Zastosowanie analizy 1SAR w badaniach leków o działaniu
Transkrypt
Zastosowanie analizy 1SAR w badaniach leków o działaniu
&ARM0RZEGL.AUK :ASTOSOWANIEANALIZY13!2WBADANIACHLEKÌW ODZIAANIUSEROTONINERGICZNYM) !PPLICATIONOF13!2ANALYSISINTHESTUDIESOFSEROTONINERGICDRUGS) 'RAYNAYDEK%LBIETA"RZEZIÊSKA :AKAD#HEMII!NALITYCZNEJ+ATEDRA#HEMII-EDYCZNEJ7YDZIA&ARMACEUTYCZNY 5NIWERSYTET-EDYCZNYW|ODZI Streszczenie Abstract Przeprowadzono analizę ilościowej zależności pomiędzy strukturą i działaniem (QSAR) wybranych 20 leków działających na receptory serotoninowe (5-HT). W analizie zastosowano parametry fizykochemiczne badanych związków obliczone przy użyciu programu HyperChem 7.0 oraz dane chromatograficzne. Przeprowadzono chromatografię cienkowarstwową na płytkach pokrytych silikażelem NP 60F254, impregnowanych roztworami pochodnych aminokwasów wiążących w kompleksie lek-receptor serotoninowy oraz ich mieszanin (S1-S7), w obecności dwóch faz rozwijających – w celu uzyskania modelu interakcji lek-receptor 5-HT. Związek pomiędzy aktywnością biologiczną a danymi chromatograficznymi i deskryptorami molekularnymi badano analizą regresji wielokrotnej. Ustalono modele analityczne zależności pomiędzy działaniem badanych związków i ich interakcją ze środowiskiem biochromatograficznym (S1-S7). Zaproponowane równania regresji oparte na wynikach badań biochromatograficznych, mogą służyć jako skuteczne narzędzie analizy QSAR do wstępnego przewidywania kierunku działania związków w obrębie receptorów serotoninowych. Quantitative structure-activity relationships (QSAR) analysis of the selected 20 drugs with serotonin (5-HT) receptors affinities was carried out. A set of physicochemical parameters calculated by HyperChem 7.0 program and chromatographic data were applied in this analysis. Thin layer chromatography was performed on silica gel NP 60F254 plates impregnated with solutions of amino acids analogues and their mixtures (S1-S7), with two mobile phases – the system were chosen as models of drug-5-HT receptor interaction. Relationships between chromatographic data and molecular descriptors and biological activity data were found by use of regression analysis. The correlations obtained for the compounds with serotoninergic activity represent their interaction with the proposed biochromatographic models (S1–S7). The presented regression models based on biochromatographic studies can be an efficient tool in the QSAR analysis for initial prediction of compound activity direction within 5-HT receptors. Słowa kluczowe: receptory serotoninowe, biochromatografia, chromatografia cienkowarstwowa, analiza QSAR, analiza regresji Wstęp Znajomość budowy i funkcji farmakodynamicznej określonego celu biologicznego może być podstawą poszukiwania modelu analitycznego do pośredniej obserwacji zachowania związków chemicznych w warunkach fizjologicznym. Do tego celu służyć może tak zwane środowisko biochromatograficzne, wykorzystujące funkcjonalne elementy struktury celu biologicznego. Stanowi ono, w pewnym sensie, laboratoryjną imitację środowiska naturalnego działania potencjalnego leku. Dostępne informacje na temat miejsc wiążących ligandy w obrębie receptora serotoninowego (5-HT) pozwalają na wyposażenie modelu biochromatograficznego w elementy chemiczne środowiska biologicznego, bezpośrednio odpowiedzialne za tworzenie kompleksu lek-receptor. Informacje te stwarzały możliwość zbudowania Keywords: serotonin receptors, biochromatography, thin layer chromatography, QSAR analysis, regression analysis analitycznego modelu interakcji związków chemicznych z tym receptorem, dla wstępnego przewidywania aktywności biologicznej potencjalnych jego ligandów. Receptory serotoninowe to długie, nierozgałęzione, zbudowane z kilkuset reszt aminokwasowych, łańcuchy białkowe. Dowody na istnienie różnych typów (klas) receptorów serotoninergicznych zostały przedstawione przez J. H. Gadduma i Z. Picarellego w 1957 roku [1]. Obecnie receptory te dzielimy na 7 typów, które dalej dzielą się na podtypy: 5-HT1 (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1E, 5-HT1F), 5-HT2 (5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C), 5-HT3, 5-HT4 (5-HT4(a), 5-HT4(b), 5-HT4(c), 5-HT4(d)), 5-HT5 (5-HT5A, 5-HT5B), 5-HT6, 5-HT7. Wszystkie należą do receptorów metabotropowych z wyjątkiem rodziny 5-HT3, która zaliczana jest do klasy receptorów jonotropowych. Obecnie wiadomo, że reszta kwasu asparaginowego (Asp155), znajdująca się w III domenie trans COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. NH H3C OH O OH CH3 N N O H3C N N CH3 H3C N N F S O F O F 1. Tiapryd F CH3 S N Cl S 4. Trifluoperazyna 3. Flupentiksol CH3 N N N S Cl 2. Klopentiksol N N CH3 N N H N N O F N H 5. Klozapina CH3 N 6. Risperidon N CH3 S 7. Olanzapina N O N N F N F N N N CH3 N O O NH O 10 . Trazodon 8. Tropisetron H3C S N Cl 9. Cyproheptadyna N N O N N N N N N N 11 . Mianseryna 13 . Mirtazapina 12 . Pizotifen NH H N N N S H3C O N 15 . Sumatriptan N H3C CH3 H3C O O Cl N 18 . Cisaprid HO N 17 . Zolmitriptan CH3 CH3 Materiał i metody Substancje badane Oznaczeń dokonano na grupie znanych leków (zw. 1-20; H3C