Monoclonal Mouse Anti-Human CD45, Leucocyte Common

Monoclonal Mouse
Anti-Human
CD45, Leucocyte Common Antigen/PerCP,
Clone 2D1
Nr kat. PR701
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
PR701 przeznaczony jest do stosowania w cytometrii przepływowej. Przeciwciało słuŜy do identyfikacji komórek, w
których dochodzi do ekspresji CD45. CD45 jest jedną z najobficiej występujących glikoprotein powierzchniowych
błony komórkowej leukocytów, a jego ekspresja zachodzi wyłącznie w komórkach układu krwiotwórczego i
potomnych (1). W cytometrii przepływowej, anty-CD45, wraz z panelem przeciwciał, uwaŜany jest za kluczowy do
wstępnego rozpoznania przewlekłych zaburzeń proliferacji limfocytów i ostrych białaczek (2).
Interpretacji wyniku z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz wyników innych metod diagnostycznych
powinien dokonać wykwalifikowany patolog.
Streszczenie i
informacje ogólne
CD45 jest jednołańcuchowym białkiem przezbłonowym typu I, produkowanym zazwyczaj w duŜych ilościach w
jądrzastych komórkach pochodzących z układu krwiotwórczego (3). Tak więc CD45 obecny jest w limfocytach T
i B, granulocytach, monocytach i makrofagach, z wyjątkiem dojrzewających erytrocytów i megakariocytów (1).
Opierając się na składaniu róŜnicowym egzonów 4, 5 i 6 zidentyfikowano pięć róŜnych izoform CD45,
nazwanych ABC, AB, BC, B i 0. Masa cząsteczkowa izoform wynosi od 220 000 dla izoformy ABC do 180 000
dla izoformy D. Wszystkie izoformy CD45 zawierają identyczny segment wewnątrzkomórkowy, w którym
wykazano aktywność fosfatazy tyrozynowej, odgrywający istotną rolę w aktywacji i róŜnicowaniu limfocytów (3).
Przeciwciała rozpoznające wszystkie pięć izoform nazywane są anty-CD45 (3).
Odczynnik dostarczony
Koniugaty Anti-CD45, PR701, wyprodukowane zostały z oczyszczonych mysich przeciwciał monoklonalnych.
Koniugat dostarczany jest w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz
15 mmol/L NaN3, pH 7,2. KaŜda fiolka zawiera koniugat na 100 testów (10 µL koniugatu dla leukocytów, w ilości
do 106, z prawidłowej ludzkiej krwi obwodowej).
Izotyp: IgG1, kappa. StęŜenie koniugatów (mg/L): Patrz: informacja podana na etykiecie fiolki.
Nr kat.
przeciwciała
Fluorochrom
Nr kat. odczynnika
kontrolnego
PR701
Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP)
X7909
Immunogen
Jednojądrzaste komórki ludzkiej krwi obwodowej izolowane metodą Ficoll-Triosil (4, 5).
Swoistość
Przeciwciała anty-CD45, 2D1, opisano podczas warsztatów Third International Workshop and Conference on
Human Leucocyte Differentiation Antigens (3. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów
róŜnicujących leukocyty ludzkie), a ich reaktywność z CD45 została potwierdzona przez wiele laboratoriów (6, 7).
Środki ostroŜności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych uŜytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3) w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł‚ biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
Przechowywać w ciemności w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na
opakowaniu. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi
zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego
jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W
wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach
laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z naszym działem
wsparcia technicznego.
Procedura barwienia
1.
(119208-001)
Dako Denmark A/S
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej o
wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 10 µL PR701 i ostroŜnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
3.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub w tempe raturze pokojowej
(20–25 °C) przez 15–30 minut.
4.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym
pomieszczeniu.
5.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym
pomieszczeniu.
PR701/PL/LHP/2008.09.17 str. 1/2
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
6.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
7.
Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS i odtworzyć zawiesinę komórek za pomocą mieszadła
wibracyjnego.
8.
Powtórzyć etap 6.
9.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
10.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności i
temperaturze 2–8 °C. Próbki powinny zosta ć poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
NaleŜy pamiętać, Ŝe koniugaty fluorochromowe są wraŜliwe na światło, w związku z czym w trakcie
wykonywania odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury Etap 1: Opcjonalnie do kaŜdego pomiaru moŜna dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne w
celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą
się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone
indywidualnie w kaŜdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do izotypu i fluorochromu sprzęŜonego przeciwciała. Zalecany odczynnik kontrolny przedstawiono
w tabeli powyŜej.
Etapy 4 i 5: Jeśli uŜywany jest inny odczynnik do lizy komórek, naleŜy przy jego doborze kierować się
poniŜszymi zaleceniami. NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza, np.
Dako EasyLyse™, nr kat. S2364), PBS w etapie 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba Ŝe próbka
zostanie przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 10: W przypadku niektórych chorób moŜna oczekiwać nieprawidłowej liczby komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. MoŜe to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca
ekspresji antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niŜ jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej.
Piśmiennictwo
1.
Leong AS-Y, Cooper K, Leong FJW-M. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. London:
Oxford University Press; 1999. p. 95-8.
2.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate
hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.
3.
Sewell WA, Cooley MA, Hegen M. NL6. CD45 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von
dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell
differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14;
Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 499-502.
4.
Beverley PCL. Production and use of monoclonal antibodies in transplantation immunology. In: Touraine
JL, Trager J, Betuel H, editors. Transplantation and clinical immunology XI. Excerpta Medica Amsterdam.
1980. p. 87-94.
5.
Bradstock KF, Janossy G, Pizzolo G, Hoffbrand AV, McMichael A, Pilch JR, et al. Subpopulations of
normal and leukemic human thymocytes: an analysis with the use of monoclonal antibodies. J Natl
Cancer Inst 1980;65:33-42.
6.
Cobbold S, Hale G, Waldmann H. Non-lineage, LFA-1 family, and leucocyte common antigens: new and
previously defined clusters. In: McMichael AJ, Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch
FM, et al., editors. Leucocyte typing III. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd
International Workshop and Conference; 1986 Sept 21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo:
Oxford University Press; 1987. p. 788-803.
7.
Sewell WA, Cooley MA, Katz KS. CD Guide. CD45. In Mason D, André P, Bensussan A, Buckley C, Civin
C, Clark E, et al., editors. Leucocyte typing VII. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 7th
International Workshop and Conference; 2000 Jun 19-23; Harrogate, United Kingdom. New York: Oxford
University Press Inc.; 2002. p. 793-4.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
Chronić przed słońcem (patrz
sekcja nt. przechowywania)
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
(119208-001)
Dako Denmark A/S
PR701/PL/LHP/2008.09.17 str. 2/2
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17