Wybrane aspekty standaryzacji wyciagów

T E R A P I A
Wybrane aspekty
standaryzacji
wyciagów
alergenowych (czeϾ
Dr n.med.
Piotr Z. Brewczyñski
Wojewódzka
Poradnia
Alergologiczna
w Katowicach
I)
Summary
I the course of the Twentieth Century the development of standardisation extracts procedures has
been observed.
The initial phase was based on physical-chemical methods (Noon units, wt/vol units, PNU) and
than the next step was tackling the biological methods, which allowed for mesuring of allergenic
extracts potency. Biological methods, which are based on skin tests conducted on a limited
number of allergic volunteers or RAST inhibition technique applied in relation to human pool serum
are based upon major allergen not providing any substantial information about minor allergens.
Standardisation in mass units of major allergens produces the right step toward creation of
allergenic products close to pharmaceuticals.
So far, there is no full compatibility in the field of production and standardisation of allergenic
extracts between European Union Coutries and the USA.
Prof. dr hab.n.med.
Edward Zawisza
Katedra i Klinika
Otolaryngologii.
Poradnia
Alergologiczna
SPCSK - AM
w Warszawie
...............................................
Na przestrzeni XX-wieku obserwowaliœmy stopniowy rozwój procedur standaryzacyjnych dotycz¹cych wyci¹gów alergenowych.
Rozwiniêto je pocz¹wszy od metod fizykochemicznych (jednostki Noona, wagowoobjêtoœciowe oraz PNU) po pozwalaj¹ce na ocenê mocy wyci¹gu alergenowego metody
biologiczne. Te ostatnie opieraj¹c siê na testach skórnych u ograniczonej iloœci uczulonych ochotników lub technice hamowania RAST zastosowanej w stosunku do surowicy
zbiorczej opieraj¹ siê na alergenach g³ównych nie informuj¹c jednak o alergenach
mniejszych.
Standaryzacja w jednostkach masy alergenów g³ownych stanowi w³aœciwy krok
w stronê tworzenia produktów alergenowych o parametrach zbli¿onych do farmaceutyków.
Jak dot¹d brak jest pe³nego konsensusu w dziedzinie produkcji i standaryzacji
wyci¹gów alergenowych pomiêdzy Uni¹ Europejsk¹ i USA.
S
tandard jest to cyt.: za s³ownikiem jêzyka
polskiego: "przeciêtny typowy model; wzorzec; gatunek jakiegoœ wyrobu odpowiadaj¹cy okreœlonym wymogom; norma", zaœ
standaryzacja to cyt.: "wprowadzenie standardów
do produkcji; ograniczenie wielu gatunków wyrobów do niewielkiej liczby typowych pozwalaj¹cych
na racjonalizacjê produkcji" (3).
Standaryzacja wyci¹gów alergenowych
obejmuje:
• identyfikacjê i charakteryzacjê materia³u Ÿród³owego z którego wyci¹g pochodzi (w znaczeniu obecnoœci / nieobecnoœci pojedynczych sk³adników i ich stê¿eñ),
• pomiar mocy wyci¹gu (w rozumieniu aktywnoœci biologicznej tu jego ca³kowitej aktywnoœci alergenowej),
• przyporz¹dkowanie wyci¹gowi jednostek
zgodnych z metod¹ wykorzystan¹ do przeprowadzenia standaryzacji.
Zasadniczym celem standaryzacji jest jednoczesne utrzymanie sk³adu i mocy (aler-gennoœci)
wyci¹gów na sta³ym poziomie. Do jego osi¹gniêcia d¹¿y siê pomimo obserwo-wanej naturalnej
zmiennoœci wielu Ÿróde³ alergenowych (1).
Warto bowiem pamiêtaæ ¿e to one s³u¿¹ dalej
do kreowania preparatów diagnostycznych testów
prowokacyjnych (skórnych, donosowych,
do sp oj ów ko wy ch , do os kr ze lo wy ch ) lu b
szczepionek alergenowych.
Historia a teraŸniejszoœæ
Analizuj¹c przesz³oœæ, wyodrêbniæ mo¿na kilka
Lato 2004
A L E R G I A 55
T E R A P I A
etapów rozwoju procedur standaryzacyjnych.