NH O Ryc. 1), będących w sprzedaży OH aptecznej, o aktywności skierowanej na receptory seroto20 . Propranolol ninowe. Izolowanie substancji aktywnych z preparatów farmaceutycznych przeprowadzono metodami opisanymi według monografii szczegółowych przedstawionych w FP i informacji dostępnych w The Merck Index Twelfth Edition, 1996. Dane o właściwościach farmakologicznych i kierunku działania poszczególnych związków, zaczerpnięte z baz danych (PubMed, DrugBank, ChemBank, Organon), przedstawiono w Tabeli I. CH3 H N NH2 NH N H CH3 16 . Rizatriptan CH3 F H N O CH3 N O O O CH3 H N O 14 . Buspiron H3C N wano również elementy wiążące ligandy związane z TM5. Była to treonina (Thr196) [16]. W innych odmianach receptora 5-HT treoninie odpowiadała alanina (Ala). W obu przypadkach sugeruje się tworzenie wiązania wodorowego z atomem azotu liganda. Oddziaływania z receptorami 5-HT umożliwia również reszta asparaginy (Asn333). Poznanie dokładnej sekwencji aminokwasów w łańcuchu białkowym receptorów oraz przeprowadzanie ich mutacji, pozwala na dokładne zbadanie ich powinowactwa do poszczególnych neuroprzekaźników oraz ligandów [17-24]. Ułatwia to znacznie procesy projektowania nowych leków. Celem przeprowadzonych badań w niniejszej pracy jest określenie możliwości wykorzystania techniki chromatograficznej oraz analizy QSAR do opracowania równań matematycznych, umożliwiających wstępne przewidywanie wiązalność z receptorem (pKi), aktywność agonistyczną (pD2) oraz antagonistyczną (pA2) związków o potencjalnym działaniu na receptory serotoninowe. NH2 O 19 . Serotonina Ryc. 1. Struktury badanych związków 1-20. membranowej (TM3), tworzy wiązania jonowe z grupami aminowymi ligandów [2-8]. Udział w tworzeniu kompleksu z cząsteczkami bierze również reszta seryny (Ser159), zlokalizowana w TM5, która tworzy wiązanie wodorowe z grupami hydroksylowymi ligandów [9] oraz reszta fenyloalaniny (Phe340) w TM6, która poprzez pierścień aromatyczny stabilizuje cząsteczkę serotoniny [10-11]. Stabilizowanie pierścieni aromatycznych w receptorach metabotropowych (GPCR) odbywa się również poprzez reszty aminokwasowe tryptofanu (Trp200, Trp336, Trp367) i tyrozyny (Tyr370). Stabilizacja ta jest zwykle oparta na prostych oddziaływaniach hydrofobowych. W przypadku tryptofanu sugeruje się również możliwość stabilizacji podstawników dodatnio naładowanych amin alifatycznych [12-15]. W niektórych odmianach receptora serotoninowego (5-HT6) zaobserwo- Analiza chromatograficzna Substancje badane 1-20 zostały poddane analizie chromatograficznej w powtarzalnych warunkach. Podczas doświadczeń został ustalony skład fazy organicznej mieszaniny. Fazę wodną stanowi bufor (octan amonu 0,02 mol/L) o pH 7,4, zgodnym z warunkami badań biologicznych. Chromatografię przeprowadzono przy użyciu dwóch rodzajów fazy ruchomej: &ARM0RZEGL.AUK Tab. I. Aktywności biologiczne dla związków 1-20 Zw. pKi1 pD22 pA23 1 7,97 5,10 2 7,60 7,99 7,30 3 7,00 7,88 6,90 4 7,90 8,04 5,70 5 6,00 7,50 6 9,90 8,16 6,69 7 8,10 8,10 7,20 8 8,40 6,50 9 8,22 8,73 10 7,40 8,79 11 9,70 8,09 7,50 12 7,40 9,20 13 8,40 6,88 7,99 14 7,70 7,70 6,35 15 6,60 5,80 16 6,37 6,30 17 6,64 6,20 18 7,40 7,60 7,30 19 6,40 20 7,50 6,00 pKi – powinowactwo leku do receptora pD2 – aktywność agonistyczna 3 pA2 – aktywność antagonistyczna 1 2 (i) acetonitryl : metanol : bufor pH 7,4 (DSA; 40:40:20, v/v/v) (ii) acetonitryl : metanol : chlorek metylenu : bufor pH 7,4 (DSB; 60:10:10:20, v/v/v/v). Jako fazy stacjonarnej użyto płytek aluminiowych z żelem krzemionkowym (NP TLC 60F254, 20x20 cm, Merck, Darmstadt Germany). Analiza prowadzona w normalnym układzie faz (NP TLC). Fazę stacjonarną modyfikowano poprzez nasycenie roztworami pochodnych aminokwasów wiążących dla uzyskania zaplanowanych środowisk biochromatograficznych. W każdym wariancie fazy ruchomej (DSA i DSB) i stacjonarnej przeprowadzano badanie dwukrotnie. Do impregnacji płytek wykorzystano 0,03 mol/L roztwory kwasu propionowego, alkoholu etylowego, etylobenzenu, 4-hydroksyetylobenzenu, amidu kwasu propionowego oraz alkoholu izopropylowego. Alkoholu etylowego i izopropylowego użyto tylko do sporządzenia roztworów wieloskładnikowych. Płytki poddano wstępnemu pasażowaniu (w obecności odpowiedniej fazy ruchomej DSA lub DSB) w warunkach chromatografii przez 1,5 godziny, następnie płytki suszono na powietrzu. Suche płytki, które zostały poddane procedurze pasażowania, impregnowano przy użyciu spryskiwacza (GS1, Desaga) przygotowanymi roztworami uzyskując odpowiednie modele biochromatograficzne: a) kwas propionowy – model S1 b) etylobenzen - model S2 c) 4-hydroksyetylobenzen – model S3 d) amid kwasu propionowego – model S4 e) kwas propionowy i alkohol etylowy (1:1; v:v) – model S5 f) kwas propionowy, alkohol etylowy oraz etylobenzen (1:1:1; v:v:v) – model S6 g) amid kwasu propionowego i alkohol izopropylowy (1:1; v:v) – model S7. Płytki po impregnacji suszono przy dostępie powietrza. W celu wykonania analizy porównawczej, po dwie płytki dla fazy DSA i DSB przygotowano bez roztworów S1-S7 – płytki kontrolne (C). Badane związki 1-20 odważono na wadze analitycznej z dokładnością