Ćwiczenie nr 10 - Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii
Mikrobiologia ogólna
Wydział Farmaceutyczny
z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Biotechnologia medyczna rok II /Io
Instrukcja do ćwiczeń
Temat: Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na drobnoustroje – Cz.1/Cz.2
I. Część teoretyczna
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Mechanizm działania światła widzialnego oraz promieniowania UV na bakterie: fotodynamiczne uczulenie i
fotoreaktywacja.
Wpływ temperatury, napięcia powierzchniowego, ciśnienia osmotycznego, stężenia jonów wodorowych i jonów
metali ciężkich na mikroorganizmy.
Punkt i czas śmierci cieplnej.
Mechanizm bakteriostatycznego działania barwników.
Rodzaje środków dezynfekcyjnych oraz ich oddziaływanie na mikroorganizmy.
Antybiotyki i sulfonamidy.
Główne klasy antybiotyków oraz mechanizmy ich działania.
Metody badania lekooporności mikroorganizmów.
Oporność na leki przeciwbakteryjne.
II. Część praktyczna
Przygotowanie zawiesiny wyjściowej badanych szczepów bakterii

Pobrać za pomocą ezy materiał z 24-godz. hodowli E. coli i B. subtilis na płytkach z agarem
odżywczym i przenieść do probówek z solą fizjologiczną (0,85%) i przygotować zawiesiny, których
gęstość optyczna, zmierzona przy użyciu densytometru, wynosić będzie 1,00 (standard 4,0 według
skali McFarlanda), co odpowiada stężeniu komórek bakterii na poziomie 12 × 108 /ml.
Gęstość optyczna (OD) zawiesin bakteryjnych
Standard
(wg skali
McFarlanda)
0,5
1
2
3
4
5
6
7

Stężenie komórek bakterii
x 108 / ml
OD (550 nm)
1,5
3
6
9
12
15
18
21
0,125
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
Przygotowane zawiesiny użyć do poniższych badań.
A. Wpływ czynników fizycznych:
1.
Wpływ obniżonej i podwyższonej temperatury
 Dla każdego szczepu przygotować po 3 probówki z pożywką bulionową.
 Każdą probówkę zaszczepić 0,1 ml zawiesiny wyjściowej.
o
 Jedną z probówek umieścić w łaźni wodnej i ogrzewać w temp. +80 C przez 15 min, drugą probówkę poddać
o
30-minutowej inkubacji w temp. –80 C, natomiast trzecią zachować jako kontrolną.
o
 Wszystkie probówki poddać 24-godzinnej inkubacji w temp. 37 C.
 Odczyt: porównać zmiany w zaszczepionych pożywkach i wyjaśnić różnice we wzroście bakterii.
1
2.
Wpływ ciśnienia osmotycznego
 Dla każdego szczepu przygotować po 5 probówek z pożywką uniwersalną, w której zróżnicowano ciśnienie
osmotyczne przez dodatek 0, 1, 10, 20 i 50% glukozy.
 Każdą probówkę zaszczepić 0,1 ml zawiesiny wyjściowej.
o
 Wszystkie probówki poddać 24-godzinnej inkubacji w temp. 37 C.
 Odczyt: porównać wrażliwość poszczególnych szczepów na ciśnienie osmotyczne pożywki, a uzyskane wyniki
zestawić w tabeli. Wyciągnąć wnioski.
Szczep
0
1
Wzrost przy stężeniu glukozy [%]
10
20
50
E. coli
B. subtilis
3.
Wpływ napięcia powierzchniowego
 Dla każdego szczepu przygotować probówkę z pożywką bulionową.
 Do jednej z probówek dodać po 1 ml detergentu w celu silnego obniżenia napięcia powierzchniowego.
 Każdą probówkę zaszczepić 0,1 ml zawiesiny wyjściowej.
o
 Wszystkie probówki poddać 24-godzinnej inkubacji w temp. 37 C.
 Odczyt: porównać wzrost bakterii na pożywce z dodatkiem i bez dodatku detergentu. Wyjaśnić otrzymane
różnice.
4.
Wpływ promieniowania UV
 Dla każdego szczepu przygotować po cztery płytki z agarem odżywczym.
 Z zawiesiny wyjściowej danego szczepu przenieść na każdą płytkę po 0,1 ml i rozprowadzić równomiernie po
całej powierzchni sterylną głaszczką. Odczekać ok. 5 minut do momentu wchłonięcia się inoculum.
 Po trzy zaszczepione płytki dla każdego szczepu poddać działaniu promieniowania UV, odpowiednio przez 1, 5
i 15 minut, natomiast czwartą (nie naświetlaną) pozostawić jako kontrolną.
o
 Po naświetleniu zamknąć płytki i poddać 24-godzinnej inkubacji w temp. 37 C.
Uwaga!
Wszystkie czynności przy naświetlaniu należy wykonywać w rękawiczkach i w ciemnych okularach ochronnych.
Nie należy kierować wzroku na źródło promieniowani, a także na promienie odbite.