Najwczeœniejsz¹ metodê wprowadzi³ w 1911
1
TABELA
Klasyczna biologiczna standaryzacja wyci¹gów alergenowych
Nordycka jednostka
biologiczna
(BU/ml = Nordic
Biological Unit)
Biorównowa¿na
jednostka alergii
(BAU/ml = Bioequivalent
Allergy Unit)
Pacjenci
20 nie wyselekcjonowanych
(przeciêtnie uczulonych)
15 wyselekcjonowanych
(silnie uczulonych)
Metodyka
Odczyn skórny wywo³any
technik¹ punktow¹
Odczyn wywo³any
technik¹ œródskórn¹
B¹bel
Rumieñ
Histamina
Sam alergen
obliczanie wyników
Œrednia geometryczna
Œrednia arytmetyczna
Dawkowanie
badanego wyci¹gu
10-krotny przyrost
(100; 10; 1;
0,1; 001;)
3-krotny przyrost
(100; ~33,3; ~11,1; ~3,7;
~1,23; ~0,41; ~0,14;
~0,05; ~0,02)
wyk³adnik kliniczny
ocenianej reakcji
punkt odniesienia
przy oznaczaniu
aktywnoœci
roku angielski immunolog Leonard Noon (18781913). Przyporz¹dkowa³ on arbitralnie 1 gramowi
py³ku traw 1 milion jednostek Noon'a. Jednostki te
opiera³y siê, zatem na ocenie wagi py³ku roœlin.
Drugi w historii system opiera³ siê na
okreœlaniu wyci¹gów alergenowych przy pomocy
stosunku wagi materia³u wyjœciowego (w dzisiejszym ujêciu - Ÿród³a alergenowego) do objêtoœci
p³ynu s³u¿¹cego do sporz¹dzenia wyci¹gu.
W ci¹gu kolejnych lat, system ten zwany wagowo
/objêtoœciowym (w/v) rozwin¹³ siê i dotycz¹c
obecnie, ci¹gle jeszcze, najwiêkszej iloœci Ÿróde³
alergenowych, jest wci¹¿ jednym z najszerzej
u¿ywanych w praktyce klinicznej np. w USA.
W 1933 roku, kiedy sta³o siê oczywiste, ¿e
wiêkszoœæ alergenów jest bia³kami, zaproponowano stosowanie jednostek azotu bia³kowego (PNU)
tj. ocenianie wyci¹gu alergenowego na podstawie
iloœciowego pomiaru zawartoœci wszystkich bia³ek
wystêpuj¹cych w roztworze.
O ile zarówno metoda Noon'a jak i metoda
wagowo/objêtoœciowa nie pozwala³y na dokonanie
jakichkolwiek pomiarów zawartoœci alergenów
1
TABELA
Firma
A
B
C
D
E
F
G
H
56 A L E R G I A
Zmiennoœæ sk³adu wyci¹gu alergenowego z roztocza
D. pteronyssinus o tej samej aktywnoœci biologicznej
(10 000 BAU/ml) produkowanego przez ró¿ne firmy
Grupa I
µg/ml
Grupa II
µg/ml
Grupa
I+II
WskaŸnik
Gr I:II
45
70
120
110
81
101
8
100
45
70
120
110
81
101
8
100
112
131
207
210
196
198
121
215
0,69
1,15
1,38
1,11
0,85
1,04
0,07
0,87
Lato 2004
w wyci¹gu, o tyle metod¹ oceny azotu bia³kowego
(PNU) oznaczano pe³n¹ pulê bia³ek. Przy jej
pomocy nie mo¿na by³o jednak rozró¿niæ
biologicznie aktywnych alergenów od innych
bia³ek a wiêkszoœæ spoœród wytr¹canych bia³ek
nie by³a alergenami.
Tak, wiêc bior¹c ponadto pod uwagê, i¿
zmiana warunków ekstrakcji mo¿e wieœæ do
istotnej zmiennoœci w sk³adzie i mocy wyci¹gów
alergenowych a tak¿e, ¿e jakoœæ tych wyci¹gów
mo¿e siê pogarszaæ bez jakiejkolwiek zmiany
w zakresie zawartoœci wystêpuj¹cych w nich
bia³ek, wyraŸnie widaæ ograniczonoœæ wszystkich
tych trzech metod standaryzacyjnych.
Po okresie klasycznych ocen fizykochemicznych, najistotniejszym prze³omem w standaryzacji
by³o uwzglêdnienie, w³asnoœci biologicznych wyci¹gów alergenowych.
Argumenty przemawiaj¹ce na korzyœæ standaryzacji opartej o przeciwcia³a klasy E wydawa³y siê
byæ oczywiste. Immunoglobuliny te s¹ przecie¿
izotypem odpowiedzialnym za alergie typu
natychmiastowego i pozostaj¹ w bezpoœrednim
zwi¹zku z ich obrazem klinicznym.
Ocena pomiaru mocy wyci¹gu alergenowego
w ramach standaryzacji biologicznej obejmuje
metody in vivo i in vitro.
