Badanie oporności osmotycznej krwinek czerwonych

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
Diagn Lab 2015; 51(3): 229-234
Praca poglądowa • Review Article
Badanie oporności osmotycznej krwinek czerwonych
– przegląd metod diagnostycznych
Osmotic fragility of red blood cells – a review of diagnostic methods
Agata Zgodzińska1, Olga Ciepiela2
Studenckie Koło Naukowe przy Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego,
Warszawski Uniwersytet Medyczny
2
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Warszawski Uniwersytet Medyczny
1
Streszczenie
Oporność osmotyczna jest badaniem powszechnie uważanym za czuły wskaźnik wrażliwości komórek krwinek czerwonych na działanie
środowiska hipotonicznego. Tradycyjny test oporności osmotycznej (Test Dacie’go i Lewisa) ze względu na pracochłonność, długi czas
analizy próbki (minimum 30 minut) oraz dość dużą minimalną objętość materiału wymaganego do prawidłowego wykonania testu nie
należy do najchętniej wykorzystywanych testów w praktyce laboratoryjnej. Celem tego artykułu jest ponowne zwrócenie uwagi na wartość diagnostyczną testu oporności osmotycznej erytrocytów oraz zaprezentowanie najnowszych metod stanowiących udoskonalenie
techniki tradycyjnej, od testu hemolizy w zakwaszonym glicerolu (AGLT50), poprzez Pink Test, do ocenę oporności z zastosowaniem
cytometrii przepływowej. Być może nowe, świeże spojrzenie na to zagadnienie przyczyni się w przyszłości do powrotu testu oporności
osmotycznej do rutynowej diagnostyki przesiewowej zaburzeń czerwonokrwinkowych u dzieci i dorosłych.
Summary
Osmotic Fragility Test (OFT) is widely considered as a sensitive indicator of red blood cells sensitivity to the hypotonic solution. Traditional
osmotic fragility test (Dacie and Lewis) is time and work-consuming, and need relatively large minimum volume of peripheral blood
for proper test performance. It does not belong to the most popular tests in a daily laboratory practice. The purpose of this article is
to underline the diagnostic value of the Osmotic Fragility Test as well as present the latest methods that improves the traditional technique, such as Acidified Glycerol Lysis Test (AGLT 50), Pink Test, or Flow Cytometric Osmotic Fragility Test (FCM OF Test). Perhaps a new,
fresh view at the issue in the nearest future will contribute to reconsider the osmotic fragility test for routine diagnostic screening of
red blood cell disorders in children and adults.
Słowa kluczowe: cytometria przepływowa, oporność osmotyczna, Pink Test, sferocytoza wrodzona, test hemolizy krwinek czerwonych
w zakwaszonym glicerolu (AGLT 50)
Key words:
Acidified Glycerol Lysis Test (AGLT 50), Flow Cytometric Osmotic Fragility Test, hereditary spherocytosis, osmotic
fragility, Pink Test
Wstęp
Oporność osmotyczna erytrocytów (ang. osmotic fragility) jest
powszechnie uznawana za czuły wskaźnik wrażliwości krwinek
czerwonych na działanie roztworów hipotonicznych. Na oporność
osmotyczną erytrocytów ma wpływ wiele czynników: skład i integralność błony komórkowej, stosunek powierzchni do objętości
komórki, czynniki zewnętrzne takie jak mechaniczna hemoliza
[1, 2], temperatura [1, 3] ultradźwięki [1], leki [1, 2] lub czas ich
przechowywania po pobraniu od pacjenta [4].
Po umieszczeniu prawidłowej krwinki czerwonej w środowisku izotonicznym (ok. 0,3 M NaCl), obserwuje się niewielki ruch
osmotyczny wody przez jej błonę komórkową, a zatem jej kształt
i objętość pozostają bez zmian. Umieszczenie tej samej komórki
w środowisku hipotonicznym przyczynia się do napływu wody
do wnętrza komórki, a tym samym wzrostu jej objętości i utraty charakterystycznego kształtu dwuwklęsłego dysku. Zarówno
kształt komórki jak i budowa błony komórkowej pozwalają na
maksymalne zwiększenie objętości o 70%. Dalszy jej wzrost skutkuje utratą integralności ich błony komórkowej na drodze lizy
osmotycznej [5, 6].
