Drogi rozpadu kwasów nukleinowych. Rozpad kwasów

Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
187
Drogi rozpadu kwasów nukleinowych. Rozpad kwasów nukleinowych w organizmie zachodzi bardzo szybko. Na przykład, czas połowicznej przemiany DNA
w tkankach myszy wynosi od 1 do 5 dób, a większości mRNA – kilka dób, natomiast u prokariotów – tylko kilka sekund.
Kwasy nukleinowe (DNA i RNA) rozkładają się w organizmie za pośrednictwem specyficznych enzymów – nukleaz. Przyspieszają one reakcję rozerwania
międzynukleotydowych wiązań fosfodiestrowych w cząsteczkach kwasów nukleinowych i należą w ten sposób do dużej kategorii enzymów – fosfodiesteraz.
Nukleazy, działające na wewnętrzne wiązania nukleotydowe w cząsteczkach
DNA i RNA, nazywane są endonukleazami. Z ich udziałem zachodzi depolimeryzacja kwasów nukleinowych (głównie do oligonukleotydów). Nukleazy, które przyspieszają reakcje kolejnego odszczepienia nukleotydów od RNA, DNA lub ich fragmentów, zaczynając od końca łańcucha polinukleotydowego, nazywane są egzonukleazami. Zapewniają one rozkład kwasów nukleinowych do wolnych nukleotydów.
W zależności od specyfiki działania pośród nukleaz wyróżnia się rybonukleazy
oraz dezoksyrybonukleazy. Pierwsze z nich przyspieszają reakcje rozpadu tak wewnętrznych, jak i zewnętrznych (końcowych) międzynukleotydowych wiązań
w cząsteczkach RNA. Drugie pełnią tę samą funkcję w stosunku do DNA. Jednakże istnieje duża grupa niespecyficznych endo- i egzonukleaz, działających jednocześnie na RNA i DNA.
Zgodnie z charakterem działania na wiązania fosfodiestrowe w cząsteczkach
kwasów nukleinowych nukleazy podzielone są na dwie kategorie. Jedne z nich
przyspieszają reakcję hydrolizy wiązania estrowego międzynukleozydowego fosforanu, zawierającego 3`-atom węgla reszty rybozy lub dezoksyrybozy, natomiast
drugie – fosforanu zawierającego 5`-atom węgla. Nazwa wymienionych fragmentów zawsze zawiera informację, hydrolizę którego z wiązań przyspiesza nukleaza.
Jednak główną ich cechą jest lokalizacja fosforanu w składzie oligo- lub mononukleotydów, powstających w wyniku hydrolizy kwasu nukleinowego. Dlatego nukleazy, które rozszczepiają wiązanie P–3`C nazywane są 3`-nukleazami, natomiast
te, które rozszczepiają wiązanie P– 5`C nazywane są 5`-nukleazami:
188
Podstawy biochemii
Najważniejszymi grupami nukleaz są:
Dezoksyrybonukleazy I (dezoksyrybonukleino-5`-oligonukleotydohydrolazy)
przyspieszają hydrolizę fosfodiesterowych wiązań w DNA pomiędzy resztą fosforanu i 3`-atomem węgla reszty dezoksyrybozy: DNA + (n – 1) H2O → n oligodezoksyrybonukleotydów. Przykładami DNAaz I są DNAazy trzustkowe (M ≈ 31.000).
Pierwszorzędowa struktura DNAazy trzustkowej byka została zdefiniowana: zawiera
jeden polipeptydowy łańcuch, który składa się z 257 reszt aminokwasów. Wielkość
pH roztworów DNAaz dla ich optymalnego działania (optymalna pH) leży w granicach 6,8-8,0. Enzym aktywowany jest przez kationy Mn2+ i Mg2+, a inhibitorami są
aniony, wiążące te kationy, jak również oligonukleotydy. Mechanizm działania
trzustkowych DNAaz na DNA polega na tym, że na początku zachodzi rozerwanie
fosfodiestrowych wiązań w jednym z łańcuchów DNA. Rozerwanie pary łańcuchów
zachodzi bardzo rzadko, dlatego depolimeryzacja nie rozpoczyna się natychmiast.
Końcowy produkt przemiany DNA za pomocą trzustkowej DNAazy zawiera śladowe ilości dezoksyrybonukleozydo-5`-fosforanów, niewiele dinukleotydów i dużą
ilość oligodezoksyrybonukleotydo-5`-fosforanów, zawierających średnio 4 monomery. Trzustkowa DNAaza byka istnieje w postaci czterech form.
Dezoksyrybonukleazy II (dezoksyrybonukleino-3`-oligonukleotydohydrolazy)
rozkładają DNA do oligodezoksyrybonukleotydo-3`-fosforanów o średniej długości 6 jednostek oraz do niewielkiej ilości dezoksyrybonukleozydo-3`-fosforanów.
Masa cząsteczkowa DNAazy II śledziony równa jest 38.000, optymalna pH jej
roztworu wynosi 4,5-5,5. Jej cząsteczka zawiera 343 reszt aminokwasów oraz
składnik węglowodanowy, którego jednostką strukturalną jest glukozoamina. Enzym może być aktywowany przez jony Mg2+, hamowany przez jony SO42-, PO43-,
AsO43-, kopolimery AU, TRNA. Depolimeryzacja DNA zachodzi przez rozerwanie
pary fosfodiestrowych wiązań w cząsteczce DNA, w wyniku czego zachodzi szybko kumulacja jej dużych fragmentów. Szczególnie efektywnie atakowane są wiązania, ułożone z parzystych kombinacji GG i AC. Przypuszcza się, że DNAazy II
są dimerami.
Oprócz DNAazy I i II istnieje duża grupa endonukleaz, które atakują DNA, zawierające zarówno dwa, jak i jeden łańcuch. Na przykład, istnieje 7 DNAaz pałeczki okrężnicy, pośród których 4 są niskocząsteczkowe (12-33 tys. Da) i 3 makrocząsteczkowe (68-114 tys. Da).
Egzodezoksyrybonukleazy przyspieszają reakcję hydrolizy cząsteczek DNA
z utworzeniem dezoksyrybonukleozydo-5`-fosforanów. Z pałeczki okrężnicy wydzielono 8 egzodezoksyrybonukleaz (I – VIII), które różnią się regioselektywnością reakcji. Na przykład, egzodezoksyrybonukleaza III (M = 30.000) może odszczepić 3`-fosforan od końcowego nukleotydu fragmentów cząsteczki DNA.
Restryktazy – DNAazy pochodzenia bakteryjnego, które rozszczepiają obce
(fagowe) DNA w ściśle określonym miejscu, rozpoznawanym przez enzym. Miejsce to ma palindromową strukturę. Niżej podane są dwa przykłady, gdzie ↔ wskazuje miejsce hydrolizy fosfodiestrowych wiązań:
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
5`-G↔AATTC-3`
3`-CTTAA↔G-5`
189
restryktaza pałeczki okrężnicy I (Eco RI);
M = 116000, tetramer (29000 × 4)
5`-N↔CCAGGN-3` restryktaza pałeczki okrężnicy II (Eco RII);
3`-NGGTCC↔N-5` M = 80000, dimer (40000 × 2)
W zależności od położenia miejsca rozpoznania oraz punktu rozszczepienia
DNA przez restryktazy wyróżnia się restryktazy typu I (sekwencja rozpoznania
daleko, w odległości setek reszt nukleotydowych od punktu rozszczepienia), typu
II (rozszczepienie wewnątrz sekwencji rozpoznania) lub typu III (rozszczepienie
pobliżu sekwencji rozpoznania). Wydzielono i opisano ok. 2.400 restryktaz typu I,
ok. 200 restryktaz typu II i tylko 4 restryktazy typu III.
Restryktazy, rozszczepiając DNA na ograniczoną liczbę fragmentów, mają zastosowanie do określenia pierwszorzędowej struktury DNA. Jednak ich najważniejszym praktycznym zastosowaniem jest inżynieria genetyczna, ponieważ dzięki
działaniu restryktaz DNA traci fragmenty, które potem są wbudowywane do bakteryjnego DNA, stając się częścią bakteryjnego genomu. Dzięki temu bakterie
otrzymują nowe cechy biochemiczne, jak na przykład zdolność syntetyzowania
interferonu, insuliny oraz innych białek, które mają szerokie zastosowanie w medycynie. W zasadzie takie procesy możliwe są również w genomie organizmów
wyższych. Łatwe wbudowanie fragmentów restrykcyjnych DNA do DNA biorcy
(tzn. DNA, które włącza te fragmenty do swojego składu) można wyjaśnić w ten
sposób, że podczas działania restryktaz w punkcie przecięcia cząsteczki DNA biorcy powstają „lepkie” końce, które mogą ulegać połączeniom (ligacji) z włączanym
odcinkiem DNA.
Rybonukleazy I (hydrolazy rybonukleino-3`-pirymidyno-oligonukleotydowe) to
endonukleazy, które przyspieszają reakcję hydrolizy RNA w miejscu reszty nukleotydu zawierającej pirymidynę. Wcześniej traktowano je jako cyklizujące transferazy rybonukleinian-2’-nukleotydowe, ale ponieważ podczas ich działania, jako
produkty przejściowe, powstają 2`,3`-cyklofosforany, których hydroliza do
3`-fosforanów przyspieszana jest przez ten sam enzym, obecnie rybonukleazy
(RNAazy) I zaliczone do klasy hydrolaz.
Przedstawicielami RNAaz I są trzustkowe RNAazy, które zostały wydzielone
z wielu organów. Ustalona została pierwszorzędowa struktura trzustkowej RNAazy
byka, świni, owcy, żyrafy, sarny europejskiej, szynszyla, renifera, daniela, myszy,
szczura, świnki morskiej, wielbłąda jednogarbnego oraz nutrii. We wszystkich
przypadkach, oprócz dwóch ostatnich, enzym zawiera 124 reszty aminokwasów.
Wyjaśniona została trzeciorzędowa struktura niektórych trzustkowych RNAaz.
Trzustkowe RNAazy mogą być monomeryczne (rybonukleaza A) oraz dimeryczne
(rybonukleaza B zawiera resztę węglowodanu posiadającą M = 1.350).