Do metod in vivo nale¿¹ punktowe testy skórne
i testy œródskórne, zaœ do metod in vitro: blokowanie RAST, test uwalniania histaminy, test ELISA
okreœlaj¹cy zawartoœæ alergenów g³ównych oraz
ocena aktywnoœci enzymatycznej.
W celu dokonania pomiaru wspomnianej mocy (si³y) wyci¹gu niezbêdna jest albo grupa uczulonych pacjentów, albo zawieraj¹ca mo¿liwie
wszystkie potencjalne klony IgE "zlewka" ich
indywidualnych surowic zwana surowic¹ zbiorcz¹.
W chwili obecnej, ci¹gle jeszcze obowi¹zuje
klasyczna standaryzacja biologiczna alergenów a
do licz¹cych siê w tej metodzie systemów nale¿¹
System Nordycki i System Amerykañski. W Systemie Nordyckim aktywnoœæ preparatów alergenowych zarówno diagnostycznych jaki leczniczych
wyra¿ona jest w BU/ml = Nordic Biological Unit
(Nordyckich jednostkach biologicznych) (2), zaœ
w Systemie Amerykañskim aktywnoœæ takich preparatów do 1991r wyra¿ana by³a w AU/ml =
Allergy Unit (Amerykañskich jednostkach alergii)
a obecnie w BAU/ml= Bioequivalent Allergy Unit
(Biorównowa¿nych jednostkach alergii) (4). Porównanie obu tych systemów zawarto w Tabeli 1.
Przyjêcie do okreœlania stê¿eñ badanego
wyci¹gu alergenowego skali dziesiêtnej mo¿liwe
by³o ze wzglêdu na zastosowanie w Systemie
Nordyckim techniki mniej czu³ych punktowych
testów skórnych. Z kolei potrójna skala w systemie
Amerykañskim okaza³a siê lepszym rozwi¹zaniem
w stosunku do czulszych testów œródskórnych.
Oko³o dwa "skoki" w skali rozcieñczeñ potrójnych
odpowiadaj¹ jednemu "skokowi" w skali dziesiêtnej. Objêtoœæ œródskórnie podawanego roztworu
wynosi 0,05ml.
Œródskórny punkt koñcowy, dotycz¹cy
ka¿dego z osobników w badanej grupie, jest
wyra¿ony liczb¹ okreœlaj¹c¹ w potrójnej skali takie
rozcieñczenie wyci¹gu alergenowego, przy którym
zsumowana œrednica wytworzonego rumienia
T E R A P I A
wynosi 50 mm.
W celu zdefiniowania jednostek alergenowych
przydatnych do okreœlania mocy ekstraktu, u¿ywa
siê œrednich wartoœci z rozcieñczeñ jednostkowych dotycz¹cych poszczególnych badanych.
Œrednie te wyliczane s¹ dla ca³ej badanej grupy
(w systemie amerykañskim np. dla min.15 osób).
St¹d, zatem, im dany wyci¹g jest s³abszy, tym
ni¿sze jego rozcieñczenie da ten sam efekt
biologiczny (tu np. rumieñ okreœlonej wielkoœci),
co dopiero najwy¿sze rozcieñczenie w przypadku
najmocniejszego wyci¹gu.
Innymi s³owy, potrzeba zaanga¿owania
najwy¿szych rozcienczeñ dla uzyskania tej samej
odpowiedzi biologicznej, co w przypadku s³abszych roztworów, œwiadczy o najwiêkszej mocy
alergenowej badanego roztworu. Wyci¹g alergenowy o wartoœci œredniej rozcieñczenia wynosz¹cej 12,9 odpowiada jeszcze aktywnoœci 10.000
BAU a wyci¹g alergenowy o wartoœci równej 13,1
ju¿ aktywnoœci 100.000 BAU.
Jako ¿e, standaryzacja biologiczna przeprowadzana jest zwykle jedynie u oko³o 15 do 20
ochotników, opiera siê ona na œredniej odpowiedzi
odnotowywanej wœród wy¿ej wymienionych
badanych, zdeterminowanej w du¿ym stopniu na
alergenach g³ównych. Alergeny mniejsze nie
wp³ywaj¹ w sposób statystycznie istotny na
okreœlenie jednostek w wyci¹gach alergenowych.
St¹d te¿, trzeba mieæ œwiadomoœæ, ¿e
standaryzacja biologiczna nie zwiêksza
bezpieczeñstwa i jakoœci zastosowañ wyci¹gów
alergenowych u - wprawdzie mniej licznych, ale
istniej¹cych pacjentów uczulonych dominuj¹co
na alergeny mniejsze.
Przyjêcie jako metody standaryzacyjnej techniki
testów skórnych ogranicza jej wartoœæ przy ocenie
wyci¹gów, w których wystêpuj¹ liczne (nie zaœ
pojedyncze) alergeny g³ówne. Trzeba siê tu
bowiem liczyæ z faktem, ¿e na wyniki
przeprowadzonych badañ istotny wp³yw maj¹
indywidualne profile IgE tych pacjentów.