Test oporności osmotycznej (Metoda Daciego i Lewisa)
Podstawą testu oporności osmotycznej (ang. osmotic fragility test)
jest ocena wrażliwości krwinek czerwonych na lizę następującą
229
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
w wyniku zmian stężenia NaCl w środowisku. W swej tradycyjnej
postaci (Test Dacie’go i Lewisa) opiera się na ocenie oporności
krwinek czerwonych w hipotonicznych roztworach NaCl (norma:
początek hemolizy 0,45%, natomiast koniec 0,35%) [7]. W tym celu
należy przygotować serię roztworów NaCl o stężeniach od 0,1%
do 0,9%, następnie dodać niewielką objętość krwinek czerwonych
(krew obwodowa pobrana do probówek zawierających wersenian
potasu – K3-EDTA) oraz wykonać spektrofotometryczny pomiar absorbancji zawiesiny. Oporność osmotyczna erytrocytów określana
jest poprzez pomiar hemoglobiny uwolnionej z erytrocytów, które
w wyniku umieszczenia w środowisku hipotonicznym ulegają
lizie osmotycznej. Długość fali świetlnej, przy której wykonywany
jest pomiar intensywności światła przechodzącego przez roztwór
wynosi 540 nm. Oporność osmotyczna oceniana jest na podstawie
przesunięcia krzywej hemolizy, na wykresie zależności absorbancji
od stężenia NaCl, często określane jako stężenie NaCl wywołujące
50% hemolizę [1, 6, 8].
Test oporności osmotycznej (Osmotic Fragility Test, OFT) stosuje
się głównie w diagnostyce chorób związanych z zaburzeniami
budowy i/lub składu błony komórkowej erytrocytów. Wykorzystywany jest przede wszystkim w diagnostyce sferocytozy wrodzonej
(ang. hereditary spherocytosis, HS), która jest najpowszechniej
występującą wrodzoną niedokrwistością hemolityczną w populacji północno-europejskiej oraz Ameryki Północnej. Schorzenie
to występuje z częstotliwością 1 na 5000 żywych urodzeń, jednakże biorąc pod uwagę badania prowadzone nad opornością osmotyczną u dawców krwi, które sugerują obecność form łagodnych
oraz subklinicznych schorzenia, częstotliwość ta może być wyższa
i wynosić nawet do 1 do 2000 [9, 10, 11, 12]. Sferocytoza wrodzona
jest chorobą genetyczną i w około 80% przekazywana rodzinnie.
W typowej postaci dziedziczona jest w sposób autosomalny dominujący, choć w sporadycznych przypadkach pojawiają się inne
typy przekazywania wadliwego genu (autosomalnie recesywnie
lub jako wynik mutacji powstałych de novo) [9, 13]. Rozpoznanie
choroby zazwyczaj następuje w wieku niemowlęcym lub wczesnodziecięcym, choć pojawienie się jej w późniejszych latach nie
jest wykluczone [9].
Sferocyty powstałe w wyniku zaburzenia składu białek cytoszkieletu wykazują się zwiększoną wrażliwością na hemolizę w warunkach hipotonicznych. Ich kulisty kształt powoduje, że mają
zmniejszoną rezerwę powierzchniową (stosunek powierzchni
do objętości krwinki) i nie mają możliwości powiększenia swojej
objętości, stąd ulegają szybkiemu rozpadowi pod wpływem hipotonicznych roztworów. Wykorzystanie tej prostej zależności jest
podstawą odróżnienia komórek o prawidłowej budowie cytoszkieletu od komórek patologicznych [11]. Badanie oporności osmotycznej erytrocytów metodą Dacie’go, jest metodą powszechnie
uznawaną za złoty standard w diagnostyce sferocytozy wrodzonej
u pacjentów z Coombs’-ujemną anemią hemolityczną [7, 14]. Należy jednak pamiętać, iż zmniejszona oporność osmotyczna nie
jest wynikiem swoistym dla HS, a badanie oporności jest jedynie
testem przesiewowym, wymagającym, przy wyniku dodatnim,
dodatkowej diagnostyki. Sferocyty mogą się bowiem pojawiać
w przebiegu innych niedokrwistości np. anemii autoimmunohemolitycznej lub niedokrwistości spowodowanej konfliktem
230
serologicznym w układzie AB0, czy niekiedy w przewlekłej niewydolności nerek [9, 10, 11].