Odczyt: Obejrzeć i opisać wzrost poszczególnych szczepów na płytkach naświetlanych i porównać z płytka
kontrolną. Wyciągnąć wnioski.
Szczep
Czas ekspozycji [min.]
1
5
0
15
E. coli
B. subtilis
B. Wpływ czynników chemicznych:
1.
Wpływ stężenia jonów wodorowych
 Dla każdego szczepu przygotować po 3 probówki z pożywką bulionową, o odpowiedniej wartości pH, tj. 4,0;
7,0 i 11,0.
 Każdą probówkę zaszczepić 0,1 ml zawiesiny wyjściowej.
o
 Wszystkie probówki poddać 24-godzinnej inkubacji w temp. 37 C.
 Odczyt: porównać wrażliwość poszczególnych szczepów na odczyn pH i wyniki zestawić w tabeli. Wyciągnąć
wnioski.
Szczep
Wzrost przy pH
7,0
4,0
E. coli
B. subtilis
2
11,0
2.
Działanie barwników na wzrost drobnoustrojów
 Przygotować roztwory fioletu krystalicznego: 1: 1000, 1: 10 000 i 1: 50 000.
 Rozpuścić agar odżywczy w probówkach (3 x 9 ml), a następnie schłodzić.
 Do probówek z agarem odżywczym wprowadzić po 1 ml przygotowanych roztworów barwników uzyskując
końcowe stężenia fioletu krystalicznego: 1: 10 000, 1: 100 000 i 1: 500 000.
 Agar odżywczy z barwnikami wylać na jałowe płytki Petriego i pozostawić do zestalenia.
 Równocześnie przygotować płytkę kontrolną bez dodatku barwników.
 Poszczególne płytki podzielić na dwa sektory (odpowiednio dla badanego szczepu bakterii).
 Przy pomocy ezy dokonać posiewu każdego szczepu, pobierając materiał z 24-godz. hodowli E. coli i B. subtilis
na płytkach z agarem odżywczym.
o
 Wszystkie płytki poddać 48-96-godzinnej inkubacji w temp. 37 C.
 Odczyt: dokonać oceny wzrostu poszczególnych szczepów w obecności różnych stężeń barwników, a
uzyskane wyniki zestawić w tabeli. Wyciągnąć wnioski.
Szczep
1: 10 000
Wzrost przy stężeniu barwnika
Fiolet krystaliczny
1: 100 000
1: 500 000
Kontrola
-
E. coli
B. subtilis
(+++) wzrost obfity, (++) wzrost umiarkowany, (+) wzrost słaby, (-) brak wzrostu.
3.
Wpływ środków dezynfekcyjnych na wzrost drobnoustrojów
 Przygotować po trzy probówki zawierające po 10 ml 5% r-r fenolu oraz po jednej probówce zawierającej po
10 ml roztworu soli fizjologicznej dla każdego szczepu bakterii.
 Dodać do każdej probówki z fenolem po 1 ml zawiesiny wyjściowej danego szczepu i wymieszać.
 Po 5, 15 i 30 minutach przenieść po 0,1 ml z każdej probówki do probówek z pożywką bulionową.
 Równocześnie do probówek z roztworem soli fizjologicznej (10 ml) wprowadzić po 1 ml zawiesiny wyjściowej
danego szczepu, a następnie przenieść po 0,1 ml do pożywki bulionowej (kontrola wzrostu).
o
 Wszystkie probówki poddać 24-godzinnej inkubacji w temp. 37 C.
 Odczyt: dokonać oceny wzrostu poszczególnych szczepów eksponowanych na różne stężenia środków
dezynfekcyjnych , a uzyskane wyniki zestawić w tabeli. Wyciągnąć wnioski.
Czas ekspozycji [min]
Szczep
5
15
30
E. coli
B. subtilis
(+++) wzrost obfity, (++) wzrost umiarkowany, (+) wzrost słaby, (-) brak wzrostu.
3