Guanylorybonukleazy (hydrolazy rybonukleinian-3`-guanylo-oligonukleotydowe)
przyspieszają hydrolizę wiązań z udziałem atomu węgla 5` rybozy reszty kwasu gu-
190
Podstawy biochemii
anylowego i międzynukleotydowego fosforanu w cząsteczce RNA, tworząc guanozyno-3`-fosforan i oligonukleotydy z resztą guanozyno-3`-fosforanu jako końcowego
nukleotydu. Została poznana pierwszorzędowa struktura guanylorybonukleazy, wydzielonej z pleśniaka Asperagillus (T1-RNAaza; M = 11.000), która zawiera 104 reszty
aminokwasowe.
Enzymy mają szerokie zastosowanie do cięcia RNA podczas ustalania ich
struktury pierwszorzędowej. Tylko dzięki zastosowaniu T1-RNAazy udało się
otrzymać duże fragmenty tRNAAla. Zbadano ponadto 10 innych endorybonukleaz,
wydzielonych z bakterii, grzybów mikroskopowych, roślin i zwierząt.
Podobnie jak w przypadku DNAaz istnieje duża grupa (więcej niż 10) endorybonukleaz, które katalizują reakcję odszczepienia rybonukleotydów w miejscu
końcowych reszt RNA oraz oligorybonukleotydów, które powstają podczas selektywnej hydrolizy RNA z udziałem endorybonukleaz. W związku z tym, w wyniku
działania różnych nukleaz kwasy nukleinowe podczas rozpadu tworzą złożoną
mieszaninę indywidualnych rybo- i dezoksyrybonukleozydo-3`- i 5`-fosforanów.
Oprócz wymienionych enzymów w destrukcji kwasów nukleinowych biorą
udział jeszcze inne enzymy, które nie są hydrolazami wiązań fosfodiestrowych, np.
fosforylaza polinukleotydowa oraz uracylo-DNA-glikozydaza.
Fosforylaza polinukleotydowa (polinukleotyd: ortofosforan-nukleotydylotransferaza) w odróżnieniu od wszystkich wymienionych wcześniej enzymów,
które biorą udział w hydrolizie kwasów nukleinowych, jest transferazą nukleotydylową, tzn. przenosi reszty nukleotydowe z końca 3’ RNA do nieorganicznego fosforanu z utworzeniem nukleozydodifosforanów (NDP):
Mg 2+
RNA + H3PO4
(n +1) reszt
nukleotydowych
⇒
Fosforylaza
polinukleotydowa
RNA + NDP
n reszt
nukleotydowych
Enzym ten został opisany przez M. Grunberg-Monago i S. Ochoa (1955) i póżniej wydzielony z wielu źródeł. Występuje głównie we frakcjach mikrosomalnej
i rybosomalnej komórki. Szacuje się, że masa cząsteczkowa tego enzymu wynosi
ok. 230.000. Szybkość reakcji fosforolizy zależy od konformacji i składu nukleotydowego RNA: odcinki, zawierające dwa łańcuchy i grupy metylowe, są bardziej
odporne na działanie enzymu. Zakłada się, że in vivo fosforylaza polinukleotydowa katalizuje proces degradacji komórkowych RNA, szczególnie mRNA, do nukleozydodifosforanów, reguluje stężenie fosforanu nieorganicznego
w komórce oraz dostarcza niezbędną ilość NDP dla przekształcenia ich w dezoksyNDP.
Enzym katalizuje in vitro syntezę polirybonukleotydów (stosunek monomerów
w tym polimerze ten sam, co i w roztworze wyjściowym) z wykorzystaniem jako
substancji wyjściowych nukleozydodifosforanów. Dlatego fosforylaza polinukle-
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
191
otydowa jest stosowana do syntezy polirybonukleotydów o różnym składzie, co ma
duże znaczenie dla odszyfrowania kodu genetycznego.
Glukozydaza uracylo-DNA przyspiesza reakcję odszczepienia reszty urydyny
od uszkodzonej cząsteczki DNA, gdzie miała miejsce dezaminacja reszty cytozyny. Na powstałym apirymidynowym odcinku jednego z łańcuchów DNA wiązanie
fosfodiestrowe ulega hydrolizie z wydzieleniem dezoksyrybozy, 3`-fosforan odszczepia się z udziałem egzodezoksyrybonukleazy III, a zamiast nieobecnej reszty
nukleotydowej wbudowana zostaje nowa, w tym przypadku reszta kwasu cytydylowego, za pośrednictwem reakcji z udziałem polimerazy DNA i ligazy DNA.
Glukozydazy DNA są grupą enzymów, które biorą udział w przemianach DNA.
Za ich pośrednictwem usuwane są zmodyfikowane zasady purynowe i pirymidynowe, zatem ta grupa enzymów ma duże znaczenie w reperacji DNA. Ma to miejsce podczas wymiany metylowanych zasad purynowych i pirymidynowych.
Oprócz glukozydazy uracylo-DNA zbadana została glukozydaza 3-metyloadeninoDNA. Dotychczas opisano 8 takich glukozydaz DNA.
Przemiana fosforanów nukleozydów. Fosforany dezoksyrybonukleozydowe i fosforany rybonukleozydowe, które są produktami enzymatycznego rozszczepienia
kwasów nukleinowych, rozpadają się dalej do jeszcze prostszych związków. Pierwszy stopień tego rozpadu polega na odszczepieniu reszty kwasu fosforowego:
OH
OH
N
N
N
H2 N
CH2OH O
H
H
H
HO
O
P
O
N
N
+
H
OH
H 2O
3'-Nukleotydaza
N
N
H2 N
CH2OH O
H
H
H
OH
N
+
H
H3PO4
OH
OH
Guanozyno-3’-fosforan
(nukleotyd)
Guanozyna
(nukleozyd)
Podczas reakcji drugiego stopnia rozpadu ma miejsce przeniesienie reszty rybozy z nukleozydu do kwasu fosforowego. Reakcja ta jest szybsza w obecności rybozylotransferazy specyficznej dla każdego rodzaju nukleozydu. Przykładem tu może
być fosforoliza urydyny:
192
Podstawy biochemii
OH
HO
N
OH
CH2OH O
H
H
H
OH
OH
P
N
O
O
+ HO
H
P
OH
CH2OH O
H
H
H
Fosforlsaza
urydylowa
O
OH
OH
Urydyna
OH
O
N
+
N
O
H
H
OH
Rybozo-1-fosforan
Uracyl
Fosforylaza urydylowa ma masę cząsteczkową 165 kDa, zawiera 6 podjednostek po 27,5 kDa, z których każda składa się z 253 reszt aminokwasów, w tym
7 reszt histydyny; dwie z nich (8-a i 122-a) są składnikami centrum aktywnego
enzymu. Oznacza to, że w wyniku rozpadu fosforanów nukleozydowych w stanie
wolnym wydziela się rybozylo-1-fosforan oraz wszystkie rodzaje zasad purynowych i pirymidynowych, które biorą udział w budowie kwasów nukleinowych.
Podany schemat rozpadu nukleozydów nie jest jedynym możliwym. Możliwe są
i inne sposoby rozpadu nukleozydów. Jeden z nich polega na hydrolizie nukleozydów, np.:
NH2
N
N
N
CH2OH O
H
H
H
OH
NH2
N
OH
Adenozyna
+
H
H2 O
Nukleozydaza
(Hydrolaza N-rybozylopurynowa)
N
N
N
N
H
Adenina
CH2OH O
H
H
+
H
OH
OH
H
OH
Ryboza
Z kolei zarówno węglowodany, jak i zasady azotowe ulegają dalszej przemianie. Ryboza i rybozo-1-fosforan włączają się do reakcji wymiany charakterystycznych dla węglowodanów. Reakcje te będą rozpatrywane później. Zasady purynowe
i pirymidynowe ulegają dalszemu rozpadowi i przekształcają się w bardziej proste
związki zawierające azot.
Rozpad zasad purynowych i pirymidynowych. Pierwszy etap rozpadu zasad purynowych i pirymidynowych polega na dezaminacji tych, które posiadają grupę
aminową. Proces ten realizuje się za pośrednictwem aminohydrolaz, w wyniku
czego adenina przekształca się w hipoksantynę:
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
193
a guanina – w ksantynę:
Cytozyna przekształca się w uracyl:
NH2
N
HO
OH
+
H2O
N
Hydrolaza
cytozynoaminowa
N
HO
Cytozyna
+
N
NH3
Uracyl
Dezaminowanie zachodzi nie tylko na poziomie zasad purynowych i pirymidynowych, ale również na poziomie nukleozydów i nukleotydów, przy czym w tym
drugim przypadku z większą intensywnością, ponieważ odpowiednie hydrolazy
nukleozydo- i nukleotydo-aminowe są bardziej aktywne niż hydrolazy puryno- lub
pirymidyno-aminowe. Na przykład, adenozyna i adenozyno-fosforan szybciej
przekształcają się do inozyny i inozynofosforanu, niż adenina do hipoksantyny:
NH2
OH
N
N
N
N
CH2OH O
H
H
H
OH
N
OH
Adenozyna
N
+ H2O
H
N
Hydrolaza
adenozynoaminowa
N
CH2OH O
H
H
H
OH
OH
Izozyna
+
H
NH3
194
Podstawy biochemii
Podczas dalszego rozpadu dezaminowanych nukleozydów i nukleotydów uwalniają się hipoksantyna, ksantyna lub uracyl.
Dalszy los dezaminowanych zasad purynowych i pirymidynowych jest różny.
Hipoksantyna i ksantyna utleniają się do kwasu moczowego:
O
HN
N
N
O
O
N
H
Hipoksantyna
1
/2 O2
Oksydaza O
ksantynowa
HN
N
N
N
H
H
Ksantyna
HN
1
/2 O2
Oksydaza
O
ksantynowa
NH
N
N
H
H
Kwas moczowy
Reakcja utleniania hipoksantyny do ksantyny, a tej ostatniej – do kwasu moczowego katalizowana jest przez oksydazę ksantynową – hydroksyreduktazę, która
jest enzymem o szerokim zakresie działania, będącym flawoproteiną, zawierającą
jon Mo(II). Enzym ten, otrzymywany z różnych źródeł, posiada masę cząsteczkową od 280 tys. do 360 tys. Da i podczas działania odpowiednich reagentów ulega
dysocjacji, rozkładając się na dwie identyczne podjednostki, z których każda zawiera jedną cząsteczkę FAD, jeden atom Mo i 4 atomy żelaza, związane z labilnymi atomami siarki w klasterze typu Fe2S2. Aktywowane hipoksantyna i ksantyna
redukują molibden, ten z kolei redukuje klaster F2S2 i na koniec flawina redukuje
tlen cząsteczkowy.