Niektóre schorzenia i stany metaboliczne charakteryzuje obniżona
oporność osmotyczna (głównie sferocytozę wrodzoną [5, 6, 7, 9],
niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej [1] oraz hipernatremię), inne zaś – podwyższona (choroby przewlekłe wątroby,
niedobory żelaza, hiponatremię, talasemię– postać homo i heterozygotyczna [13], anemię sierpowatokrwinkową [1] lub stan po
splenektomii) [5]. W literaturze pojawiają się również przesłanki
o zastosowaniu tego testu w diagnostyce schorzeń czerwonokrwinkowych pacjentów mocznicowych oraz cukrzyków [1].
Jest to również test przesiewowy w kierunku beta-talasemii w krajach mniej zamożnych, gdzie automatyczne analizatory hematologiczne są mniej dostępne [6, 8].
Do wykonania testu metodą Daciego wymagane jest pobranie aż
0,5 ml krwi pełnej do probówki zawierającej antykoagulant [2].
Szybko postępujący rozwój nauk medycznych pozwolił na opracowanie nowych metod oznaczania oporności osmotycznej w celu
ułatwienia jej zastosowania w badaniach przesiewowych osób
podejrzanych o HS. Niejednokrotnie są to metody mniej czasochłonne, prostsze w wykonaniu, a przede wszystkim wymagające
o wiele mniejszej objętości materiału niezbędnego do wykonania
badania. Biorąc pod uwagę fakt, iż test oporności osmotycznej wykonywany jest przede wszystkim u dzieci i noworodków, objętość
pobieranej próbki może mieć kluczowe znaczenie.
Test hemolizy w zakwaszonym glicerolu (AGLT 50)
Efektem jednej z pierwszych prób udoskonalenia testu oporności
osmotycznej był test szybkości hemolizy w zakwaszonym glicerolu (AGLT 50) według A. Zanelli i współpracowników [5, 9, 14].
Zasada testu AGLT 50 opiera się na pomiarze czasu, jaki upływa
od początku analizy do momentu zhemolizowania 50% krwinek
czerwonych uprzednio zawieszonych w zbuforowanym kwaśnym
hipotonicznym roztworze NaCl/PBS z glicerolem. Do kuwety,
w której umieszczono próbę badaną, dodaje się odpowiednią
objętość odczynnika glicerolowego i natychmiast rozpoczyna
pomiar spektrofotometryczny. Odczyt czasu, po którym następuje
50% hemoliza, jest wspomagany równocześnie wykonywanymi
pomiarami absorbancji przy długości fali 620 nm, a wynikiem
jest określenie czasu, po upływie którego wyjściowa absorbancja zmniejszyła się o połowę. Prawidłowy wynik testu AGLT50
wynosi powyżej 1800 sekund, podczas gdy u pacjentów chorych
na sferocytozę wrodzoną lub inną niedokrwistość hemolityczną
wynik ten jest znacznie skrócony i wynosi od 25 do 150 sekund
[9]. W związku z tym, że czułość testu AGLT50 utrzymuje się na
poziomie bliskim 100%, a jego swoistość wynosi jedynie 66,6%,
test ten nie pozwala na różnicowanie poszczególnych typów niedokrwistości hemolitycznych.
Pink Test
Modyfikacją testu AGLT 50, wykazującą zbliżoną [6] lub według
niektórych źródeł nieco większą [16] czułość diagnostyczną, jest
metoda umownie zwana ,,Pink Test”. Po raz pierwszy została
opisana przez Vettore i wsp, a następnie zmodyfikowana przez
Judkiewicz i wsp. Polega na określeniu hemolizy w roztworze
Diagn Lab 2015; 51(3): 229-234
zawierającym glicerol zbuforowany do pH 6,66 buforem Bis-Tris
(70 mmol/L). ,,Pink Test’’ jest metodą punktu końcowego opartą
na ocenie hemolizy półilościowo lub ilościowo w próbkach zawierających niewielkie objętości krwi zawieszone w roztworze
zawierającym 135 mmol/L glicerolu, 25 mmol/L NaCl i HCl. Bez
wątpienia zaletą tej uproszczonej metody są niewielkie objętości
wykorzystywanego materiału biologicznego, a brak konieczności
wcześniejszego pobrania krwi do probówek zawierających antykoagulant stwarza możliwość przeprowadzenia badania również
u noworodków i niemowląt oraz bezpośrednio po pobraniu krwi.