do 0,1 mg, a następnie rozpuszczono w metanolu w celu uzyskania stężenia 1 mg/mL. Za pomocą mikrostrzykawki Hamilton na wszystkie użyte w doświadczeniu płytki nanoszono badane związki (1-20) w ilości 1,0 μL. Odległość pomiędzy nanoszonymi związkami wynosiła 0,8 cm, a średnica powstałych plamek około 2 mm. Zachowano odstęp od brzegu płytki w odległości 2,0 cm. Linia startu znajdowała się 2,0 cm powyżej dolnej krawędzi płytki. Chromatogramy rozwijano na wysokość 10 cm licząc od linii startu. Czas rozwijania chromatogramów wynosił dla fazy DSA – 45 ± 2 min, dla fazy DSB – 38 ± 2 min. Rozwijanie chromatogramu przeprowadzono w poziomej komorze chromatograficznej z dozownikiem eluentu, DS-II-20x20 (CHROMDES, Lublin, Poland). Wykonano analizę densytometryczną uzyskanych chromatogramów z użyciem aparatu Desaga CD 60, przy długości fali 280 nm. Podstawowym parametrem, który wyznacza się z chromatogramu jest współczynnik opóźnienia Rf (ang. Retardation Factor), definiowany jako stosunek drogi przebytej przez substancję chromatografowaną (od punktu startu do środka plamki - a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (od linii startu do czoła fazy ruchomej - b); Rf = a/b. Otrzymane wyniki analizy nie wykazały rozbieżności, a otrzymane wartości danych (Rf) dawały średnią z dwóch kolejnych pomiarów. Współczynnik opóźnienia Rf stanowił podstawę do wyliczenia współczynnika RM (jego logarytmicznej funkcji) z zależności [25]: R M = log (1/R f – 1). Wartość współczynnika R f (R M) jest charakterystyczna dla danej substancji, w konkretnym układzie chromatograficznym. Wartości RM(S1-7) i RM(C) analizowanych związków opisano kolejno jako: S1-7 i C, natomiast pochodne tych wyników oznaczono odpowiednio jako: S1-7/C i C – S1-7. Otrzymane wyniki z analizy chromatograficznej zostały przedstawione w Tabeli II. Parametry fizykochemiczne Obliczenia parametrów fizykochemicznych wykonano wykorzystując program HyperChem 7.0 i ACD/Labs 8.0. Otrzymane wyniki zostały zestawione w Tabeli III. Podczas obliczania parametrów: energia całkowita (ET [kcal·mol-1]), energia wiązania (EB [kcal·mol-1]), ciepło tworzenia (HF [kcal·mol-1]), moment dipolowy (μ [D]), energia orbitalu HOMO (EHOMO [eV]), energia orbitalu LUMO (ELUMO [eV]), pole powierzchni van der Waals’a (GSA [Å2]), objętość van der Waals’a (MV [Å3]), energia hydratacji (EH [kcal·mol-1]), współczynnik podziału oktanol/woda (logP), refrakcja mo- COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. Tab. II. Wartości RM otrzymane dla analizy przeprowadzonej z zastosowa- trybucji (logD), wartość równowagi kwasowoniem fazy rozwijającej DSA i DSB zasadowej alifatycznego atomu azotu liganda (pKa), polarne pole powierzchni cząsteczki Zw, C S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 liganda (PSA, [Å2]), liczba donorów (HD) oraz Faza rozwijająca DSA akceptorów (HA) wiązań wodorowych zosta1 0,720 0,644 0,704 0,673 0,659 0,689 0,704 0,689 ły wyliczone za pomocą programu ACD/Labs 2 0,140 -0,070 0,158 0,176 -0,026 0,158 0,131 0,017 8.0. 3 0,052 -0,167 0,105 0,105 -0,176 0,087 0,114 -0,087 Analiza regresji wielokrotnej (MR – Multi4 0,410 0,358 0,432 0,421 0,368 0,410 0,410 0,399 ple Regression) 5 0,122 0,070 0,194 0,194 0,043 0,158 0,149 0,070 Uzyskane dane chromatograficzne wraz 6 0,176 0,203 0,231 0,222 0,222 0,185 0,203 0,158 z obliczonymi komputerowo za pomocą pro7 0,443 0,432 0,537 0,562 0,454 0,513 0,525 0,443 gramu HyperChem 7.0 oraz ACD/Labs 8.0 de8 0,704 0,602 0,673 0,616 0,630 0,673 0,673 0,673 skryptorami fizykochemicznymi zostały pod9 0,389 0,149 0,358 0,327 0,052 0,347 0,368 0,368 dane analizie chemometrycznej. Zależność pomiędzy zachowaniem się bada10 -0,525 -0,489 -0,466 -0,421 -0,477 -0,466 -0,477 -0,489 nych związków działających na receptory sero11 -0,087 -0,167 0,009 0,026 -0,149 0,000 -0,061 -0,105 toninowe (zw. 1-20) w środowiskach chroma12 0,399 0,105 0,389 0,347 0,308 0,368 0,389 0,368 tograficznych S1-S7 (zaproponowanych jako 13 0,140 0,149 0,213 0,240 0,158 0,194 0,203 0,167 analityczne modele aktywności serotoninowej) 14 -0,410 -0,399 -0,337 -0,278 -0,399 -0,368 -0,358 -0,389 i właściwościami fizykochemicznymi a ich 15 0,602 0,489 0,575 0,550 0,489 0,575 0,589 0,589 wiązalnością z receptorem (pKi), aktywnością agonistyczną (pD2) i antagonistyczną (pA2) 16 0,845 0,771 0,826 0,845 0,771 0,865 0,865 0,845 badano z wykorzystaniem liniowej i wielokrot17 0,659 0,550 0,689 0,602 0,562 0,659 0,644 0,630 ną analizę regresji (metoda – analiza krokowa 18 -0,454 -0,575 -0,410 -0,432 -0,537 -0,466 -0,399 -0,489 postępująca). Analizę regresji przeprowadzo19 0,501 0,298 0,602 0,602 0,337 0,466 0,501 0,421 no przy wykorzystaniu programu STATISTI20 0,288 -0,537 0,167 0,096 -0,501 0,158 0,213 0,176 CA 8.0. W opisanej analizie statystycznej jako zmienne niezależne zastosowano: dane chroFaza rozwijająca DSB matograficznej (C, S1-S7, S1-7/C, C – S1-7) 1 0,602 0,513 0,562 0,562 0,454 0,575 0,589 0,575 oraz obliczone deskryptory fizykochemiczne. 