U zwierząt, takich jak: małpy człekokształtne, ptaki, płazy, jedwabnik morwowy, oraz u człowieka końcowym produktem rozpadu zasad purynowych jest kwas
moczowy, który jest wydalany z organizmu. Jednak większość zwierząt i roślin
posiada enzymy i całe układy enzymatyczne zdolne przyspieszać reakcje dalszego
rozkładu kwasu moczowego. Od nazwy kwasu moczowego acidum uricum oraz
zgodnie z charakterem ich działania (rozszczepienie – lysis) enzymy te otrzymały
nazwę enzymów urykolizy (urykazy). W jednym przypadku (dla ssaków, owadów)
urykoliza polega na utlenianiu kwasu moczowego do alantoiny, w drugim (ryby
ościste) – proces jest złożony: allantoina przekształca się do kwasu allatoinowego,
ten ostatni (u większości roślin oraz płazów) rozkłada się do kwasu glioksalowego
i mocznika:
O
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
195
W odróżnieniu od hipoksantyny i ksantyny dezaminowane zasady ulegają redukcji. Na przykład uracyl przekształca się do dihydrouracylu; donorem atomów H
w tej reakcji jest NADH. Z kolei dihydrouracyl ulega hydrolizie i przekształca się
do N-karbamoilo-β-alaniny, która dalej ulega hydrolizie do β-alaniny i kwasu karbaminowego. Ostatni lub wykorzystuje się do syntezy mocznika lub rozkłada się
do CO2 i NH3. Wszystkie wymienione reakcje przyspieszane są przez odpowiednie
enzymy (rys. 6.10).
NADH+ + H+ NAD+
HN
O
O
HN
Dehydrogenaza dihydrouracylowa
O
N
N
H
H
Uracyl
Dihydrouracyl
H 2O
COOH
H2 N
COOH
Kwas
karbaminowy
CH2
+
CH2
NH2
β-alanina
NH3
O
OH
Amidohydrolaza
C
H
N
N-karbamoilo-β-alaninowa 2
H2O
O
Dihydropirymidynaza
O
N
H
N-Karbamolilo-β-alanina
CO2
Rys. 6.10. Schemat przekształcenia uracylu (objaśnienia w tekście)
196
Podstawy biochemii
Kwas karbaminowy i β-alanina są końcowymi produktami rozpadu dwóch zasad pirymidynowych – U i C. W przypadku T, który rozkłada się według takiego
samego schematu, zamiast β-alaniny otrzymuje się kwas β-aminoizomasłowy.
To obrazuje jak ogromne, skomplikowane cząsteczki polidezoksyrybonukleotydów i polirybonukleotydów w procesie rozpadu w organizmach zwierząt i roślin
przekształcają się w proste związki – głównie kwas fosforowy, CO2 i NH3. Organizmy znajdujące się na dole drabiny ewolucyjnej posiadają pełny zestaw enzymów
rozkładających kwasy nukleinowe do prostych związków. Wyżej zorganizowane
organizmy nie posiadają szeregu enzymów, biorących udział w przekształceniu
zasad purynowych i pirymidynowych, dlatego końcowymi produktami przemiany
kwasów nukleinowych są u nich bardziej skomplikowane związki: mocznik, kwas
allantoinowy, allantoina i kwas moczowy.
Mechanizm biosyntezy nukleozydofosforanów. Dla zabezpieczenia biosyntezy
kwasów nukleinowych organizm powinien posiadać pełny zestaw dezoksyryboi rybonukleozydotrifosforanów. Dlatego w każdej komórce każdego organizmu
zachodzi proces tworzenia się nowych nukleozydotrifosforanów, nukleozydodifosforanów i nukleozydomonofosforanów.
Z trzech głównych części nukleotydu – zasady azotowej, pentozy i kwasu fosforowego – ten ostatni zawsze jest w komórkach, pentoza powstaje podczas rozpadu
węglowodanów. Z tego wynika, że tylko zasady azotowe muszą powstawać drogą
specyficzną.
Drogi powstawania zasad purynowych i pirymidynowch są różne, ale niektóre
cechy są podobne w mechanizmie ich syntezy. Należą do nich: 1) szerokie zastosowanie gly, asp i gln, jako źródła azotu pierścieni heterocyklicznych; 2) włączenie
do składu pierścieni purynowych i pirymidynowych atomów węgla od CO2
i mrówczanu; 3) zbudowanie zasady purynowej oraz ukończenie syntezy zasady
pirymidynowej z udziałem rybozo-5-fosforanu, w wyniku czego końcowymi produktami biosyntezy są bezpośrednio nukleozydo-5`-fosforany a nie wolne A,G,C
i T; 4) enzymatyczny charakter wszystkich reakcji, które zachodzą w procesie powstawania nukleotydów de novo; 5) synteza prekursorów, z których następnie syntetyzowane są indywidualne nukleozydo-5`-fosforany.
Rozpatrzymy najpierw mechanizm biosyntezy zasad pirymidynowych. Reakcją
wstępną, od której zaczyna się synteza, jest reakcja tworzenia karbamoilofosforanu
z NH3 i CO2 z udziałem ATP:
Karbaminian kinaza
NH3 + CO2 + ATP
⇒
ADP + H2NCOOPO(OH)2
Karbamoilofosforan
Następnie, z udziałem specyficznego enzymu, reszta kwasu karbaminowego
przenoszona jest do grupy aminowej kwasu asparaginowego z utworzeniem kwasu
karbamoilo-asparaginowego. Reakcja ta traktowana jest jako pierwsza specyficzna
reakcja w syntezie nukleotydów pirymidynowych:
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
NH2
COOH
C
O
197
CH2
OH
O
P
O + H2N
CH
Transferaza
COOH
aspartylo-karbamoilowa
COOH
C
CH2
O
OH
Karbamoilofosforan
NH2
Kwas
asparaginowy
NH
CH
+
H3PO4
COOH
Kwas
karbamoiloasparaginowy
Podczas zbliżenia grupy NH2 do grupy COOH w cząsteczce kwasu karbamoiloasparaginowego zachodzi między nimi oddziaływanie, w wyniku którego powstaje
cząsteczka wody. Reakcja ta katalizowana jest przez enzym należący do hydrolaz –
dihydroorotazę, której nazwa pochodzi od kwasu dihydroorotowego. Enzym ten
katalizuje również hydrolizę kwasu dihydroorotowego, co wynika z odwracalności
tej reakcji
HO
H2N
O
C
HN
Dihydroorotaza
COOH
N
O
H2O
O
H2O
H
Kwas
karbamoiloasparaginowy
O
N
COOH
H
Kwas
dihydroorotowy
Kwas dihydroorotowy utlenia się enzymatycznie. Odłączenie dwóch atomów H
zachodzi za pomocą dehydrogenazy, a ich akceptorem może być NAD+ lub
NADP+, albo FAD:
NAD+
O
HN
O
N
H
COOH
NADH + H+
Reduktaza
kwasu
dihydroortowego
O
HN
O
N
COOH
H
Kwas orotowy
Cząsteczka kwasu orotowego posiada już główny strukturalny element jednej
z zasad pirymidynowych, a mianowicie uracylu. Wystarczy przeprowadzić reakcję
dekarboksylacji, żeby z kwasu orotowego otrzymać uracyl. Jednak proces ten zachodzi dopiero wtedy, gdy kwas orotowy połączy się z rybozą, tworząc nukleozyd,
w którym aglikonem jest reszta kwasu orotowego. Nukleozyd o takiej budowie
nosi nazwę orotydyny (analogicznie do cytodyny i urydyny). Ponieważ reakcja
zachodzi pomiędzy kwasem orotowym i 5`-fosforybozylopirofosforanem, w jej
wyniku powstaje orotydyno-5`-fosforan. Reakcję tę katalizuje transglikozydaza.
Równania reakcji, które doprowadzą do syntezy orotydyno-5`-fosforanu, można
przedstawić w następujący sposób:
198
Podstawy biochemii
OH
O
P
OH
OH
CH2
O
O
O
H
OH
P
H
P
O
H
OH
Transferaza
HN
+
O
O
H
O
OH
COOH
N
O
OH
ortydylanofosforybozylowa
H
5-Fosorybozylo-1-pirofosforan
Kwas orotowy
O
HN3
2
OH
O
P
O
CH2
4'
OH
1
N
O
5'
5
6
COOH
3'
HO
OH
HO
+
O
H
H
4
H
1'
2'
H
P
OH
O
P
O
OH
O
Pirofosforan
OH
Orotydyno-5'-fosforan
Ostatni etap w tym procesie polega na dekarboksylacji orotydyno-5`-fosforanu:
O
O
HN
OH
O
P
N
O
O
CH2
O
H
OH
H
H
H
HO
HN
COOH
CO2
OH
Dekarboksylaza
ortydyno-5'-fosforanowa
O
P
N
O
O
CH2
O
H
OH
H
H
OH
H
HO
OH
Urydyno-5'-fosforan
W wyniku powstaje jeden z pirymidynowych nukleotydów – urydyno-5`fosforan. Zajmuje on centralne miejsce w biosyntezie pirymidynowych nukleotydów, ponieważ dalej może być przekształcony w inne pirymidynowe nukleotydy
zgodnie z podanym schematem (rys. 6.11).
Przekształcenia te zostają zrealizowane za pomocą reakcji redukcji, aminowania
oraz metylowania mono-, di- i trifosforowych estrów nukleozydów. Te ostatnie
powstają w wyniku oddziaływania nukleozydomonofosforanów z ATP, której zapasy rekompensowane są ciągle kosztem reakcji utleniającego fosforylowania.