,,Pink Test’’ daje dodatni wynik nie tylko u pacjentów chorych na
sferocytozę wrodzoną, ale również u osób z przewlekłą niewydolnością nerek, niedokrwistością immunohemolityczną, czy przewlekłymi chorobami hemoproliferacyjnymi. Ponadto pozytywne
wyniki zanotowano również u kobiet ciężarnych. Ujemne wyniki
testu obserwowano natomiast w innych niedokrwistościach mikrocytowych (beta-talasemia, niedokrwistość z niedoboru żelaza)
[6, 16, 17].
Ocena oporności osmotycznej z wykorzystaniem cytometrii
przepływowej (FCM OF Test)
Prostota procedury, brak konieczności stosowania drogich odczynników oraz krótki czas analizy próbki stanowią największe
zalety badania oporności osmotycznej erytrocytów z wykorzystaniem cytometrii przepływowej (FCM OF Test). Metoda ta została
opisana przez Won i Suh [18], a polega na ocenie liczby komórek
krwinek czerwonych pozostałych w zawiesinie po dodaniu do niej
wody dejonizowanej. Jest to test służący do przesiewowej diagnostyki sferocytozy wrodzonej [18, 19]. Dzięki łatwości wykonania
i interpretacji wyników być może wkrótce zostanie wprowadzony
do rutynowej diagnostyki laboratoryjnej.
Zasada testu jest taka sama jak w przypadku metody konwencjonalnej. Pierwszym krokiem testu jest dwuetapowe przygotowanie
próbki krwi pacjenta do analizy:
Etap 1. Ustaloną objętość krwi pełnej pobranej do probówki z wersenianem potasu (K3-EDTA) dodaje się do 1,1 ml roztworu soli
fizjologicznej (0,9% NaCl). Objętość materiału wykorzystanego
do badania jest obliczana według niżej przedstawionego wzoru, tak aby każda z badanych próbek zawierała zbliżoną liczbę
erytrocytów:
V (µl) =
130
x 106
RBC
gdzie: V – objętość próbki krwi pobieranej do analizy, RBC – liczba krwinek czerwonych w µl x106
Rycina 1. Cytogramy przedstawiające proces analizy w przebiegu cytometrycznego testu oporności osmotycznej. A – cytogram zależności wielkości od objętości komórek, w bramce K zaznaczony jest obszar zliczania erytrocytów; B – cytogram zależności liczby komórek od czasu analizy, który, w poszczególnych bramkach, wynosi 30
sekund. Przerwa w analizie, zaznaczona strzałką, wskazuje na moment dodania do zawiesiny wody dejonizowanej (czas, w trakcie którego cytometr jest wstrzymywany,
do próbki dodawana jest woda i cytometr wznawia zliczanie komórek – zależny od analizatora); C – tabela statystyki analizy dla cytogramu B, podkreślono liczby komórek
w pierwszej, przedostatniej i ostatniej bramce analizy.
231
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
Etap 2. Tak przygotowane erytrocyty ponownie się rozcieńcza,
dodając 10 µl zawiesiny do 1,1 ml 0,9% NaCl.
Drugim krokiem testu jest cytometryczna analiza przygotowanej
zawiesiny. W trakcie badania w czasie rzeczywistym określana
jest liczba krwinek czerwonych w zawiesinie przed, a następnie
po dodaniu wody dejonizowanej. Czas analizy jednej próbki nie
przekracza 300 s. Zbieranie sygnałów erytrocytów odbywa się na
wykresie zależności wielkości komórki (FS – ang. forward scatter)
od czasu, który podzielony jest na bramki równej wielkości (obszary kolejno pokonywane w czasie przez komórki w trakcie analizy).
