! Roztwory akrylamidu przefiltruj przed użyciem i przechowuj w lodówce w
ciemnej butelce.
Bufor do próbek (1:2):
2,0 ml 0,5 M Tris pH 6.8
1,6 ml glicerolu
3,2 ml 10% SDS
1,2 ml dH2O
na oko CBB G-250 lub bromofenol blue
+ 37,4 ul na 0,5 ml buforu b-merkaptoetanolu
lub + 50 mg/ml DTT
Bufor rozporcjuj i przechowuj w -20 st.
10% APS
1 g nadsiarczanu amonu rozpuść w 9 ml dH2O
Rozporcjuj i przechowuj w -20 st.
Po rozmrożeniu resztę wyrzuć!
Skład żeli poliakrylamidowych (na 2 lub 4 żele)
Składniki
(dodawaj w tej
kolejności!)
Żel rozdzielający
(10%)
Żel zagęszczający
(4%)
dH2O
4,86 ml
9,72 ml
8,325 ml
16,65 ml
Bufor do żelu
5,00 ml
10,0 ml
3,1 ml
6,2 ml
Akrylamid/bis
3,05 ml
6,1 ml
1 ml
2 ml
Glicerol bezw.
2,00 ml
4,00 ml
–
–
TEMED
7,5 µl
15 µl
7,5 µl
15 µl
APS
75 µl
150 µl
75 µl
150 µl
obj. końcowa
15 ml
30 ml
12,5 ml
25 ml
Uwagi:
— przy pracy z akrylamidem zawsze używaj rękawiczek (nitrylowych)!
— roztwór TEMED ma bardzo nieprzyjemny zapach — dodawaj go pod
dygestorium
— jeśli chcesz, by żel szybciej spolimeryzował wstaw go do ciepłego
pomieszczenia (37 st.) lub oświetl go mocno.
— upewnij się, że bufor katodowy nie wypływa – w przeciwnym wypadku rozdział
się zatrzyma
— jeśli chcesz osiągnąć bardzo dokładny rozdział białek, prowadź elektroforezę
przy niskim napięciu (40 V przez żel zagęszczający i 60 V przez żel rozdzielający)
AM
Protokół – odparafinowanie tkanek
na szkiełku przed FISH
Odparafinowanie tkanek przed FISH
1. Preparaty umieścić w ksylenie I na 10 minut.
2. Przenieść do ksylenu II na 10 minut.
3. Umieścić w etanolu 100% na 5 minut – 2x.
4. Przenieść do szeregu etanolowego: 95%, 80%, 70% po 2 minuty, po czym
wysuszyć.
Protokół – srebrzenie żeli MDE
Srebrzenie żelu MDE
Przepis ten pozwala uzyskać elegancki, niezabrązowiony żel MDE.
Żele te w metodzie SSCP służą do detekcji mutacji.
Po zakończonej elektroforezie żel można poddać srebrzeniu w celu uwidocznienia
uzyskanych prążków. Proces barwienia DNA srebrem przebiega w kilku etapach.
Pierwszy etap to utrwalanie polegające na odwodnieniu żelu, np. w roztworze
etanolu.
Następnie żel traktuje się kwas azotowym, który ma na celu utrwalenie obrazu
prążków na żelu. Kwas azotowy zapobiega dyfuzji cząsteczek kwasów
nukleinowych z żelu oraz pomaga w pozbyciu się i neutralizacji niepożądanych
odczynników (np. mocznika czy buforu).
Kolejny etap to właściwe barwienie srebrem, po którym następuje wywoływanie.
Podczas wywoływania dochodzi do redukcji srebra za pomocą formaldehydu, a
węglan sodu zapewnia odpowiednie środowisko reakcji.
Związane z DNA zredukowane srebro przyjmuje brązowe zabarwienie, co pozwala
na uwidocznienie badanych prążków. Ostatnim etapem jest zatrzymanie reakcji
redukcji poprzez obniżenie pH, stosując np. kwas octowy.
Tak wysrebrzone
przechowywanie.
żele poddaje się dodatkowo suszeniu, co ułatwia ich
Procedurę srebrzenia żelu MDE zamieszczono poniżej:
1. Żele przenieść do kuwety z 10% etanolem umieszczonej na kołysce na 5 minut.
2. Po zlaniu etanolu wlać do kuwety 1% kwas azotowy na 3 minuty.
3. Przepłukać wodą dejonizowaną przez 1 minutę.
4. Żele umieścić w 0,012M azotanie srebra i płukać 20 minut w ciemności.
5. W międzyczasie przygotować 2 litry 0,28M węglanu sodu.
6. Żele przepłukać wodą dejonizowaną przez 1 minutę.
7. Żele zanurzyć w 0,5 litra węglanu sodu na kilka sekund (poczekać aż węglan
zbrązowieje)
8. Do reszty węglanu dodać formalinę buforowaną 10% (2835μl na 1,5 litra
węglanu sodu).