Na przykład:
Kinaza nukleozydomonofosforanowa
UMP + ATP
⇒
UDP + ADP
Kinaza nukleodydo difosforanowa
UDP + ATP
⇒
UTP + ADP
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
199
Rys. 6.11. Drogi przekształcenia nukleotydów pirymidynowych
Redukcja zachodzi z udziałem grupy OH przy atomie węgla C2 rybozy, dzięki
czemu reszta rybozy przechodzi w resztę dezoksyrybozy. Reakcja ta jest charakterystyczna dla nukleozydodifosforanów:
NH2
OH
HO
P
O
N
OH
O
P
NH2
O
OH
N
O
CH2
O
O
H
H
H
H
HO
Cytydyno-5’difosforan
OH
HO
P
Enzym I
O
H2 O
N
OH
O
P
NH2
O
CH2
OH
N
O
O
O
H
H
H
HO
Związek przejściowy
zawierający wiązanie podwójne
między atomami C2’ a C3’ rybozy
HO
P
Enzym II
O
2H
N
OH
O
P
O
N
O
CH2
O
O
H
H
HO
H
H
H
Dezoksycytydyno-5’-difosforan
Donorem atomów H dla redukcji rybozy podczas przekształcenia rybonukleozydodifosforanu do dezoksyrybonukleozydodifosforanu jest białko – tioredoksyna. Składa się ono z 108 reszt aminokwasów i zawiera dwie grupy HS reszt dwóch
cząsteczek cysteiny przy atomach C32 i C35. Grupy te są donorami atomów H i po
ich oderwaniu tworzą mostek disiarczkowy. Utleniona tioredoksyna redukuje się,
otrzymując atomy H z NADH za pośrednictwem reduktazy tioredoksynowej.
Oprócz dostarczania atomów H w reakcji redukcji reszty rybozy tioredoksyna
w stanie zredukowanym jest zdolna łączyć się z dwoma innymi katalitycznie aktywnymi białkami B1 i B2. Te ostatnie w tym momencie stają się aktywne i przyspieszają proces redukcji reszty rybozy.
200
Podstawy biochemii
A więc przekształcenie rybonukleozydodifosforanów do dezoksyrybonukleozydodifosforanów zachodzi wg następnego schematu:
W reakcji aminacji (przejścia UTP do CTP) źródłem grupy NH2 jest NH3
(u ssaków glutamina), przy czym wprowadzenie grupy aminowej zachodzi równolegle z rozpadem ATP. W reakcji metylowania (przejścia dUMP do dTMP) źródłem grupy CH3 jest kwas N5-metylo-tetrahydrofoliowy, a reakcję przeniesienia
grupy CH3 katalizuje syntaza tymidynowa (dimer; każdy łańcuch polipeptydowy
zawiera 316 reszt aminokwasów; struktury: pierwszorzędowa oraz trzeciorzędowa
są ustalone). W wyniku tych reakcji tworzy się pula wolnych pirymidynowych
nukleozydotrifosforanów (UTP, CTP, dCTP, dTTP), niezbędnych do syntezy DNA
i RNA.
Charakterystyczną cechą biosyntezy pirymidynowych nukleotydów jest samoregulacja tego procesu. Ustalono, że końcowe produkty biosyntezy nukleotydów
pirymidynowych (np. CTP i dCTP) są inhibitorami karbamoilotransferazy asparginianowej – enzymu, który przyspiesza reakcję tworzenia pierścienia pirymidynowego. Antagonistą CTP, jako inhibitora tego enzymu, jest ATP, która aktywuje
enzym. Tak więc regulacja biosyntezy nukleotydów pirymidynowych zachodzi tak,
aby utrzymać stały stosunek ilościowy ATP i CTP w komórkach organizmu, tzn.
zgodnie z bilansem energetycznym komórki.
Warto tu zaznaczyć, że jedna z pochodnych nukleotydów pirymidynowych,
a mianowicie 3`-azydo-2`,3`-didezoksytymidyna, hamuje rozwój retrowirusów,
w tym tych wywołujących AIDS i dlatego jest dobrym lekiem przeciwwirusowym:
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
201
O
CH3
HN
N
O
HOH2C
O
Azydotymidyna
H
H
N3
H
H
H
Zaproponowano również stosowanie innych pochodnych nukleotydów do walki
z tą groźną chorobą.
Rozpatrzymy mechanizm biosyntezy zasad purynowych. Tworzenie się pierścienia purynowego zachodzi z udziałem rybozo-5-fosforanu. Dlatego pierwszą
reakcją jest katalizowane przez transferazę glukozylową przeniesienie reszty
5-fosforybozy do grupy aminowej glutaminy. Prawdopodobnie jednocześnie zachodzi hydroliza powstałej 5-fosforybozyloglutaminy, w wyniku czego wydziela
się 5-fosforybozyloamina:
OH
HO
P
OH
OH
O
CH2
O
H
O
O
H
H
P
P
O
OH
CH2
CH2
O
O
CH
NH2
Transferaza
amidofosforybozylowa
CH2
O
H
O
NH2 + HO
H
H
H
OH
OH
OH
OH
O
O
COOH + H2O
Glutamina
OH
OH
P
C
H
5-Fosorybozylo-1-pirofosforan
HO
O
OH + H2N
C
CH2
CH2
CH
COOH +
NH2
Kwas glutaminowy
HO
P
O
O
P
OH
O
Pirofosforan
5-Fosorybozyloamina
W obecności ATP z udziałem specyficznej ligazy (aminosyntetaza)
5-fosforybozyloamina jest acylowana glicyną i powstaje wiązanie peptydowe:
202
Podstawy biochemii
HO
O
H
P
O
CH2
N
O
H
HO
O
H
+
C
H
H
CH2NH2
+ ATP
HO
Syntetaza
fosforybozyloglicynoamidowa
H
OH
Glicyna
OH
5-Fosorybozyloamina
HO
O
P
O
CH2
HO
HN
O
H
H
OH
OH
H
CO
CH2NH2
+ ADP
+ H3PO4
H
Glicynoamidorybozylofosforan
Cząsteczka glicynamidorybozylofosforanu zwiększa się o jeden atom C za pośrednictwem transferazy fosforybozyloglicynoamidformylowej, której koenzym,
kwas tetrahydrofoliowy, włącza grupę CHO do reszty aminowej glicyny w pozycji
5 cząsteczki koenzymu.
Otrzymany w wyniku tej reakcji 5-fosforybozylo-formyloglicynoamid oddziałuje z glutaminą w obecności ATP i odpowiedniej ligazy (zob. dwa pierwsze równania na rys. 6.7). Produktem reakcji jest związek, w którym atom tlenu wiązania
peptydowego zastąpiony został przez grupę iminową. Następnie w wyniku szeregu
przekształceń tego związku powstaje pierścień imidazolowy. Proces ten zachodzi
równolegle z rozpadem ATP i przyspieszony jest przez specyficzny enzym. Bardzo
ważne jest to, że reakcja, w wyniku której powstaje reszta purynowa, jest znacząco
różna od większości pozostałych stadiów procesu.
Następnie w wyniku szeregu enzymatycznych reakcji z udziałem pierścienia
imidazolowego oraz kwasu asparaginowego, CO2 i mrówczanu powstaje pierścień
pirymidynowy. Schemat tego procesu przedstawiony jest na rys. 6.7.
Analiza związków, z których powstaje pierścień purynowy, wykazuje, że są to
bardzo proste związki:
CO2
Kwas
asparaginowy
C
Glicyna
C
N
N
C
C
N
Glutamina
Mrówczan
C
N
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
203
Z podanego schematu wynika, że atom azotu N1 pierścienia purynowego pochodzi z kwasu asparaginowego, atomy N3 i N9 – z glutaminy, a atom N7 – z glicyny. Źródłem atomów węgla pierścienia purynowego są mrówczan (C2 i C8),
glicyna (C4 i C5) oraz CO2 (C6). Równania reakcji chemicznych przedstawione na
rys. 6.12 pokazują szczegóły włączania atomów N i C z wymienionych związków
do pierścienia purynowego, który wchodzi do składu nukleotydu podczas biosyntezy tego ostatniego.
Rys. 6.12. Mechanizm biosyntezy nukleotydów purynowych (objaśnienia w tekście)
204
Podstawy biochemii
Pierścień pirymidynowy nukleotydów pirymidynowych syntezuje się w organizmie z analogicznych związków: NH3, CO2 i kwasu asparaginowego. A więc
związki wyjściowe do biosyntezy zasad purynowych i pirymidynowych w organizmie są łatwo dostępne, zawsze w nim obecne, ponieważ NH3, CO2 i grupa CHO
powstają w procesie rozkładu różnorodnych związków organicznych lub wprowadzane są do organizmu z zewnątrz, a kwasy glutaminowy i asparaginowy oraz ich
amidy syntetyzowane są w dużych ilościach, co czyni je dostępnymi do syntezy
najważniejszych związków w organizmie.
Jak wynika ze schematu (rys. 6.12), nukleotydy purynowe, w wyniku kolejnych
reakcji tworzenia pierścienia purynowego z udziałem rybozo-5-fosforanu, powstają
w postaci inozyno-5`-fosforanu. Ten ostatni może utleniać się do ksantozyno-5`fosforanu. W wyniku aminowania pierwszego powstaje adenozyno-5`-fosforan,
a drugiego – guanozyno-5`-fosforan. Oba te procesy przyspieszane są przez specyficzne enzymy (zob. rys. 6.13).
Rys. 6.13. Powstanie adenozyno-5`-fosforanu i guanozyno-5`-fosforanu (objaśnienia
w tekście)
Z kolei nukleozydomonofosforany purynowe przekształcają się dalej do nukleozydotrifosforanów, przy czym guanozyno-5`-fosforan przekształca się do guanozyno-5`-trifisforanu w wyniku dwóch reakcji wymiany z ATP:
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
205
Kinaza nukleozydomonofosforanowa
⇒
GMP + ATP
GTP + ADP
Kinaza nukleodydo difosforanowa
⇒
GDP + ATP
GTP + ADP
Podczas oddziaływania adenozyno-5`-fosforanu z ATP powstaje kwas adenozynodifosforowy (ADP):
Kinaza adenylanowa
⇒
AMP + ATP
2ADP
Bierze on udział jako substrat w reakcji fosforylacji oksydacyjnej, w wyniku
której ilość ATP w organizmie jest stała, co jest niezbędne do przekształcenia pozostałych nukleozydomono-fosforanów do nukleozydotrifosforanów.