Po rozpoczęciu analizy, w trybie ciągłym cytometr zlicza komórki
w wyjściowej zawiesinie krwinek czerwonych i po dodaniu do niej
0,9 ml wody dejonizowanej. Stopień hemolizy w badanej próbce
wyrażany jest jako %PKKC (% pozostałych komórek krwinek czerwonych). stanowiący stosunek średniej liczby komórek z dwóch
ostatnich bramek pozostałych w zawiesinie po dodaniu wody
dejonizowej, do liczby komórek obecnych w próbce pierwotnie,
obliczany ze wzoru:
% PKKC =
(y+Z) / 2
x 100%
1,1
.
A
2
gdzie: PKKC – pozostałe komórki krwinek czerwonych, Y – liczba komórek w przedostatniej bramce analizy, Z – liczba komórek w ostatniej bramce analizy, A – liczba
komórek w pierwszej bramce analizy
Współczynnik korekcji 1, 1/2, 0 został uwzględniony w równaniu,
w celu wyrównania objętości płynów w próbce pierwotnej i po
dodaniu wody dejonizowanej. Przykładowy odczyt cytometryczny
został przedstawiony na rycinie 1.
Znaczące zmniejszenie liczby krwinek czerwonych pozostałych po
ekspozycji na wodę dejonizowaną, jest wskaźnikiem obniżonej
oporności osmotycznej. Każde laboratorium stosujące tę metodę
powinno ustalić własny zakres referencyjny %PKKC [18]. Oporność
osmotyczna mierzona przy pomocy cytometru przepływowego
może stać się cennym, alternatywnym narzędziem wykorzystywanym w diagnostyce przesiewowej zaburzeń błonowych krwinek
czerwonych, głównie ze względu na prostotę wykonania badania
oraz skuteczność porównywalną nawet z testem wiązania maleimidu-5’-eozyny (test EMA) [18]. Test FCM OF, w porównaniu
z innymi metodami oznaczenia oporności osmotycznej, jest mniej
pracochłonny, oszczędza czas oraz koszty, a ilościowa i obiektywna analiza bez wątpienia stawiają tę metodę na pierwszym
miejscu wśród innych technik określania oporności osmotycznej,
w laboratoriach dysponujących analizatorem mogącym zliczać
komórki w czasie. Jest to jednak metoda, która wymaga dalszej
weryfikacji w trakcie kolejnych badań klinicznych [18, 19, 20].
łu wykonanego z polidimetylosiloksanu (DPMS) uszczelnionego
szklaną przykrywką. System ten umożliwia wykonanie badania
z wykorzystaniem tylko kilku mikrolitrów pobranego materiału,
a czas pojedynczej analizy to zaledwie kilka minut. Stosunkowo
niski koszt oraz mobilność przenośnego chipu to dodatkowe zalety tej metody. Ogromne znaczenie platformy ma jej biokompatybilność, optyczna transparentność, znikoma toksyczność oraz
niski koszt produkcji [20]. DPMS jest to polimer, którego główny
łańcuch zbudowany jest z połączonych na przemian atomów tlenu
oraz krzemu, przy czym większość atomów krzemu jest podstawionych grupami metylowymi. Jest to polimer silnie hydrofobowy, przepuszczalny dla gazów, przezroczysty. Znajduje szerokie
zastosowanie w dziedzinie nauk biologiczno-medycznych oraz
fizycznych, a w ostatnich latach jest coraz częściej wykorzystywany
do produkcji mikrosystemów chemicznych (tzw. Lab-On-a-Chip)
[21]. Istotnym elementem platformy są również dwie strzykawki
pełniące funkcję pomp aplikujących próbkę krwi oraz czystą wodę.
Materiałem wykorzystywanym w badaniu jest świeża krew rozcieńczona w stosunku 1:10 roztworem NaCl w różnym stężeniu.
Roztwory te są tworzone na pojedynczym chipie. Różne poziomy
hemolizy (brak, częściowa hemoliza oraz całkowita hemoliza)
są określane dzięki możliwości komputerowego przetwarzania
obrazu oraz liczenia komórek, które mogą być obserwowane
bezpośrednio pod mikroskopem. Wyniki analizy są zapisywane
i automatycznie analizowane przez komputer. Możliwość oszacowania stopnia hemolizy na podstawie porównania liczby komórek
w obrazach za pomocą programu komputerowego, prostota oraz
szybkość wykonywanych oznaczeń dają szansę na wykorzystanie
tej metody w przyszłej diagnostyce zaburzeń czerwonokrwinkowych [21, 22].