9. Żele płukać węglanem z formaliną (kilka razy – wlewać około 0,5 litra węglanu,
po czym zlewać, gdy się zaczerni i dodawać kolejną porcje, dopóki nie pojawią się
prążki – około 15 minut).
10. Reakcję zatrzymać 10% kwasem octowym – 2 minuty.
11. Płukać w wodzie około 1 minutę.
12. Żele przenieść na przezroczysta folię np. spożywczą i i przykryć bibułą
filtracyjną Whatmana.
Żele suszyć w suszarce do żeli – my używamy Gel Dryer (Biorad) podłączonej do
pompy próżniowej (u nas jest Hydro Tech, Biorad) przez 45 minut w temperaturze
85°C.
Real-Time PCR (IV): Pomiar
względny i bezwzględny ilości
kopii
Ilościowy PCR znajduje zastosowanie w różnych sytuacjach: pozwala
oszacować ilość kopii matrycy, porównać kilka różnych próbek pod
względem różnic w ilości kopii albo orzec o zmianie ilości cząsteczek
matrycy w czasie. Pierwsze zastosowanie wymaga innej strategii
postępowania niż dwa kolejne: możemy tu mówić o ilościowaniu
bezwzględnym i względnym. Co wyróżnia oba podejścia i gdzie konkretnie
maja zastosowanie?
1. Co decyduje o przyjętej formie pomiaru ilości kopii?
Decyzja o sposobie pomiaru jest podyktowana zastosowaniem wykonywanego
przez nas oznaczenia. Pomiar bezwzględnej liczby kopii jest stosowany w sytuacji,
gdy zależy nam nie tylko na określeniu zmian w ilościach produktu np. w czasie
kilku eksperymentów, czy też na wykazaniu różnic w ekspresji genu pomiędzy
próbami, ale także na konkretnej, bezwzględnej wartości liczbowej. Jest to
trudniejsze, gdyż wymagane jest wybranie standardów o ściśle określonej ilości
kopii i bardzo zbliżonej kinetyce reakcji co próbka badana. Oznaczenia
bezwzględne wykonywane są dlatego rzadziej, służą np. do: szacowania ilości
mikroorganizmów w żywności, pomiaru ilości GMO w produktach spożywczych
czy też poziomu wiremii w diagnostyce wirusologicznej.
2. Pomiar bezwzględnej ilości transkryptu
Pomiar bezwzględny dokonywany jest przez porównanie wartości Ct próbki z
krzywą kalibracyjną, wykreśloną na podstawie standardów o dokładnie znanym
stężeniu. Nie jest wymagany żaden gen referencyjny, bo nie potrzebujemy
obliczać poziomu ekspresji względem niczego, potrzebujemy określonej wartości
liczbowej, zależnej tylko od zawartości żądanej matrycy w naszej próbce i od
wielkości próbki pobranej do badania z większej całości (stosujemy więc
konkretną jednostkę, np. kopie genomu na ml surowicy). W ilościowaniu GMO
stosuje się bardziej zaawansowana strategię podobną raczej do względnego
pomiaru ilości matrycy: wykonuje się 2 pomiary bezwzględne (jeden dla ilości
markera GMO, drugi dla ilości genomów), po czym wyznacza się wartość
procentową (genomy GMO/wszystkie genomy *100% lub wagowo: ilość gramów
GMO na gram biomasy roślinnej).
3. Pomiar względnej ilości transkyptu
Pomiar względny ilości kopii opiera się na założeniu, że informacja o zmianie
stosunku ilościowego pomiędzy dwoma parametrami jest wystarczająca dla
naszego eksperymentu. Tę strategię stosuje się podczas obserwacji zmian
ekspresji w czasie, porównywania ekspresji pomiędzy próbami oraz np. przy
pomiarze tzw. obciążenia mutacją i szacowaniu ilości kopii genu w genomie.
Żeby przeprowadzić taki pomiar potrzebujemy próby odniesienia. Może nią być:
-gen referencyjny o stałej ekspresji, tzw. housekeeping gene, czyli kontrola
endogenna
-sztucznie wprowadzona z zewnątrz cząsteczka kwasu nukleinowego (tzw.
„spike”), czyli kontrola egzogenna
-indeks referencyjny będący średnią z kilku genów referencyjnych
-średni poziom genu badanego, otrzymany przez uśrednienie wszystkich
pomiarów dla genu badanego
Ilościowanie prowadzone jest poprzez porównanie wartości Ct pomiędzy próbą
badaną a naszą próbą odniesienia. Wartość jaką otrzymujemy nie posiada
jednostki i informuje nas jaka jest ilość kopii amplikonu w odniesieniu do
kalibratora.
Można takie wartości ze sobą porównywać dzięki zastosowaniu pewnych wzorów
matematycznych, np. po to aby:
-porównać naszą próbkę z niestymulowana kontrolą
-zobaczyć jak zmienia się ekspresja w czasie w stosunku do próbki zmierzonej w
czasie T0
-zmierzyć różnice między zdrową populacją a stanami chorobowymi
-porównywać wyniki pacjenta w kilku laboratoriach diagnostycznych.