Synteza dezoksyadenozyno-5`-trifosforanu (dATP) i dezoksyguanozyno-5`trifosforanu (dGTP) zachodzi w wyniku reakcji redukcji rybozy z udziałem grupy
OH przy atomie węgla C2. W przypadku dGTP reakcja redukcji zachodzi w sposób
następujący:
Redukcja
GDP
DGDP + ATP
⇒ dGDP
Kinaza
⇒
dezoksyguanylanowa
ADP + dGTP
Mechanizm reakcji redukcji reszty rybozy do reszty dezoksyrybozy w przypadku purynowych rybonukleozydofosforanów jest identyczny z rozpatrzonym wcześniej dla pirymidy-nowych nukleotydów. Sam proces redukcji natomiast stymulowany jest przez dGTP i dTTP, a jako inhibitor tego procesu występuje dATP.
Podobnie jak w przypadku nukleotydów pirymidynowych końcowe produkty
biosyntezy nukleotydów purynowych (IMP, AMP, ADP, ATP, GMP, GDP i GTP)
hamują aktywność transferazy amidofosforybozylowej – enzymu, przyspieszającego pierwszą reakcję w tym procesie, który prowadzi do powstawania pierścienia
purynowego. To oznacza, że zachodzi samoregulacja powstawania nukleotydów
purynowych. Oprócz tego, za pomocą specyficznego udziału ATP i GTP w reakcjach, które przekształcają IMP do, odpowiednio, GMP i AMP, te ostatnie syntetyzowane są w organizmie zawsze w ściśle określonym stosunku:
GTP
Aktywacja
AMP
IMP
Aktywacja
ATP
GMP
206
Podstawy biochemii
Schemat ten obrazuje zasady samoregulacji, która ma miejsce w organizmie
podczas syntezy szeregu substancji w określonej proporcji. Zabezpieczenie ściśle
określonego stosunku nukleozydofosforanów w organizmie ma duże znaczenie,
ponieważ tworzą się z nich kwasy nukleinowe. Podobne regulatorowe procesy
zanotowano również w syntezie nukleotydów pirymidynowych.
Istnieje jeszcze jedna droga syntezy nukleotydów purynowych i pirymidynowych w organizmach – z wolnych zasad purynowych i pirymidynowych oraz
5-fosforybozylo-1-pirofosforanu. Jest to sposób syntezy nukleotydów de novo,
ponieważ wykorzystywane są w nim gotowe pierścienie purynowe i pirymidynowe, które uwolniły się po rozpadzie kwasów nukleinowych. Reakcja ta katalizowana jest przez specyficzny enzym – transferazę fosforybozylową:
OH
O
P
OH
O
CH2
OH
O
O
H
H
OH
OH
H
P
OH
O
P
O
NH2
OH
N
+
O
H
N
OH
P
N
CH2
+
O
H
OH
H
H
HO
P
O
H
OH
OH
N
N
O
N
Adenina
N
O
adenino-fosforybozylowa
H
NH2
5-Fosorybozylo-1-pirofosforan
Transferaza
N
OH
OH
O
P
OH
O
Pirofosforan
Adenozyno-5'-fosforan
Taki przebieg reakcji jest charakterystyczny dla komórek nowotworowych.
6.3. Biosynteza DNA i RNA
Jak wykazano wcześniej, w przyrodzie żywej przebiegają reakcje zabezpieczające syntezę dezoksyrybo- i rybonukleozydo-5`-trifosforanów wszystkich rodzajów: dATP, dGTP, dCTP i dTTP, a również ATP, GTP, CTP i UTP. Charakterystyczne jest to, że tworzenie tych związków regulowane jest tak, żeby powstawały
one niezależnie w ściśle określonej proporcji. W związku z tym, w organizmie
wszystkie zawsze istnieją one jednocześnie w niezbędnym stężeniu. Biosynteza
kwasów nukleinowych przebiega właśnie przy udziale nukleozydotrifosforanów.
Pierwszą charakterystyczną cechą specyficznej biosyntezy kwasów nukleinowych jest to, że synteza ta odbywa się tylko w obecności wszystkich czterech rodzajów dezoksyrybonukleozydotrifosforanów (dATP, dGTP, dCTP i dTTP)
w przypadku syntezy DNA, lub wszystkich czterech rodzajów rybonukleozydotrifosforanów (ATP, GTP, CTP i UTP), w przypadku syntezy RNA. Drugą cechą
charakterystyczną jest to, że biosynteza zachodzi z udziałem enzymów – polimeraz
DNA lub RNA. Trzecią cechą jest niezbędność dla realizacji syntezy startera w po-
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
207
staci gotowego polinukleotydu, który odgrywa rolę matrycy. Ta ostatnia cecha ma
zasadnicze znaczenie, ponieważ dzięki niej zachodzi specyficzna biosynteza kwasów nukleinowych w ściśle określonej kolejności reszt nukleotydowych w cząsteczce.
Ogólny schemat biosyntezy kwasów dezoksyrybonukleinowych przedstawia
następujący schemat:
nATP
+
nGTP
+
nCTP
+
nUTP
AMP
2+
Polimeraza RNA; Mg
(transferaza RNAnukleotydowa)
DNA-starter
GMP
+
CMP
UMP
4nH4P2O7
Pirofosforan
n
Po raz pierwszy zaproponował go A. Cornberg (1958) na podstawie eksperymentu z polimerazą DNA, wydzieloną z pałeczki okrężnicy. W tym samym roku
S. Schpilmann otrzymał również z pałeczki okrężnicy polimerazę RNA. Później
była ona wydzielona z tkanek ssaków i innych zwierząt. Polimeraza RNA in vitro
katalizuje syntezę RNA według analogicznego schematu:
ndATP
+
ndGTP
+
ndCTP
+
ndTTP
dAMP
2+
Polimeraza DNA; Mg
(transferaza DNAnukleotydowa)
DNA-matryca
dGMP
+
dCMP
dTMP
4nH4P2O7
Pirofosforan
n
Reakcje powstawania kwasów nukleinowych. Mechanizm reakcji biosyntezy
kwasów nukleinowych polega na przeniesieniu reszty nukleozydomonofosforanu
pochodnej od nukleozydotrifosforanu do końcowej reszty nukleotydu polinukleotydowego łańcucha, który powiększa się w procesie syntezy. Przeniesienie zachodzi w miejsce atomu H grupy OH ulokowanej przy atomie węgla C3 rybozy lub
dezoksyrybozy. Temu procesowi towarzyszy wydzielenie pirofosforanu. Enzym,
który katalizuje reakcję przeniesienia reszty nukleotydu nazywamy transferazą
nukleotydylową (rys. 6.14).
Wolna grupa OH przy atomie węgla C3 rybozy lub dezoksyrybozy przyłączonej
reszty nukleotydu może reagować z następną resztą nukleotydu i w ten sposób
zachodzi stopniowa biosynteza polinukleotydu poprzez jego wydłużanie z jednego
końca. Energia do tej syntezy czerpana jest z makroergicznego wiązania w grupie
trójfosforowej podczas wydzielenia pirofosforanu.
208
Podstawy biochemii
Rys. 6.14. Mechanizm reakcji syntezy kwasów nukleinowych (objaśnienia w tekście)
Mechanizm kształtowania pierwotnej struktury podczas biosyntezy kwasów nukleinowych. Proces stopniowej syntezy łańcucha polinukleotydowego zachodzi za
pomocą matrycy, wzdłuż której ułożone są w kolejności dezoksyrybo- lub rybonukleozydotrifosforany, które biorą udział w reakcji kondensacji z wydzieleniem
pirofosforanu (rys. 6.15A).
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
209
Rys. 6.15. Schemat matrycowej biosyntezy kwasów nukleinowych (A) oraz podwojenie się cząsteczek DNA (B) podczas ich replikacji (objaśnienia w tekście)
Kolejność ułożenia nukleozydotrifosforanów wzdłuż matrycy polinukleotydowej determinowana jest kolejnością nukleotydów, z których zbudowane cząsteczki
DNA lub RNA pełnią funkcję matrycy. Do określonej purynowej lub pirymidynowej zasady polinukleotydu (matryca) dołącza się komplementarna purynowa lub
pirymidynowa zasada odpowiedniego nukleozydotrifosforanu. W wyniku tego
syntetyzowany na nowo łańcuch polinukleotydowy jest w całości komplementarny
z polinukleotydowym łańcuchem matrycy (rys. 6.15A).
Ponieważ kształtowanie nowego polinukleotydu zachodzi na matrycy polinukleotydowej z utworzeniem wiązań wodorowych pomiędzy komplementarnymi
purynowymi i pirymidynowymi zasadami matrycy i nukleozydotrifosforanów,
więc warunkiem funkcjonowania tego mechanizmu jest istnienie matrycy w postaci jednego łańcucha. Dlatego w przypadku biosyntezy cząsteczek DNA, które posiadają strukturę podwójnej spirali, za zasadniczy proces w biosyntezie należy
uznać rozdzielenie podwójnej spirali polidezoksyrybonukleotydu na pojedyncze
łańcuchy, na których zachodzi montaż komplementarnych z nimi polinukleotydów.
W wyniku tego procesu z jednej cząsteczki DNA powstają dwie cząsteczki DNA
absolutnie identyczne z wyjściową cząsteczką DNA (rys. 6.15B). Skład jakościowy
210
Podstawy biochemii
i zawartość ilościowa nukleotydowych reszt w matrycowym i na nowo syntetyzowanym kwasie nukleinowym są jednakowe (tabela 6.7).
