MultiMix - Agilent

MultiMix™
Dual-Colour Reagent
Anti-Human Kappa Light Chains/FITC
Anti-Human Lambda Light Chains/RPE
Nr kat. FR481
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Produkt FR481 jest przeznaczony do stosowania w cytometrii przepływowej do jednoczesnego wykrywania i
zliczania łańcuchów lekkich kappa i łańcuchów lekkich lambda. W cytometrii przepływowej, przeciwciała
przeciwko łańcuchom lekkim kappa są przydatne do wykazania obecności łańcuchów lekkich kappa na
powierzchni komórki, a przeciwciała przeciwko łańcuchom lekkim lambda są przydatne do wykazania
obecności łańcuchów lekkich lambda na powierzchni komórki, a zatem do identyfikacji monoklonalności
(nadmiaru klonalności) w chorobach limfoproliferacyjnych limfocytów B wraz z panelem innych przeciwciał (14). Interpretację wyników powinien przeprowadzić pracownik uprawniony do wykonywania takich badań w
oparciu o historię choroby pacjenta oraz inne testy diagnostyczne.
Odczynnik dostarczony
FR481 składa się z dwóch następujących, starannie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych:
Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains skoniugowane z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny
(FITC).
Polyclonal Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains skoniugowane z R-fikoerytryną (RPE).
Obydwa koniugaty Anti-Kappa Light Chains i Anti-Lambda Light Chains w produkcie o numerze kat. FR481
zostały wyprodukowane z fragmentów F(ab')2 króliczych przeciwciał poliklonalnych wyizolowanych na drodze
chromatografii powinowactwa. FR481 jest dostarczany w postaci płynnej w buforze zawierającym 1% albuminę
surowicy bydlęcej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3 o pH 7,2. Jedna fiolka zawiera 50 testów (10 µL koniugatu
przeznaczone jest dla maksymalnie 106 leukocytów z normalnej ludzkiej krwi obwodowej).
Immunogeny
Przeciwciało nr kat.
Fluorochrom
Nr kat. odczynnika kontrolnego
FR481
FITC i RPE
X0935
Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains: Łańcuchy lekkie immunoglobuliny poliklonalnej typu kappa
wyizolowane z puli surowicy ludzkiej.
Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains: Łańcuchy lekkie immunoglobuliny poliklonalnej typu lambda
wyizolowane z puli surowicy ludzkiej.
Swoistość
Odczynnik Anti-Kappa Light Chains reaguje z wolnymi łańcuchami kappa, a także z łańcuchami kappa w
cząsteczkach natywnej immunoglobuliny. Swoistość stwierdzono poniższymi metodami. W celu uzyskania
maksymalnej czułości, przed oczyszczaniem na kolumnie i degradacją pepsyną wykonano test swoistości
metodą immunoelektroforezy krzyżowej.
Immunoelektroforeza krzyżowa: W testach prowadzonych dla przeciwciał w obecności osocza ludzkiego
zachodzi tylko precypitacja związana z łańcuchami kappa. Barwienie: barwnik Coomassie Briliant Blue.
Cytometria przepływowa: Stosując odczynnik Anti-Kappa Light Chains/FITC, tak jak opisano w procedurach
barwienia w połączeniu z Anti-CD19/RPE, HD37 w pełnej krwi ludzkiej poddanej lizie, obserwuje się wzór
barwienia swoisty dla części limfocytów B CD19-dodatnich odpowiadającej spodziewanemu zakresowi
ekspresji łańcucha lekkiego kappa.
Odczynnik Anti-Lambda Light Chains reaguje z wolnymi łańcuchami lambda, a także z łańcuchami lambda w
cząsteczkach natywnej immunoglobuliny. Swoistość stwierdzono poniższymi metodami. W celu uzyskania
maksymalnej czułości, przed oczyszczaniem na kolumnie i degradacją pepsyną wykonano test swoistości
metodą immunoelektroforezy krzyżowej.
Immunoelektroforeza krzyżowa: W testach prowadzonych dla przeciwciał w obecności osocza ludzkiego
zachodzi tylko precypitacja związana z łańcuchami lambda. Barwienie: Barwnik Coomassie Briliant Blue.
Cytometria przepływowa: Stosując odczynnik Anti-Lambda Light Chains/RPE, tak jak opisano w procedurach
barwienia w połączeniu z Anti-CD19/FITC, HD37 w pełnej krwi ludzkiej poddanej lizie, obserwuje się wzór
barwienia swoisty dla części limfocytów B CD19-dodatnich odpowiadającej spodziewanemu zakresowi
ekspresji łańcucha lekkiego lambda.
Cytometria przepływowa: Stosując odczynnik FR481 zgodnie z opisem w procedurze barwienia w pełnej ludzkiej
krwi poddanej lizie, obserwuje się wzór barwienia swoisty dla części limfocytów w spodziewanym zakresie ekspresji
lekkich łańcuchów kappa i lambda.