2 -0,140 -0,231 -0,149 -0,158 -0,213 -0,167 -0,167 -0,203 Jako zmienne zależne użyto miary aktywno3 -0,231 -0,298 -0,213 -0,213 -0,278 -0,259 -0,240 -0,259 ści biologicznej analizowanych związków: 4 -0,105 -0,167 -0,131 -0,122 -0,213 -0,122 -0,122 -0,185 pKi, pD2 oraz pA2. Obliczenia statystyczne 5 -0,105 -0,158 -0,096 -0,114 -0,176 -0,114 -0,114 -0,149 przeprowadzono przy 95% poziomie ufności (p<0,05). Parametry statystyczne dla uzyska6 0,259 0,203 0,278 0,250 0,194 0,231 0,240 0,231 nych równań regresji: współczynnik korelacji 7 0,298 0,203 0,269 0,278 0,194 0,288 0,288 0,240 (R), współczynnik determinacji (R2), wartości 8 0,250 0,176 0,250 0,259 0,167 0,278 0,231 0,240 F-statystyki (F), poziom istotności statystycz9 -0,167 -0,288 -0,203 -0,213 -0,288 -0,194 -0,213 -0,231 nej (p), standardowy błąd estymacji (s) zostały 10 -0,443 -0,466 -0,399 -0,421 -0,443 -0,489 -0,454 -0,421 przedstawione w Tabeli IV. Użycie więcej niż jednej zmiennej w równaniach regresji wie11 -0,308 -0,368 -0,298 -0,327 -0,368 -0,347 -0,337 -0,327 lorakiej uzasadnione jest zbadaniem korelacji 12 -0,176 -0,278 -0,194 -0,194 -0,298 -0,222 -0,176 -0,250 cząstkowych między parametrami. Uwzględ13 0,052 -0,026 0,061 0,026 -0,026 0,035 0,043 0,000 niono tylko takie korelacje cząstkowe, które 14 -0,259 -0,327 -0,231 -0,250 -0,337 -0,278 -0,269 -0,278 posiadały wartości mniejsze od 0,70. Korelacje 15 0,432 0,203 0,378 0,317 0,269 0,378 0,399 0,337 cząstkowe powyżej wspomnianej wartości da16 0,826 0,720 0,826 0,788 0,771 0,826 0,826 0,865 wały zbyt wysoki współczynnik R (zbyt dobre równanie korelacji) i byłyby nieadekwatne do 17 0,550 0,347 0,525 0,477 0,368 0,537 0,525 0,525 równań oczekiwanych, a więc i wynik końco18 -0,410 -0,443 -0,399 -0,389 -0,421 -0,477 -0,454 -0,399 wy analizy byłby zafałszowany. 19 0,501 0,194 0,525 0,421 0,231 0,368 0,358 0,317 Walidacja 20 -0,158 -0,259 -0,176 -0,167 -0,250 -0,185 -0,185 -0,185 Przeprowadzono badanie wartości predykcyjnej ustalonych modeli regresyjnych. lowa (MR [Å3]), polaryzowalność (α [Å3]), masa cząstecz- Z powodu mało licznej grupy badanej, modele poddano kowa (Mass [g·mol-1]) oraz ładunek elektryczny na atomie weryfikacji testem Leave-One-Out Cross Validation (LOO azotu aminy alifatycznej (QN) za pomocą programu Hyper- CV) w celu niezależnej oceny metody. Cały zbiór danych Chem 7.0 zastosowano metodę półempiryczną AM1 z algo- dzielono wielokrotnie na dwa podzbiory, przy czym jeden rytmem postępowania Polak-Ribiere’a. Współczynnik dys- podzbiór służący do budowy modelu składał się z n-1 ele- &ARM0RZEGL.AUK 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 2 1 2 3 4 2 6 3 3 3 4 6 4 4 1 6 2 1 3 7 5 5 5 7 3 3 HD PSA pKa 9,660 3,400 3,400 8,210 7,140 7,890 6,080 10,000 8,950 6,730 8,260 9,040 8,100 6,730 9,490 9,490 9,520 7,770 10,310 9,140 logD QN Mass 328,426 400,966 434,519 407,497 326,829 410,491 312,433 284,358 287,404 371,869 264,370 295,442 265,358 385,509 295,400 269,349 287,362 465,952 176,218 259,348 31,512 44,971 44,605 41,841 36,471 43,543 35,900 31,530 36,028 39,935 32,258 35,742 31,549 42,114 29,339 31,130 31,820 47,392 20,147 30,251 α MR 91,230 125,836 126,334 119,657 103,527 118,480 100,059 85,350 102,757 109,910 91,207 99,089 87,078 109,352 85,919 87,268 86,026 122,436 56,325 83,380 -1,561 -0,058 0,734 -0,189 -0,730 0,631 -0,268 -0,379 1,772 0,398 0,940 0,498 1,159 1,179 -1,533 -1,307 -1,013 2,246 -2,208 0,680 logP EH -5,377 -7,202 -7,158 -1,068 -2,846 -3,954 -2,750 -4,731 -1,137 -3,394 -0,671 -0,785 -1,557 -1,853 -7,570 -6,377 -6,126 -8,507 -15,763 -7,250 299,487 362,081 375,931 353,227 297,108 374,259 908,509 268,608 290,432 336,505 264,061 285,550 259,656 371,810 270,642 264,074 275,043 412,469 168,406 260,891 MV GSA 363,122 390,649 428,401 397,66 332,898 417,973 534,025 306,24 320,589 386,683 294,118 315,584 289,582 427,837 327,288 312,82 320,462 480,4 204,407 311,485 -0,8138675 -0,8795735 -0,6107714 -0,5433432 -0,3728039 -0,6652046 -0,4581621 -0,1467351 -0,2251996 -0,5326552 0,4595214 0,05507502 0,1338292 0,1302918 -0,5024017 0,05110605 -0,00465511 -0,1129853 0,13555862 -0,5060177 ELUMO EHOMO -9,223006 -7,679547 -8,185675 -7,748451 -8,120341 -8,884932 -8,203828 -8,832393 -8,51944 -8,490873 -8,560602 -8,663204 -8,712882 -8,767308 -8,354092 -8,535871 -8,489959 -8,756364 -8,307039 -8,774205 5,419 1,296 3,341 3,373 4,266 2,832 2,471 5,200 0,930 3,651 1,693 0,518 1,400 4,108 2,301 5,473 6,508 3,887 3,411 2,205 μ HF -114,41802 66,706707 -126,83314 -77,028567 103,02242 -3,6329411 101,99217 -14,166268 78,665389 104,46058 78,003214 59,580266 82,984902 -34,379971 -16,01921 139,35663 -22,21843 -162,07634 1,2205941 -55,71855 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 -4458,85 -5376,37 -5768,48 -5378,24 -4443,93 -5930,86 -4363,58 -4306,45 -4717,17 -4942,24 -4266,06 -4460,87 -4151,08 -5922,35 -4027,14 -3978,93 -4308,72 -6228,62 -2618,46 -4116,22 ET -95473,516 -102871,32 -130832,64 -121985,47 -86841,847 -121479,92 -80076,438 -80841,486 -73412,657 -102872,02 -69008,062 -72005,618 -70511,878 -110495,96 -81555,823 -74102,912 -82988,146 -140797,97 -50258,522 -73460,184 Zw. EB -0,283 -0,264 -0,260 -0,243 -0,257 -0,251 -0,258 -0,219 -0,243 -0,253 -0,254 -0,259 -0,247 -0,261 -0,268 -0,266 -0,280 -0,267 -0,350 -0,302 -1,480 5,060 4,420 4,210 3,280 2,270 2,680 1,070 4,860 1,580 2,760 4,490 1,970 3,350 -1,380 -1,100 -0,440 2,600 -2,200 1,370 84,090 52,010 52,010 35,020 30,870 61,940 59,110 45,330 3,240 42,390 6,480 31,480 19,370 69,640 73,580 44,810 57,360 86,050 62,040 41,490 HA Tab. III. Obliczone parametry fizykochemiczne dla związków 1-20 mentów, natomiast element, który nie brał udziału w budowaniu modelu był stosowany do jego weryfikacji. Obliczono współczynnik walidacji Q2 przy użyciu wzoru [26]: n (y – y )2 Q2 = 1 – Σi=1n exp,i pred,i2 Σi=1(yexp,i – ŷ) gdzie yexp – wartość badanej cechy uzyskana z pomiarów (eksperymentalna), ypred – wartość badanej cechy obliczona na podstawie modelu (predykcyjna), ŷ – wartość średnia yexp. Model posiada tym większe zdolności prognostyczne, jeżeli współczynnik determinacji R2>0,60 [26], oraz różnica pomiędzy R2 i Q2 nie przekracza 0,2-0,3 [27]. Wyniki badań Na podstawie informacji bibliograficznych mówiących o wykorzystaniu danych chromatograficznych w analizie QSAR dla receptorów β-adrenergicznych [28-29] oraz histaminowych [30-33] postanowiono przeprowadzić analogiczne badania dla receptorów serotoninowych. W niniejszej pracy badano możliwości wykorzystania metod chromatograficznych i danych fizykochemicznych do ustalenia wiązalności z receptorem (pKi) , aktywności agonistycznej (pD2) oraz antagonistycznej (pA2) wybranych 20 związków o udowodnionym działaniu na receptory serotoninowe. W badaniach wykorzystano dane o budowie i funkcji tego receptora [2-24]. Dane te dowodzą, że największe znaczenie dla wiązania ligandów odgrywają aminokwasy: kwas asparaginowy (Asp155), seryna (Ser159), fenyloalanina (Phe340), asparagina (Asn333), tyrozyna (Tyr370), treonina (Thr196), oraz tryptofan (200, 236, 367) zlokalizowane w obrębie receptora 5-HT. Informacje te, umożliwiły stworzenie hipotetycznego modelu interakcji lek-receptor serotoninowy, gdzie do środowiska chromatograficznego (faza stacjonarna S1-S7) zostały wprowadzone tzw. analogi aminokwasów. Aminokwasy używane do modyfikacji fazy stacjonarnej [28-31] posiadają reaktywne grupy aminowe i karboksylowe, które w warunkach biologicznych nie uczestniczą w tworzeniu kompleksu aktywnego. Pozostają one w strukturze białkowej tworząc wiązanie peptydowe. Obecność tych grup funkcyjnych w środowisku chromatograficznym może prowadzić do dodatkowych (niespecyficznych dla różnych aminokwasów) interakcji z badanymi związkami. Zastosowane analogi mają więc budowę wybranych aminokwasów, pozbawionych podstawników (karboksylowego i aminowego) przy α-atomie węgla. I tak, kwas asparaginowy (Asp) zastępuje kwas propionowy, serynę (Ser) – alkohol etylowy, fenyloalaninę (Phe) – etylobenzen, tyrozynę (Tyr) – 4-hydroksyetylobenzen, asparaginę (Asn) – amid kwasu propionowego a treoninę (Thr) – alkohol izopropylowy. Zastosowanie alkoholu etylowego i izopropylowego jako substancji modyfikujących fazę stacjonarną samodzielnie jest bezcelowe. Zostały one użyte tylko w wieloskładnikowych roztworach do impregnacji płytek. Wartość pH 7,4 środowiska chromatografii odpowiadała warunkom fizjologicznym. Zależność między zachowaniem się badanych związków działających na receptory serotoninowe (zw. 1-20) w środowiskach chromatograficznych S1-S7 a ich wiązalnością COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. Tab. IV. Zależności pomiędzy wartościami aktywności biologicznej (pKi, pD2, pA2) a danymi i deskryptorami molekularnymi Nr Zmienne niezależne – dane chromatograficzne rów. Faza rozwijająca DSA pKi = R R2 F s (1) a - b S5/C + c C-S6 0,48 0,23 2,4331 0, 97008 pD2 = (2) a - b C-S3 + c C-S7 - d C-S4 0,82 0,68 6,3321 0, 54929 pA 2 = (3) a - b S6 0,30 0,092 1,4152 1,1202 Faza rozwijająca DSB pKi = (4) a - b C-S1 + c S2/C - d S4/C + e S3/C 0,72 0,52 3,7927 0, 82045 pD2 = (5) a - b C-S1 - c C-S4 + d S1/C 0,91 0,83 14,796 0, 39777 pA2 = (6) a - b S7 - c S6/C + d C-S3 0,72 0,52 4,4169 0, 87524 Zmienne niezależne – dane fizykochemiczne pKi = 0,83 0,69 11,047 0,63866 (7) a + b QN - c μ - d logD pD2 = 0,83 0,69 6,6237 0,54091 (8) a + b logD - c ELUMO - d EHOMO pA2 = (9) a + b HF - c μ + d MR 0,83 0,69 8,8893 0,70727 Zmienne niezależne – dane chromatograficzne i fizykochemiczne Faza rozwijająca DSA pK i 0,85 0,73 9,3246 0, 61869 (10) a + b QN - c μ - logD - d S5/C pD2 = 0,85 0,72 7,8794 0, 50873 (11) a + b logD - c ELUMO - d S5/C pA2 = (12) a + b HF - c μ + d S5/C 0,84 0,70 9,2961 0, 69637 Faza rozwijająca DSB pKi = 0,86 0,75 10,325 0, 59588 (13) a + b QN - c μ - d S5/C + e C-S6 pD2 = 0,94 0,88 21,295 0, 34044 (14) a - b C-S1 + c C-S4 - d pKa pA2 = (15) a + b HF - c S5 + d C-S5 0,85 0,72 10,311 0, 67122 z receptorem (pKi), aktywnością agonistyczną (pD2) i antagonistyczną (pA2) badano z zastosowaniem analizy regresji. Badanie zależności pomiędzy pKi, pD2 i pA2 a danymi (C), z chromatografii w środowisku kontroli, wykazało brak korelacji. Obliczony współczynnik korelacji (R) wynosił: 0,22 i 0,28 (pKi, n=19, odpowiednio dla fazy DSA i DSB), 0,47 i 0,55 (pD2, n=13, odpowiednio dla fazy DSA i DSB) oraz 0,31 i 0,50 (pA2, n=16, odpowiednio dla fazy DSA i DSB). Analiza zależności pomiędzy