Tabela 6.7. Stosunki molowe zasad azotowych w składzie DNA, syntetyzowanych
w obecności różnych matryc
Pochodzenie
Pałeczka okrężnicy
Tarczyca
Bakteriofag T2
Charakter
próbki
Matryca
Produkt
Matryca
Produkt
Matryca
Produkt
Adenina
1,00
1,04
1,14
1,19
1,31
1,33
Tymina
0,97
1,00
1,05
1,19
1,32
1,29
Guanina Cytozyna
0,98
0,97
0,90
0,81
0,67
0,69
1,05
0,98
0,85
0,83
0,70
0,70
A+T
G+C
0,97
1,02
1,25
1,46
1,92
1,90
A+G
T+C
0,98
1,01
1,05
0,99
0,98
1,01
Daje to podstawę, aby rozpatrywać przedstawiony wyżej mechanizm biosyntezy kwasów nukleinowych jako replikację homologiczną, tzn. nieskończone powtarzanie się procesu podwajania liczby cząsteczek na drodze bezpośredniego kopiowania ich struktury.
Opisany wyżej (zob. rys. 6.15) mechanizm podwajania cząsteczek DNA został
potwierdzony eksperymentalnie w sytuacji, kiedy wyjściowa DNA rodzicielskich
komórek była znakowana trytem lub 15N. W komórkach potomnych po pierwszym
podziale znacznik wykryto we wszystkich cząsteczkach DNA, ale w mniejszych
ilościach, ponieważ zawarty był on tylko w jednym polidezoksyrybonukleotydowym łańcuchu DNA. Taki sposób podwajania cząsteczek DNA nazywamy semikonserwatywnym. Po drugim podziale połowa cząsteczek DNA w utworzonych na
nowo komórkach okazała się wolna od znacznika, ponieważ homologiczna replikacja w procesie drugiego podziału zachodzi tak na znakowanych, jaki na nieznakowanych jednołańcuchowych polidezoksyrybonukleotydach, powstających podczas podziału podwójnych spirali cząsteczek DNA znakowanych tylko w jednym
łańcuchu.
Enzymy biosyntezy DNA. W biosyntezie DNA biorą udział nie tylko polimerazy
DNA, ale również polimeraza RNA, endonukleaza, ligaza DNA. Po raz pierwszy
polimeraza DNA wydzielona została z E. coli przez A. Cornberga i współpracowników (1958). Ponieważ po kilku latach z tej samej bakterii wydzielono jeszcze
dwie polimerazy, ta pierwsza została nazwana polimerazą I.
Komórka pałeczki okrężnicy zawiera ok. 400 cząsteczek – polimerazy DNA I –
białka o masie cząsteczkowej 109.000 Da, zawierającego jeden atom Zn i jeden łańcuch polipeptydowy. Polimeraza DNA I łatwo łączy się z DNA, zawierającym jeden
łańcuch, lub ze strefami rozerwania wiązań fosfodiestrowych w DNA, zawierającym
podwójną spiralę. Zdolna jest katalizować reakcję przeniesienia reszt dezoksyrybonukleotydowych z dezoksyrybonukleozydo-5`-trifosforanów na rosnący 3’-koniec
polidezoksyrybonukleotydu, czyli na 3`-hydroksylwą grupę końcowego nukleozydu
dezoksyrybozy. Oprócz tego posiada ona aktywność endodezoksyrybonukleozydową, w stosunku do DNA posiadającego jeden łańcuch, w kierunku 3`→ 5`, tzn. od
strony końcowego dezoksyrybonukleozydu, a również w kierunku 5`→ 3` od strony
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
211
pierwszego dezoksyrybo-nukleotydu cząsteczki. W pierwszym przypadku zachodzi
odrzucenie od 3`-końca cząsteczki DNA błędnie dołączonych w procesie syntezy
reszt nukleotydowych, w drugim – degradacja matrycy, niezbędnej do syntezy fragmentów Okasaki. Uważa się, że polimeraza DNA I w większym stopniu przyczynia
się do „dojrzewania” DNA ulegającego replikacji, niż bezpośrednio do procesu polimeryzacji, za który odpowiedzialna jest polimeraza DNA III.
Polimeraza DNA II obecna jest w komórce pałeczki okrężnicy w ilości 40 cząsteczek (M = 90.000). Posiada jeden łańcuch polipeptydowy. Polimeraza DNA II źle
łączy się z DNA, zawierającym jeden łańcuch, natomiast świetnie z jednym z łańcuchów DNA, powstałych po rozerwaniu DNA, posiadającym dwa łańcuchy. Aktywność polimerazy DNA II ocenia się jako 10% aktywności polimerazy DNA I.
Sądzi się, że główną funkcją polimerazy DNA II jest wypełnianie uszkodzonych odcinków w cząsteczce DNA, tzn. reperacja DNA. Uważano, że polimeraza
DNA I in vivo pełni tę samą funkcję.
Główną polimerazą E. coli jest polimeraza DNA III. Jest ona złożonym termolabilnym białkiem (M = 300.000), które składa się z podjednostek α (140.000),
β (37.000), γ (52.000), δ (32.000), ε (25.000) i θ (10.000). Reakcja polimeryzacji
zachodzi z udziałem α-, ε-, oraz θ-subjednostek, gdzie główną rolę odgrywa
α-podjednostka; β-, γ- oraz δ-podjednostki są regulatorami i przyspieszają działanie centrum katalitycznego polimerazy DNA III. Komórka E. coli zawiera tylko 20
cząsteczek tego białka. To właśnie polimeraza DNA III odpowiada za proces replikacji DNA. Działa ona w komórce E. coli w kompleksie z czynnikami białkowymi
również biorącymi udział w replikacji DNA, zabezpieczając realizację głównego
stadium biosyntezy DNA – elongację łańcucha dezoksypolirybonukleotydowego.
Polimeraza DNA α po raz pierwszy wykryta została u ssaków (M = 150-200
tys. Da). Enzym ten został wydzielony z grasicy cielęcej i zawiera podjednostki:
katalityczną (M = 118 tys. DA) oraz regulacyjną (M = 54-64 tys. Da). Jest to kwaśne białko (pI 5,5), działanie którego mocno hamują reagenty, blokujące grupy HS.
Jego aktywność polimerazowa jest maksymalna, gdy pH = 7,2 w obecności DNA
zawierającego podwójną spiralę. Polimeraza DNA α chociaż może być wykryta
w cytoplazmie, głównie zlokalizowana jest w jądrze, gdzie zgromadzono ok.
25.000 jej cząsteczek.
Polimeraza DNA β (M = 45 tys. Da) charakteryzuje się odpornością na działanie reagentów blokujących grupy SH, zdolna jest przyspieszać przy pH = 8,4 reakcję replikacji DNA, jest białkiem zasadowym (pI 9,2). Komórka zawiera ok. 8.000
cząsteczek polimerazy DNA β, zlokalizowanych w jądrze i biorących udział w reperacji DNA.
Polimeraza DNA γ to kwaśne białko (pI = 5,8), posiada masę cząsteczkową
M = 180 tys. Da, tetramer, który składa się z identycznych subjednostek; jej aktywność polimeryzacyjna zależy od obecności grup SH. Przy pH = 8,5 przyspiesza
replikację kopolimeru AT, ale mniej aktywnie oddziałuje z naturalnym DNA. Ko-
212
Podstawy biochemii
mórka zawiera ok. 1000 cząsteczek polimerazy DNA γ, zlokalizowanych w mitochondriach, gdzie zachodzi replikacja mitochondrialnych DNA.
Oprócz polimeraz DNA w biosyntezie DNA bierze udział ligaza DNA. Została
ona wykryta w 1967 r. w pięciu laboratoriach jednocześnie. Jest to białko posiadające masę cząsteczkową M = 96000 Da. Komórka E. coli zawiera ok. 2000 cząsteczek ligazy DNA. Jej funkcja polega na katalizie reakcji tworzenia wiązania fosfodiestrowego pomiędzy 3`- i 5`-końcami łańcuchów DNA, zbliżonych na odległość
jednego ogniwa nukleotydowego i zamocowanych na komplementarnym do nich,
ale innym łańcuchu DNA. Taka sytuacja powstaje w wielu przypadkach: podczas
zerwania wiązania w jednym z łańcuchów DNA, spowodowanego napromieniowaniem, działaniem nukleaz itp.; podczas połączenia powstałego na nowo w procesie replikacji fragmentu z poprzednimi lub utworzonymi na nowo fragmentami
DNA; podczas układania cząsteczki DNA w pierścień z utworzeniem wiązania
kowalencyjnego itp. Ligaza DNA stosowana jest podczas syntezy genów i ich
fragmentów.
Białkowe czynniki niezbędne dla biosyntezy DNA. Oprócz wymienionych wyżej
enzymów w biosyntezie DNA biorą udział białkowe czynniki, z których każdy
pełni specyficzną funkcję.
Białko wiążące DNA po raz pierwszy zostało wydzielone przez V. Albertsona
i L. Fraya (1970) z lizatów E. coli, zakażonej fagiem T4. Najpierw nosiło ono nazwę białko-32 zgodnie z numerem genu w chromosomie faga T4 odpowiedzialnego za jego biosyntezę. Białko to ma masę cząsteczkową 35 tys. Da (białko E. coli
wiążące DNA ma M = 22 tys. Da), charakteryzuje się wysokim stopniem asymetrii
(b/a = 4), dominowaniem dikaborksylowych aminokwasów nad diaminokwasami.
Białko to ma jeden łańcuch polipeptydowy i posiada zdolność wiązania z DNA
posiadającym jeden łańcuch lub uszkodzonymi odcinkami DNA posiadającymi
dwie spirale, zdecydowanie osłabiając wzajemne oddziaływanie polidezoksyrybonukleotydowych łańcuchów w cząsteczce, co odbija się na obniżeniu temperatury
topnienia DNA o 30-40o.
Białko wiążące DNA aktywuje polimerazy DNA II i III. W przeciwieństwie do
białka wiążącego DNA istnieje i zostało wydzielone białko, którego biosynteza
u E. coli kodowana jest przez gen numer 5 fagowego chromosomu. Białko to w pełni
blokuje matrycową aktywność DNA, tzn. jest antagonistą białka wiążącego DNA.
Białko rozkręcające DNA zostało opisane przez J. Yanga (1971) i nosi nazwę
białko-ω. Posiada ono aktywność nukleazową, a po połączeniu z DNA rozrywa
wiązanie fosfodiestrowe w jednym z łańcuchów, w wyniku czego następuje wolny
obrót wokół fosfodiestrowego wiązania innego łańcucha oraz rozkręcanie superspirali nici DNA. Jego antagonista – białko zakręcające DNA – powoduje superspiralizację DNA.