W 1974 r - a wiêc krótko po wprowadzeniu do
pomiaru stê¿enia przeciwcia³ klasy E testu
radioalergosorpcji (RAST) w celu przeprowadzenia oceny biologicznej aktywnoœci wyci¹gów
alergenowych, zaczêto wykorzystywaæ technikê
hamowania tego testu. Oparta jest ona na
wspó³zawodnictwie o przeciwcia³o zawarte w surowicy miedzy antygenem w ekstrakcie i alergenem zwi¹zanym z faz¹ sta³¹ (5).
Im mniej przeciwcia³ zwi¹¿e siê np. z kr¹¿kiem
celulozowym tym wyci¹g alergenowy jest mocniejszy. Ka¿da z firm posiada swoje wewnêtrzne
wzorce. 50% hamowanie RAST dotycz¹ce
wzorcowego wyci¹gu alergenowego ma miejsce
w sytuacji " posiadania przezeñ" okreœlonych w mg
iloœci bia³ka. Porównuj¹c badany wyci¹g
alergenowy (pochodz¹cy z nowej serii z nowego
materia³u wyjœciowego) z wyci¹giem wzorcowym,
mo¿na okreœliæ jego aktywnoœæ i zdecydowaæ
o dalszym u¿yciu lub odrzuceniu (zbyt niska
aktywnoϾ) z produkcji.
Rok 1990 przyniós³ ze sob¹ standaryzacjê
w jednostkach masy alergenów g³ównych (Ryc 1).
P³yn¹c¹ z niej korzyœci¹ jest istotne zminimalizowanie zmiennoœci miêdzy poszczególnymi seriami
produktów alergenowych. Realizacja polega na
w³¹czeniu nowej kontroli tj. ustalaniu stê¿enia
2
RYSUNEK
Biotransformacja histaminy
ka¿dego klinicznie istotnego alergenu w roztworach o biologicznie zdefiniowanej aktywnoœci
a tak¿e na ustalaniu efektywnej dawki alergenów
(aktywnych sk³adników) mierzonych w mg/ml
wyci¹gu.
O tym jak jest to istotne, przekonuje analiza
wyci¹gów alergenowych pochodz¹cych z siedmiu
firm spoœród których czêœæ ró¿ni siê diametralnie
w ocenie zawartoœci poszczególnych alergenów
g³ównych choæ wszystkie maj¹ tê sam¹ moc
(aktywnoœæ biologiczn¹) (patrz tab 2) (1).
Szczegó³owe dane na ten temat podobnie jak
i innych aspektów wp³ywu Ÿróde³ alergenowych na
jakoœæ sporz¹dzanych z nich wyci¹gów a tak¿e na
temat zasad produkcji wg GMP oraz znaczenia
standaryzacji wyci¹gów alergenowych w praktyce
klinicznej s¹ przedmiotem drugiej czêœci
niniejszego opracowania.
Standaryzacja wyci¹gów alergenowych na
terenie Unii Europejskiej przeprowadzana jest
w oparciu o wewn¹trz firmowe preparaty
cd. na str XX
1
TABELA
Dokumenty prawne dotycz¹ce produktów alergenowych.
Dokumenty prawne dotycz¹ce produktów alergenowych
1980
1989
Unia
Europejska
USA
1991
Wytyczne Nordyckie
nt. Rejestracji Preparatów Alergenowych
Wytyczna 89/342/EEC. Wyci¹gi alergenowe s¹
przedmiotem wymogów legislacji farmaceutycznej Unii
Europejskiej w zakresie badania ich jakoœci, bezpieczeñstwa i skutecznoœci oraz autoryzacji marketingowej
Wytyczna 91/507/EEC. Analityczne, farmakotoksykologiczne oraz kliniczne standardy i protoko³y pozostaj¹
w zgodzie z badaniami produktów leczniczych
1992
CPMP III9271/90-EN. Notatka
nt. Poradnictwa dotycz¹cego Produktów Alergenowych
1997
Farmakopea Europejska. Monografia
nt. Produktów Alergenowych
1981
Zespó³ d/s Przegl¹du Wyci¹gów Alergenowych
1989
FDA 21 CFR czêœci 600, 610 i 680. Wyci¹gi
Alergenowe. Ocena skutecznoœci - przegl¹d.
Proponowane zasady produkcji
1994
CBER, FDA. Metody testowania produktów alergenowych.
Monografia testów "in vivo" i “in vitro" s³u¿¹cych
standaryzacji alergenów
A L E R G I A 57