danymi o aktywności biologicznej badanych związków do receptora serotoninowego i parametrami chromatograficznymi z udziałem fazy DSA nie przyniosła interesujących wyników (równania 1-3, Tabela IV). Jedyne istotne statystycznie równanie (2) uzyskano dla związków działających agonistycznie (pD2, R=0.82; n=13). Korzystniejsze okazało się zastosowanie fazy DSB. Wielozmienne, istotne statystycznie zależności odnaleziono chromatograficznymi p 0, 11951 n 19 0, 01344 13 0,253977 16 0, 02722 19 0,00080 13 0, 02598 16 0,00044 19 0,01177 13 0,00224 16 0,00069 19 0,00691 13 0,00187 16 0,00042 19 0,00020 13 0,00122 16 dla wszystkich typów oznaczonej aktywności biologicznej (równania 4-6). Powinowactwo związków do receptora 5-HT pKi opisane jest udziałem modeli S1, S2, S3 i S4 (równanie 4). Otrzymana zależność wyjaśniają maksymalnie 52% wariancji i równocześnie opisują możliwe interakcje pomiędzy ligandami i resztami aminokwasów: Asp155, Phe340, Asn333 i Tyr370. Reprezentowane są tu wszystkie rodzaje interakcji pomiędzy elementami strukturalnymi kieszeni hydrofobowej receptora i związkiem chemicznym w kompleksie lek-receptor – wiązania jonowe, wodorowe oraz stabilizowanie pierścieni aromatycznych ligandów siłami hydrofobowymi. Badanie aktywności antagonistycznej ligandów receptora serotoninowego 5-HT pA2 osiągnęło ten sam poziom istotności. Równanie (6) wyjaśnia również 52% wariancji całkowitej i opisuje oddziaływania ligandów z aminokwasami: fenyloalaniną, kwasem asparaginowym, seryną oraz asparaginą i treoniną (S3, S6, S7) uwidocznia- &ARM0RZEGL.AUK jąc wpływ wszystkich rodzajów oddziaływań pomiędzy elementami strukturalnymi kieszeni hydrofobowej receptora i związkiem chemicznym w kompleksie lek-receptor. Analiza zależności pomiędzy parametrami chromatograficznymi i poziomem aktywności agonistycznej 5-HT badanych związków, przeprowadzono z udziałem 13 przypadków z oznaczoną wartością pD2, ponownie okazała się najkorzystniejsza. Stwierdzono bardzo dobrą korelację pomiędzy poziomem aktywności agonistycznej badanych związków do receptorów serotoninowych 5-HT i danymi chromatograficznymi (równanie 5). pD2 = 7,80(±0,36) - 17,22(±3,47) C-S1 + 9,80(±3,93) C-S4 + 0,43(±0,22) S1/C (5) Uwidocznił się tu wpływ oddziaływań ligandów z kwasem asparaginowym oraz asparaginą. Aminokwasy te reprezentują oddziaływania typu jonowego oraz wodorowego. Uzyskane równanie opisuje 83% wariancji całkowitej. Model ten może stanowić równanie o walorach predykcyjnych. Przeprowadzono badanie wartości predykcyjnej tego modelu regresji. Zgodnie z opisem przedstawionym w części doświadczalnej pracy obliczono współczynnik walidacji Q2, który dla równania 5 wyniósł 0,70. Różnica pomiędzy wartością R2 dla tego równania i współczynnikiem walidacji równa 0,13 potwierdza wiarygodność tego modelu. Znaczenie klasycznej analizy QSAR, skutecznej w większości analiz potencjalnego działania substancji czynnej, potwierdzono dla badanej grupy (1-20). W celu przeprowadzenia poniższej analizy, wszystkie związki 1-20, poddano badaniom strukturalnym i wyznaczono dla nich wartości deskryptorów molekularnych (Tabela III). Badanie objęło wszystkie deskryptory molekularne jako zmienne niezależne, kształtujące powinowactwo do receptorów grupy 5-HT. Uzyskane w analizie korelacje przedstawiono w Tabeli IV. Ujawniły się wyraźne wpływy parametrów molekularnych (QN, μ, EHOMO, ELUMO, HF) i termodynamicznych (MR, logD) przypadków (równania 7-9). Uzyskane modele matematyczne dla wszystkich typów aktywności biologicznej (pKi, pD2 i pA2) wyjaśniają 69% zmienności całkowitej i kształtują się na tym samym poziomie współczynnika korelacji R = 0,83 (współczynnik determinacji R2 = 0,69 potwierdza zdolność predykcyjną równań). Biorąc pod uwagę znaczenie deskryptorów molekularnych w przewidywaniu aktywności biologicznej, założono możliwość ich wykorzystania łącznie z danymi chromatograficznymi we wspólnej analizie QSAR. Udział deskryptorów molekularnych może uzupełnić obserwację przypadków o cechy nieujawniające się w analizie chromatograficznej (wartości energetyczne, trwałość, rozkład ładunków, parametry steryczne). W rezultacie powstać mogą bardziej efektywne narzędzia projektowania leków. W pierwszej kolejności zbadano udział parametrów fizykochemicznych w analizie modeli chromatograficznych typu DSA. Wyniki tej analizy, dla kolejnych zmiennych zależnych, przedstawiono w Tabeli IV (równania 10-12). Dla wszystkich rodzajów aktywności biologicznej uzyskano istotne statystycznie korelacje. Powstałe modele matematyczne wyjaśniają ponad 70% zmienności całkowitej. Badanie zależności dla fazy rozwijającej DSB dało ponownie lepsze wyniki analizy regresji dla aktywności biologicznej (równania 13 - 15). Najlepszą, prawie pełną korelację uzyskano dla zmiennej zależnej pD2 (równanie 14). Widoczne jest, że połączenie danych fizykochemicznych z danymi chromatograficznymi przyniosło poprawę wyników analizy QSAR. Na podstawie tych analiz zaproponować można równania matematyczne opisujące wszystkie rodzaje interakcji ligandów z receptorami 5-HT (powinowactwem, pobudzeniem i hamowaniem): pK i = 18,28(±2,07) + 