Podczas badania biosyntezy DNA E. coli i jej mutantów wykrytych zostało
jeszcze kilka białek, biorących udział w replikacji DNA. Spośród nich szczególnie
interesujący jest enzym, rozplatający podwójną spiralę DNA (helikaza). Jego masa
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
213
cząsteczkowa wynosi 75 tys. Da, a łańcuch polipeptydowy zbudowany jest z 650
reszt aminokwasów zorganizowanych w dwie domeny zawierające 286 i 364 aminokwasy o układzie przestrzennym umożliwiającym rozplatanie helisy DNA kosztem energii ATP.
Etapy biosyntezy DNA. Posiadając dane o enzymach i czynnikach białkowych,
biorących udział w biosyntezie DNA, opracowany został schemat tego procesu.
Jego podstawą jest istnienie replikatywnego kompleksu enzymów i białkowych
faktorów, niezbędnych do biosyntezy DNA (rys. 6.16).
Rys. 6.16. Schemat biosyntezy fagowego DNA (płaszczyznowy model):
Syntezę oligorybonukleotydu, który pełni funkcję startera, pod wpływem polimerazy RNA (prymazy) ułatwia białkowy kompleks nazywany primosomem (n = 25 kDa, n` = 75 kDa, n” = 11 kDa,
i = 80 kDa, dnaB = 300 kDa, dnaC = 29 kDa), który porusza się w kierunku przeciwnym do elongacji i kształtuje nowe centrum primera. Rozkręcanie podwójnej nici DNA na jednołańcuchowe
polidezoksyrybonukleotydy odbywa się z udziałem helikazy (od ang. helix – spirala), natomiast
relaksacja super spiralnej DNA – z udziałem gyrazy (od ang. gyration – ruch obrotowy)
Zgodnie z tym schematem biosynteza DNA zachodzi w trzech etapach: inicjacja, elongacja i terminacja. Należy podkreślić, że wiele kwestii, dotyczących mechanizmu biosyntezy DNA, jest jeszcze nie wyjaśnionych do końca, dlatego model
ten jest do pewnego stopnia umowny.
214
Podstawy biochemii
Inicjacja biosyntezy DNA, rozumiana jako początek biosyntezy potomnych polidezoksyrybonukleotydowych łańcuchów z udziałem łańcuchów macierzystych, sprowadza się do zbudowania na macierzystym łańcuchu DNA oligonukleotydu, pełniącego funkcję startera i posiadającego wolną grupę OH na 3`-końcu. Bez tego nie
działa żadna polimeraza DNA. Ten krótki (posiadający tylko kilkadziesiąt reszt nukleotydowych) oligonukleotyd, który ma na końcu pirymidynowy nukleozyd, jest
primerem, tzn. zaczątkiem przyszłego łańcuchu DNA, i syntetyzowany przy udziale
enzymu typu polimerazy RNA, która ma nazwę primazy (M = 60.000, 100 cząsteczek w komórce E. coli). Po jego powstaniu do syntezy dołącza się polimeraza DNA
III, za pośrednictwem której syntetyzuje się na macierzystej nici DNA potomny łańcuch DNA. Następnie, przyłączony za pomocą wiązania kowalencyjnego do tego
powstałego na nowo łańcucha DNA, fragment RNA jest usuwany za pomocą nukleaz, a powstała jednołańcuchowa luka zabudowywana jest oligodezoksynukleotydowym fragmentem także za pośrednictwem polimerazy DNA (rys. 6.16).
Inicjacja biosyntezy DNA rozumiana w szerokim znaczeniu jako kompleks procesów, które prowadzą do startu biosyntezy DNA, sprowadza się do powstania kompleksu replikacyjnego enzymów i czynników białkowych oraz kształtowaniu widełek
replikacyjnych (rys. 6.16). Inicjacja ta polega na łączeniu do dwuniciowego DNA
białka wiążącego DNA, białka rozplatającego DNA, kompleksu DNA-polimeraza,
uzależnionej od DNA polimerazy RNA (primazy), jak również kompleksu czynników białkowych, który nosi nazwę primosomu oraz zabezpiecza przesuwanie się
widełek replikacyjnych, ich przestrzenną organizację i funkcjonowanie.
Elongacja biosyntezy DNA składa się co najmniej z dwóch procesów: replikacji odcinków macierzystych łańcuchów DNA oraz wzajemnego łączenia syntetyzowanych podczas replikacji fragmentów łańcuchów DNA powstałych na nowo.
Pierwszy proces zachodzi z pomocą reakcji z udziałem polimerazy DNA, przebiegającej z prędkością średnio ok. 1000 reszt nukleotydowych/s u bakterii, 100 –
u zwierząt oraz 10 – u roślin. Jego swoistość polega na tym, że replikacja zachodzi
nie ciągle, lecz fragmentarycznie: jednorazowo u prokariotów syntetyzuje się polidezoksyrybonukleid ze współczynnikiem sedymentacji równym 8-10S, tzn. posiada on masę cząsteczkową równą 105 Da (zawiera 1000 reszt nukleotydowych).
U eukariotów fragmenty te są krótsze, ok. 200 reszt nukleotydowych, co jest porównywalne z długością nukleosomowego DNA, Okasaki. Otrzymały one nazwę
fragmentów Okasaki od nazwiska japońskiego biochemika, który po raz pierwszy
w 1967 r. zaobserwował ich obecność podczas biosyntezy DNA. Schemat ten wyjaśnił mechanizm budowy polinukleotydowego łańcucha.
Co do terminacji biosyntezy DNA – nie ma jeszcze uznanego jednego mechanizmu tego etapu syntezy. Sądzi się, że zaprzestanie replikacji DNA jest zaprogramowane kolejnością nukleotydów, w tym w postaci specjalnych palindromów na
końcu chromosomu. Przyjmuje się, że replikacja kończy się, kiedy spotykają się
widełki replikacyjne podczas podwojenia tak końcowych, jak i liniowych DNA.
W efekcie, możliwe jest uzupełnienie prowadzonego łańcuchu kosztem 3`-końca
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
215
macierzystego łańcucha z udziałem specyficznego białka, zlokalizowanego na jego
końcu.
Dokładność replikacji DNA jest bardzo wysoka: jeden błąd na 1010 nukleotydotransferazowych reakcji. Ale nawet w przypadku błędu, może być on naprawiony
w toku procesów reperacji.
Biosynteza DNA na matrycowych RNA. Oprócz mechanizmu biosyntezy DNA na
polidezoksyrybonukleotydowej matrycy, który został opisany wyżej, ostatnio zaprezentowany został system biosyntezy DNA na RNA za pośrednictwem enzymu,
noszącego nazwę odwrotnej transkryptazy lub rewertazy (a również polimerazy
DNA zależnej od RNA). Enzym ten został wykryty w 1970 r. u wirusa Rauschera,
powodującego białaczkę u myszy, oraz wirusa sarkomy Rausa. Rewertaza aktywowana jest bardziej przez Mn2+ niż Mg2+ i zawiera jon Zn2+. Syntetyzowany DNA
posiada niewielką masę cząsteczkową i charakteryzowany jest stałymi sedymentacji od 2S do 7S. Jak każda zwykła polimeraza DNA rewertaza jest zależna od
DNA, dlatego potrzebuje primera, rolę którego może odgrywać tRNA, pełniący
funkcję regulatora podczas przemiany materii. Jej masa cząsteczkowa waha się od
70 do 180 kDa w zależności od obiektu, z którego została wydzielona; enzym ten
z reguły zawiera 2 podjednostki.
Znaczenie odkrycia rewertazy polega przede wszystkim na tym, że ujawniony
został mechanizm biosyntezy DNA, który może być wykorzystany do amplifikacji
genów. Badania rewertazy są bardzo ważne dla wyjaśnienia mechanizmu przeobrażenia normalnej komórki w nowotworową. Rewertaza ma zastosowanie w biologii molekularnej do syntezy genów i fragmentów genów, tzn. w inżynierii genetycznej. Nową dziedziną, w której można ją wykorzystać jest odszyfrowanie za
pomocą kDNA pierwotnej struktury RNA i białek.
Biosynteza RNA zachodzi na nici DNA jako matrycy. Z punktu widzenia przekazywania informacji w układach żywych synteza ta może być scharakteryzowana
jako proces transkrypcji, tzn. przepisywania informacji zawartej w sekwencji reszt
nukleotydowych w matrycy DNA na sekwencję nukleotydów w cząsteczce RNA
utworzonej de novo. Ta część DNA, która została skopiowana w procesie biosyntezy RNA, ma nazwę transkryptu. Zawiera on sekwencje informacyjną i nieinformacyjną. Transkrypcja strefy informacyjnej prowadzi do utworzenia tej części
RNA tworzonej na nowo, która późnej pozwala na utworzenie RNA posiadającego
określoną aktywność funkcjonalną. Podczas kopiowania sekwencji nieinformacyjnej syntetyzowana jest ta część RNA, która następnie w procesie dojrzewania syntetyzowanej de novo cząsteczki RNA zostanie zdegradowana. Stosunek informacyjnej i nieinformacyjnej części w transkryptach prokariotów i eukariotów jest
bardzo różny i stanowi odpowiednio 9:1 i 1:9.
Nieinformacyjna sekwencja transkryptu zawiera obszary regulacyjne, z którymi
oddziałują liczne (wykryto ich kilkadziesiąt) regulacyjne czynniki białkowe, przyspieszające lub hamujące proces transkrypcji. Kontaktują się one z określonymi
resztami nukleotydów w DNA za pomocą specyficznych domen wiążących DNA.
216
Podstawy biochemii
Biosynteza RNA zachodzi za pośrednictwem polimeraz RNA, które są enzymami zależnymi od DNA i tylko w niektórych przypadkach od RNA. Mechanizm
ich działania jest bardzo podobny do polimeraz DNA: przyspieszają biosyntezę
RNA z ATP, GTP, CTP i UTP. Składanie unikalnej sekwencji RNA, tworzonej de
novo, zachodzi na drodze parowania odpowiedniego rybonukleozydofosforanu
z komplementarną do niego resztą nukleotydową matrycowego polinukleotydu
w punkcie wydłużania cząsteczki RNA. Ale są istotne różnice: polimerazy RNA
nie potrzebują primera, ale oddziaływają selektywnie z promotorem DNA (punkt,
z którego zaczyna się biosynteza RNA), są skomplikowanymi cząsteczkami, zbudowanymi z kilku podjednostek.