W kolejnej części cyklu zajmiemy się w szczegółach sposobami
normalizacji wyników Real-Time PCR.
Nowy cykl: Jak ugryźć technikę
FISH?
Jak ugryźć technikę FISH?
Planujesz rozpoczęcie badań metodą FISH i nie bardzo wiesz, jak się do tego
zabrać? W krótkiej serii artykułów o technice FISH przekonamy Cię, że metoda ta
nie jest wcale trudna i że dzięki naszym wskazówkom bez problemu
zaprojektujesz eksperyment, przeprowadzisz hybrydyzację i będziesz się cieszyć
doskonałej jakości zdjęciami. W serii tej opowiemy również o nowościach
odczynnikowych, które ostatnio ukazały się na rynku i podpowiemy Wam jakie
narzędzia bioinformatyczne ułatwią Wam pracę z tą techniką. Artykuły o technice
FISH ukażą się w najbliższych dniach!
Zobacz:
Technika
FISH
–
od
czego
zacząć:
http://dolinabiotechnologiczna.pl/nowosci/technika-fish-od-czego-zaczac/
Wygodna
przeglądarka
sond:
http://dolinabiotechnologiczna.pl/nowosci/jak-ugryzc-technike-fish-wygodna-przeg
ladarka-sond/
Innowacyjne sondy do FISH – znakomita rozdzielczość i niska cena:
http://dolinabiotechnologiczna.pl/nowosci/dont-look-bac-surefish-innowacyjne-son
dy-od-firmy-agilent-technologies/
Gruźlica w parze z cukrzycą
Diabetycy są narażeni na pięciokrotnie większe ryzyko zachorowania na
gruźlicę niż osoby niechorujące na cukrzycę. Podstawy do takiego wniosku
dają wyniki badań przeprowadzonych niedawno przez zespół naukowców z
University of Texas Health Science Center w Houston.
W badaniu wzięło udział 61 pacjentów z południa Teksasu oraz 172 pacjentów z
północno-wschodniego Meksyku.
Uzyskane rezultaty wskazują na to, że 25% przypadków wystąpienia gruźlicy
wykazywało związek z cukrzycą, a około 6% przypadków z HIV.
Znaczenie wpływu cukrzycy na rozwój gruźlicy było zróżnicowane, zarówno pod
względem regionalnym, jak i zależnie od badanej grupy etnicznej. Najbardziej
zauważalna korelacja wystąpiła u Latynosów oraz dwóch głównych populacji o
zwiększonym ryzyku wystąpienia obu chorób: Afroamerykanów i Indian [1].
Ujawniony związek przyczynowo-skutkowy sugeruje, że u pacjentów z gruźlicą
powinno zostać przeprowadzone badanie w kierunku cukrzycy i vice versa.
Społeczeństwa wielu krajów mogłyby z pewnością skorzystać na zintegrowaniu
programów profilaktyki i kontroli zachorowalności na tuberkulozę i przewlekłą
hiperglikemię.
Gruźlica jest chorobą zakaźną, wywoływaną przez Mycobacterium tuberculosis
complex. Szacuje się, że jedna osoba prątkująca może w ciągu roku zarazić drogą
kropelkową kilkanaście innych osób. Szczególne zagrożenie epidemiologiczne
stanowi gruźlica wielolekooporna (ang. multi-drug-resistant tuberculosis, MDRTB). Jej szczepy bakteryjne są oporne na najpowszechniej stosowane leki
przeciwgruźlicze — rifampicynę i izoniazyd — co sprawia, że leczenie chorych na
MDR-TB jest wyjątkowo trudne.
Wśród przyczyn zagrożenia gruźlicą wymienia się czynniki globalne: migrację
polityczną i ekonomiczną z krajów ubogich, szerzenie się pandemii HIV, rozwój
turystyki masowej oraz czynniki regionalne, w tym między innymi lekceważenie
zagrożenia gruźlicą w krajach o niskich wskaźnikach zapadalności na tę chorobę i
umieralności z nią związanej, a także niekorzystne zmiany infrastruktury
organizacyjnej, która służy walce z gruźlicą.
Gruźlica co roku zbiera obfite żniwo, zabijając miliony osób na świecie. W 2009
roku zdiagnozowano ponad 9 milionów nowych zachorowań, a niemalże 2 miliony
chorych zmarło z powodu tuberkulozy. Word Health Organization przypuszcza, że
tak ogromny wzrost zachorowalności na gruźlicę może mieć związek z wciąż
zwiększającą się liczbą cukrzyków, która w tej chwili wynosi 285 milionów.
Według WHO do roku 2030 liczba ta może wzrosnąć do 438 milionów.
***
Zainteresowanym skalą problemu gruźlicy na świecie polecamy najnowszy Raport
WHO, obejmujący epidemiologię, prewencję, stosowane leczenie i jego rezultaty,
organizowane programy profilaktyczne oraz różne inne statystyki dotyczące tej
choroby.