30,70(±6,92) QN - 0,36(±0,09) μ - 1,95(±1,02) S5/C + 11,41(±6,77) C-S6 (13) pD2 = 9,19(±0,36) - 18,44(±2,90) C-S1 + 12,66(±3,50) C-S4 - 0,15(±0,05) pKa (14) pA 2 = 6,66(±0,29) + 0,01(±0,002) HF – 1,12(±0,74) S5 + 15,78(±10,79) C-S5 (15) Przeprowadzono badanie wartości predykcyjnej modelu regresji dla równania 14. Obliczono współczynnik walidacji Q2, który wyniósł w tym przypadku 0,79. Różnica pomiędzy wartością R2 dla tego równania i współczynnikiem walidacji Q2 równa 0,09 potwierdza znaczną wiarygodność tego modelu. Równania 5 i 14 posiadają również wartość predykcyjną wynikającą z porównania obserwowanych i obliczonych na ich podstawie wartości pD2 (R = 0,91 dla równania 5 i 0,94 dla równania 14; n=13; wyników nie zamieszczono) i mogą zostać użyte do przewidywania poziomu aktywności biologicznej potencjalnych nowych leków o różnej budowie, wykazujących działanie na receptory serotoninowe. Wysoka wartość współczynnika determinacji dla równań 5 i 14, odpowiednio 0,83 i 0,88, świadczy o ich wysokich zdolnościach predykcyjnych (R2>0,6) [26]. Wnioski Przeprowadzono analizę statystyczną w celu ustalenia modeli regresji wielokrotnej opisującej zmienność aktywności 5-HT grupy związków pochodnych o różnej budowie (zw. 1-20). Założono, że modele te mogą być budowane na podstawie interakcji badanych związków ze środowiskiem chromatograficznym zawierającym chemiczne elementy struktur wiążących leki, charakterystyczne dla receptorów serotoninowych. Zmienne niezależne (objaśniające) zastosowane w tej analizie opisywały więc zachowanie badanych związków w środowisku biochromatograficznym z udziałem elementarnych struktur chemicznych odpowiedzialnych za interakcję lek-receptor 5-HT (L- aminokwasów: Asp, Ser, Phe, Tyr, Asn i Thr) poprzez analogi tych aminokwasów: kwasu propionowego, etanolu, etylobenzenu, 4-hydroksyetylobenzenu, amidu kwasu propionowego i izopropanolu, naśladujących funkcję aminokwasów w zakresie interakcji z lekiem. Dodatkowo wprowadzono do analizy zmienne objaśniające w postaci wartości parametrów fizykochemicznych badanych związków, charakteryzujące oddziaływania hydrofobowe, elektronowe i steryczne analitów. We wszystkich opisanych powyżej typach układów chromatograficznych odnaleziono modele regresji oparte na interakcji badanych związków z substancjami modyfikującymi skład fazy stacjonarnej. Ustalono tym samym, że zaproponowane układy biochromatograficzne opisywać mogą interakcję, która jest możliwa pomiędzy ligandem i odpowiednimi aminokwasami. Udowodniono równocześnie brak korelacji pomiędzy aktywnością badanych związków i ich zachowaniem w środowisku kontrolnym chromatografii (bez udziału COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. aminokwasów lub ich analogów), co potwierdziło znaczenie obecności związków modyfikujących fazę stacjonarną układów chromatograficznych w budowaniu modeli analitycznych interakcji lek-receptor. Na podstawie porównania użytych układów chromatograficznych stwierdzić można, że zastosowanie fazy stacjonarnej typu NP TLC i fazy rozwijającej DSB prowadziło do uzyskania najlepszych wyników. Było to prawdopodobnie spowodowane najlepszym dopasowaniem warunków chromatografii do właściwości lipofilowych wszystkich badanych związków o różnej budowie. Przedstawione modele wytypowano na podstawie najkorzystniejszych wartości współczynnika determinacji R2 i testów statystycznych (F, p), jako reprezentację każdej z grup doświadczeń chromatograficznych i rodzaju badanej aktywności ograniczoną do jednego tylko równania. Są one propozycją zastosowania konkretnych metod przewidywania aktywności ligandów receptora 5-HT. Zastosowanie w analizie przypadków badanych (zw. 1-20) o różnej budowie potwierdza uniwersalny charakter powstałych modeli. Badania wykonano w ramach tematu badawczego finansowanego przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi Nr 502-13-779. Piśmiennictwo 1. Gaddum JH and Picarelli ZP. Two kinds of tryptamine receptors. Br J Pharmac Chemother 1957; 12: 323-328. 2. Luo X, Zhang D, Weinstein H. Ligand-induced domain motion in the activation mechanism of a G-proteincoupled receptor. Protein Eng 1994; 7: 1441-1448. 3. Zhang D, Weinstein H. Signal transduction by a 5-HT2 receptor: a mechanistic hypothesis from molecular dynamics simulations of the three-dimensional model of the receptor complexed to ligands. J Med Chem 1993; 36: 934-938. 4. Strader CD i wsp. Identification of residues required for ligand binding to the beta-adrenergic receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1987; 84: 4384-4388. 5. Strader CD i wsp. Conserved aspartic acid residues 79 and 113 of the beta-adrenergic receptor have different roles in receptor function. J Biol Chem 1988; 263: 10267-10271. 6. Ho BY i wsp. The role of conserved aspartate and serine residues in ligand binding and in function of the 5-HT1A receptor: A site-directed mutation study. FEBS Lett 1992; 312: 259-262. 7. Fraser CM i wsp. Site-directed mutagenesis of m1 muscarinic acetylcholine receptors: conserved aspartic acids play important roles in receptor function. Mol Pharmacol 1989; 36: 840-847. 