Najdokładniej zbadano polimerazy RNA prokariota, szczególnie E. coli. Polimeraza RNA jest białkiem o masie cząsteczkowej M = 487 tys. Da, składa się
z pięciu podjednostek: dwóch α, jednej β, jednej β` i jednej σ.
Na ogół masy cząsteczkowe polimeraz RNA polikariota (zbadano ich kilkadziesiąt) wahają się w dość szerokim zakresie mas (α: 36-45 kDa, β: 86-160 kDa,
β`: 96-175 kDa oraz σ-faktor: 44-107 kDa). Polimerazy RNA prokariota biorą
udział w syntezie wszystkich rodzajów RNA – rybosomowych, informacyjnych,
transportowych i niskocząsteczkowych. W odróżnieniu od nich eukariotyczne polimerazy RNA typu I (M = 473kDa, 6 podjednostek) biorą udział w transkrypcji
genów rRNA; typu II (M = 882 kDa, 10 ± 2 podjednostki) – genów kodujących
białka; typu III – genów małych, stabilnych RNA (tRNA, 5S rRNA) (M ~
6353 kDa, 9 podjednostek). Każda z podjednostek polimeraz RNA pełni określoną
funkcję: jedne odczytują kolejność nukleotydów w strefie promotora, inne kontrolują przebieg reakcji nukleotydylo-tranferazowej reakcji podczas wydłużania łańcucha RNA, a trzecie – oddziałują z licznymi transkrypcyjnymi czynnikami białkowymi, regulującymi biosyntezę odpowiednich RNA na drodze kontaktu z sekwencjami DNA, które wzmacniają lub osłabiają biosyntezę, lub na drodze aktywowania kinaz proteinowych, fosforylujących białkowy kod polimeraz RNA, podobnie jak białka regulacyjne. Zakończenie syntezy cząsteczki RNA sygnalizuje
swoisty odcinek nici sensownej cząsteczki RNA. Sygnał ten rozpoznaje białko
kończące – czynnik ρ (M = 46.094 Da), sekwencja którego została opisana, i który
istnieje w postaci heksameru w ilości 1000 cząsteczek w komórce. Czynnik ten,
dołączając do centrum transkrypcyjnego, rozdziela kompleks DNA-RNA i uwalnia
RNA. Dla polimerazy RNA I, która prowadzi transkrypcję rRNA, sygnałem jej
ukończenia jest dołączenie czynnika białkowego (M = 130 kDa) do terminatora
w składzie kopiowanego genu rDNA ssaków.
Polimeraza RNA przeważnie wiąże się z łańcuchem DNA i posiada zdolność
rozplatania bispiralnej struktury DNA na ograniczonej długości. Przemieszczanie
się polimerazy RNA wzdłuż łańcucha RNA zachodzi poprzez dołączenie się
w procesie syntezy RNA nukleotydu. Biosynteza RNA regulowana jest za pośrednictwem mechanizmu, przedstawionego na rys. 6.17.
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
217
Rys. 6.17. Regulacja biosyntezy RNA:
Biosynteza RNA zaczyna się od promotora i jest rozpoznawana przez czynnik σ; pomiędzy promotorem a sekwencją reszt nukleotydowych (cistron) w DNA ułożony jest obszar operatora. Jeżeli
jest on wolny, tzn. nie jest zajęty przez represor, reakcja z udziałem polimerazy RNA przebiega bez
przeszkód. Na początku następuje transkrypcja sekwencji operatora, potem cistronu, zawierającego informację o kolejności reszt aminokwasów w jednym lub związanych metabolicznie białkach. Jeżeli promotor jest zablokowany przez represor, synteza RNA nie zachodzi; strefa wiązania
aktywatora może być znajdować się blisko, ale również daleko od promotora.
Syntetyzowane RNA są prekursorami RNA funkcjonalnie aktywnych kwasów
rybonukleinowych, ponieważ oprócz odcinków informacyjnych zawierają także
odcinki nieinformacyjne. Po raz pierwszy zjawisko to zostało opisane w 1964 r.,
a gigantyczne transkrypty nazwane zostały dRNA (tzn. RNA podobne do DNA).
Później zachodzi proces ich modyfikacji, któremu towarzyszy usuwanie stref nieinformacyjnych. Nosi on nazwę processingu lub dojrzewania RNA. W czasie jego
trwania cząsteczki RNA zostają wzbogacone w zasady azotowe (szczególnie
w przypadku tRNA); w przypadku mRNA dołącza się do niej CAP (białko aktywujące katabolizm) oraz fragment poliadenylanowy. Processing zachodzi z udziałem
różnorodnych enzymów, m.in. metylaz RNA w przypadku metylacji tRNA. Właśnie podczas badania processingu pierwotnych transkryptów RNA wykryto zadziwiające zjawisko: zdolność niektórych niskocząsteczkowych RNA do autokatalizy.
Najwyraźniej zjawisko to można zaobserwować podczas badania rybonukleazy
P – enzymu, który przyspiesza processing 5`-końców prekursorów tRNA: będąc
oddzielony od części białkowej RNA okazał się zdolny sam katalizować reakcję
hydrolizy wiązania fosfodiestrowego z udziałem reszty guanidyny podczas przejścia prekursora w dojrzały tRNA (rys. 6.18). Otrzymał on nazwę rybozym. Mechanizm katalizy polega na powstawaniu rybozylo-substratowego kompleksu oraz
podporządkowanie procesu prawom kinetyki enzymatycznej.
218
Podstawy biochemii
Prekursorowa tRNA
Dojrzala tRNA
Rys. 6.18. Processing prekursora RNA z udziałem rybozymu (objaśnienia w tekście)
Próby zastępowania rybonukleotydów w składzie rybozymów dezoksyrybonukleotydami, doprowadziły do powstawania chimerycznych rybozymów (nukleozymów), które posiadają wyższą stabilność i aktywność. Syntetyzowano również rybozymy oraz nukleozymy z mniejszą liczbą nukleotydowych ogniw w ich składzie
(minizymy). Pozwoliło to na stworzenie teorii, zgodnie z którą właśnie kwasy rybonukleinowe odgrywały główną rolę w chemicznych procesach związanych
z powstawaniem życia na Ziemi. Dopiero później dołączyły się do nich DNA i białka, co dało początek bardziej progresywnego systemu zachowania oraz przekazywania informacji podczas powstawania na nowo biopolimerów, które przekazują z pokolenia na pokolenie cechy strukturalne i funkcje biologiczne makrocząsteczek.
Następnie stwierdzono, że analogiczną zdolność posiada wiele małych jądrowych RNA, które istnieją w postaci kompleksów z białkami. Wszystkie zawierają
dużą ilość reszt kwasu urydylowego i dlatego otrzymały symbol U1, U2 itp. RNA.
Zbadano ponad dziesięć tego typu RNA, większość z nich bierze udział w katalitycznym przyspieszeniu dojrzewania mRNA i rRNA, zabezpieczając usunięcie
nieinformacyjnych fragmentów z ich prekursorów oraz łączenie (splicing) biologicznie ważnych fragmentów z utworzeniem dojrzałych cząsteczek. Jak widać
także one prowadzą alternatywne łączenie (alternative splicing) prekursorów
mRNA (pre-mRNA), podczas którego z jednej cząsteczki pre-mRNA powstaje
kilka funkcjonalnie odrębnych mRNA. Jądrowe kompleksy niskocząsteczkowych
jądrowych RNA z białkowymi faktorami, które są niezbędne do ich łączenia
i funkcjonowania, otrzymały nazwę spliceosom. To właśnie one realizują specyficzny splicing podczas dojrzewania pre-mRNA do pre-rRNA. Obecnie podczas
oceny funkcji małych jądrowych RNA przede wszystkim widać ich główną rolę
w regulacji przemiany materii w komórce: wykryty został nowy rodzaj tych RNA,
których cząsteczki są komplementarne do krótkich powtórzeń w DNA, w wyniku
czego mogą one kontrolować replikację DNA oraz transkrypcję jako transregulacyjne elementy.
Rozdział 6. Kwasy nukleinowe i ich przemiana
219
Dokonano obliczeń szybkości reakcji syntezy RNA. W przypadku biosyntezy
mRNA albuminy w komórkach wątroby szczura jej szybkość równa się 90-100
reszt nukleotydowych na sekundę. Wychodząc z założenia, że komórka wątrobowa
zawiera ok. 40 tys. cząsteczek tego typu mRNA, a czas jej życia wynosi 3 godziny,
wówczas – jeżeli proces zachodzi z taką szybkością – wystarczą 3-4 aktywne geny,
żeby w pełni zabezpieczyć potrzebną ilość tego białka.
Badania prawidłowości biosyntezy kwasów nukleinowych doprowadziły do
wykrycia mechanizmu odtworzenia specyficzności podczas ich tworzenia de novo.
Mechanizm ten sprowadza się do wzajemnego oddziaływania komplementarnych
zasad polinukleotydowej matrycy (na której zachodzi synteza) i nukleozydotrifosforanów jako substancji wyjściowych w tej syntezie. Zasada komplementarności
okazała się więc istotna nie tylko w budowie cząsteczek kwasów nukleinowych,
ale również w ich biosyntezie. Ma ona ogromne znaczenie dla specyficznego odtworzenia pierwszorzędowej struktury cząsteczek białka. Wzajemne oddziaływanie
komplementarnych struktur, które zabezpiecza odtworzenie specyficznej budowy
makrocząsteczek, jest elementarną, podstawową właściwością materii żywej. Zasada matrycowa biosyntezy – to specyfika chemii materii żywej. Należy zauważyć,
że molekularna biologia i biochemia doprowadziły do najważniejszego uogólnienia, które charakteryzuje specyfikę żywego organizmu, różnicę między żywą i nieożywioną materią na poziomie molekularnym.