Analiza cytometryczna zawiesiny pojedynczych komórek ze skrawków tkanek utrwalonych w formalinie i
zatopionych w parafinie wykazała, że odczynnik Anti-Lambda Light Chains znakuje reaktywne przerośnięte węzły
chłonne (10/10 przypadków) podobnie jak odczynnik Anti-Kappa Light Chains (10/10 przypadków). W przypadku
nieziarniczych chłoniaków złośliwych znakowanie przeciwciałem obserwowano w 5/10 przypadków . W pozostałych
przypadkach uzyskiwano albo dodatni wynik reakcji dla łańcuchów lekkich kappa (4/10 przypadków), albo brak
ekspresji łańcuchów lekkich (1/10 przypadków) (4).
Analiza cytometryczna limfocytów krwi obwodowej wykazała, że odczynniki Anti-Kappa Light Chains i Anti-Lambda
Light Chains odpowiednio znakują część przewlekłych białaczek limfatycznych B-komórkowych. W jednym
badaniu, na 121 przypadków (2), 37 było dodatnich dla łańcuchów kappa, a 17 było dodatnich dla łańcuchów
lambda. W innym badaniu, na 165 przypadków (3), 97 było dodatnich dla łańcuchów kappa, a 68 było dodatnich
dla łańcuchów lambda.
(107839-003)
FR481/PL/MTH/11.03.05 s. 1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Środki ostrożności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stężeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, może reagować
z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych
azydków metali. Po usunięciu spłukać dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w
kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych należy stosować
właściwe procedury postępowania.
Przechowywanie
Przechowywać w ciemnym miejscu w temp. 2-8 C. Nie używać po upłynięciu daty ważności podanej na
etykiecie fiolki. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane powyżej, użytkownik musi
zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na utratę stabilności produktu. Dlatego
jednocześnie z badaniem próbek pacjenta należy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. Jeśli wystąpi
nieoczekiwany wzór barwienia, którego nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych i istnieje
podejrzenie, że przyczyną może być problem z przeciwciałem, należy niezwłocznie skontaktować się z Działem
Pomocy Technicznej naszej firmy.
Wykonanie odczynu
Przed wykonaniem odczynu na próbkach krwi obwodowej należy poprzez odwirowanie wyizolować komórki
jednojądrowe na medium separującym lub przepłukać próbkę krwi w celu usunięcia rozpuszczalnych białek
surowicy. Ponieważ ludzkie monocyty wiążą immunoglobuliny surowicy za pośrednictwem ich receptorów
powierzchniowych Fc, komórki takie należy usunąć lub zidentyfikować.
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej
o wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 2 mL PBS (nr kat. Dako S3024). Delikatnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
3.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
4.
Powtórzyć etapy 2 i 3 jeszcze dwukrotnie.
5.
Dodać 10 µL frakcji immunoglobulin króliczych (nr kat. Dako X0903) w charakterze odczynnika
blokującego. Wymieszać delikatnie mieszadłem wibracyjnym i inkubować probówkę przez 30 minut w
temperaturze 37 °C.
6.
Dodać 10 µL FR481 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
7.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2 –8 °C lub przez 15-30 minut
w temperaturze pokojowej (20-25°C).
8.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
9.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
10.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
11.
Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS i odtworzyć zawiesinę komórek za pomocą mieszadła
wibracyjnego.
12.
Powtórzyć etap 10.
13.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
14.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności
i temperaturze 2–8°C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie wykonywania
odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne w
celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 6: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą się
zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie
w każdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do odczynnika ze sprzężonymi przeciwciałami. Zalecanym dwubarwnym odczynnikiem kontrolnym
dla FR481 jest odczynnik Dako o numerze kat. X0935.
Etapy 8 i 9: Jeśli używany jest inny odczynnik do lizy komórek, należy przy jego doborze kierować się
poniższymi zaleceniami. Należy zauważyć, że jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza
(np. Dako EasyLyse™, nr kat. S2364) PBS w kroku 13 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba że
próbka zostanie przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 14: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej ilości komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca ekspresji
antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru.
(107839-003)
FR481/PL/MTH/11.03.05 s. 2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Piśmiennictwo
1.
Johnson A, Olofsson T. Flow cytometric clonal excess analysis of peripheral blood, routine handling, and
pitfalls in interpretation. Cytometry 1993;14:188-95.
2.
Cartron G, Linassier C, Bremond JL, Desablens B, Georget MT, Fimbel B, et al. CD5 negative B-cell
chronic lymphocytic leukemia: clinical and biological features of 42 cases. Leuk Lymphoma 1998;31:20916.
3.
Gandini D, Lanza F, Latorraca A, Levato F, Del Senno L, Castoldi G. Immunophenotypic and genotypic
characterization of B-cell chronic lymphocytic leukemia patients from Northern Italy. Haematologica
1993;78:18-24.
4.
Leers MPG, Theunissen PHMH, Ramaekers FCS, Schutte B, Nap M. Clonality assessment of
lymphoproliferative disorders by multiparameter flow cytometry of paraffin-embedded tissue: an additional
diagnostic tool in surgical pathology. Hum Pathol 2000;31:422-7.
Objaśnienie symboli
(107839-003)
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
Zużyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Chronić przed światłem
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
FR481/PL/MTH/11.03.05 s. 3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17