8. Gray TM, Matthews BW. Intrahelical hydrogen bonding of serine, threonine and cysteine residues within α-helices and its relevance to membrane-bound proteins. J Mol Biol 1984; 175: 75-81. 9. Almaula N i wsp. Mapping the binding site pocket of the serotonin 5-Hydroxytryptamine2A receptor. Ser3.36(159) provides a second interaction site for the protonated amine of serotonin but not of lysergic acid diethylamide or bufotenin. J Biol Chem 1996; 271: 14672-14675. 10. Choudhary MS, Craigo S, Roth BL. A single-point mutation (Phe340 Leu340) of a conserved phenylalanine abolishes 4-[125I]-iodo-(2,5-dimethoxy)phenylisopropylamine and [3H]mesulergine but not [3H]ketanserin binding to 5-hydroxytryptamine2 receptors. Mol Pharmacol 1993; 43: 755-763. 11. Choudhary MS i wsp. Differential ergoline and ergopeptine binding to 5-hydroxytryptamine2A receptors: ergolines require an aromatic residue at position 340 for high affinity binding. Mol Pharmacol 1995; 47: 450-457. 12. Edvardsen O, Sylte I, Dahl SG. Molecular dynamics of serotonin and ritanserin interacting with 5-HT2 receptor. Brain Res Mol Brain Res 1992; 14: 166-178. 13. Kristiansen K, Edvardsen O, Dahl SG. Molecular modelling of ketanserin and its interactions with the 5-HT2 receptor. Med Chem Res 1993; 3: 370-385. 14. Hibert MF i wsp. Three-dimensional models of neurotransmitter G-binding protein-coupled receptors. Mol Pharmacol 1991; 40: 8-15. 15. Kristiansen A , Dahl SG. Molecular modeling of serotonin, ketanserin, ritanserin and their 5-HT2c receptor interactions. Eur J Pharmacol 1996; 306: 195-210. 16. Boess FG i wsp. Interaction of tryptamine and ergoline compounds with threonine 196 in the ligand binding site of the 5-hydroxytryptamine6 receptor. Mol Pharmacol 1997; 52: 515-523. 17. Wesołowska A. In the search for selective ligands of 5-HT5 ,5-HT6 and 5-HT7 serotonin receptors. Pol J Pharmacol 2002; 54: 327- 341. 18. Shih JC, Chen KJ-S, Gallaher TK. Molecular biology of serotonin receptors. Psychopharmacology – The Fourth Generation of Progress. American College of Neuropsychopharmacology, 2000. 19. Aghajanian GK, Sanders-Bush E. Serotonin. Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress. American College of Neuropsychopharmacology, 2002. 20. Spier AD, Lummis SC. The role of tryptophan residues in the 5-Hydroxytryptamine(3) receptor ligand binding domain. J Biol Chem 2000; 275: 5620–5625. 21. Muntasir HA i wsp. Identification of a key amino acid of the human 5-HT2B serotonin receptor important for sarpogrelate binding. J Pharmacol Sci 2007; 104: 274-277. 22. Braden MR i wsp. Molecular interaction of serotonin 5-HT2A receptor residues Phe339(6.51) and Phe340(6.52) with superpotent N-benzyl phenethylamine agonists. Mol Pharmacol 2006; 70: 1956-1964. 23. Manivet P i wsp. The serotonin binding site of human and murine 5-HT2B receptors. J Biol Chem 2002; 227: 17170-17178. 24. Beene DL i wsp. Tyrosine residues that control binding and gating in the 5-hydroxytryptamine3 receptor revealed by unnatural amino acid mutagenesis. J Neurosci 2004; 24: 9097-9104. 25. Bate-Smith EC, Westall RG. Chromatographic behavior and chemical structure I. Some naturally occurring phenolic substances. Biochim Biophys Acta 1950; 4: 427440. 26. Afantitis A i wsp. A novel QSAR model for predicting induction of apoptosis by 4-aryl-4H-chromenes. Bioorg Med Chem 2006; 14: 6686-6694. &ARM0RZEGL.AUK 27. Kiralj R, Ferreira MMC. Basic validation procedures for regression models in QSAR and QSPR studies: theory and application. J Braz Chem Soc 2009; 20: 770-787. 28. Brzezińska EO. An application of TLC chromatographic data in QSAR assay of TIQs derivatives with β2-adrenergic activity. Part 1. Acta Pol Pharm 1996; 53: 383-388. 29. Brzezińska E. An application of TLC chromatographic data in QSAR assay of TIQs derivatives with B102adrenergic activity. Part 2. Acta Pol Pharm 1996; 53: 389-392. 30. Brzezińska E, Kośka G, Walczyński K. Application of thin-layer chromatographic data in quntitative structureactivity relationship assay of thiazole and benzothiazole derivatives with H1-antihistamine activity. I. J Chromatogr A 2003; 1007: 145-155. data otrzymania pracy: 19.10.2010 r. data akceptacji do druku: 10.11.2010 r. Adres do korespondencji: dr n. farm. Grażyna Żydek Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Medycznej Wydział Farmaceutyczny, Uniwersytet Medyczny w Łodzi 90-151 Łódź, ul. Muszyńskiego 1 Tel. +48 42 677 92 15 e-mail: [email protected] 31. Brzezińska E, Kośka G, Klimczak A. Application of thin-layer chromatographic data in quntitative structureactivity relationship assay of thiazole and benzothiazole derivatives with H1-antihistamine activity. II. J Chromatogr A 2003; 1007: 157-164. 32. Brzezińska E, Kośka G. TLC chromatographic data in QSAR assay of thiazole and benzothiazole derivatives with H1-antihistamine activity. Part I. J Planar Chromatogr Modern TLC 2003; 16: 451-457. 33. Brzezińska E, Kośka G. TLC chromatographic data in QSAR assay of thiazole and benzothiazole derivatives with H1-antihistamine activity. Part II. J Planar Chromatogr Modern TLC 2004; 17: 40-45.