Podsumowanie
Wiele prac naukowych ostatnich lat skupiało się na udoskonaleniu tradycyjnej techniki oceny oporności osmotycznej. Dzięki
tym osiągnięciom możliwe, iż test ten ponownie zyska na swoim
znaczeniu, a dzięki łatwości w wykonaniu oraz swej dostępności
powróci do rutynowej diagnostyki przesiewowej zaburzeń czerwonokrwinkowych, w tym sferocytozy wrodzonej. Zmniejszenie
minimalnej objętości materiału wymaganego do przeprowadzenia badania to milowy krok w kierunku udoskonalenia diagnostyki
najmłodszych pacjentów.
Piśmiennictwo
1.
tion: A New Parameter for Determination of the Osmotic Properties of Human
Red Blood Cell. BioMed Res Int 2014; 2014: 162102.
2.
232
Sowemimo-Coker SO. Red blood cell hemolysis during processing. Transfus
Med Rev 2002; 16 (1): 46-60.
3.
Microfluidic Platform
Pojawienie się po raz pierwszy projektu microfluidic platform (co
miało miejsce w 1970 roku) skłoniło naukowców do szerszego
spojrzenia na problem wielu zagadnień biomedycznych, w tym
również oporności osmotycznej [20]. Chip, będący podstawowym
elementem pomiarowym platformy, jest zbudowany z mikrokana-
Walski T, Chludzińska L, Komorowska M. Individual Osmotic Fragility Distribu-
Pribush A, Hatskeleton L, Kapelushnik J. Osmotic swelling and whole formation
in membranes of thalassemic and spherocytic erythrocytes. Blood Cells Mol
Dis 2003; 31: 43-47.
4.
Gmerek K, Fabijańska-Mitek J, Łoniewska-Lwowska A. Impact of red blood cell
storage under the blood bank conditions on their reactivity with autoantibodies.
Centr Eur J Immunol 2012; 37: 243-246.
5.
Manhanda N. Anemias – red blood cells morphology and approach to diagnosis;
w Keohane EM, Smith LJ, Walenga FM. Rodak’s Hematology: clinical principles
and applications. Wyd. Elsevier Health Sciences, St. Louis, 2007: 284-296.
Diagn Lab 2015; 51(3): 229-234
6.
Paleari R, Mosca A. Controversies on the osmotic fragility test, Enerca (The European network aimed at improving he diagnosis, epidemiological knowledge
and medical education on rare and congenital anaemia), News (2008): 1– 3.
7.
Adamowicz-Salach A. Sferocytoza wrodzona u dzieci– badania disgnostyczne
i postępowanie terapeutyczne. Borgis – Postępy Nauk medycznych 2013; 9:
646-650.
8.
Fathelrahman M H, Altrasheedy Y. K. Validation of Osmotic Fragility Test Using
a modified new Garden Angelica Reagent in Healthy Individuals Blood, Saudia
Arabia. Asian Journal of Biomedical and pharmaceutical sciences 2012; 2: 37-40.
9.
Żarlak W, Adamowicz-Salach A, Ciepiela O. Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej. Diagn Lab 2012; 48: 25-31.
10. Bolton-Mags P. H. B, Langer J. C, Iolascon A. Guidelines for the diagnosis and
management of hereditary spherocitosis-2011 update. Br J Haematol 2011;
156: 37-49.
11. Bianchi P, Fermo E, Vercellati C. Diagnostic Power of laboratory tests for hereditary spherocytosis: a comparison study in 150 patients grouped according
to molecular and clinical characteristics. Haematologica 2012; 97 (4): 516-523.
12. Sank Hyuk P, Chan-Jeoung P, Bo-Ra L. Comparison Study of the Eosin-5’-Maleimide Binding Test, Flow cytometric Osmotic Fragility Test and Cryohemolysis Test in
the Diagnosis of Hereditary Spherocytosis. Am J Clin Pathol 2014; 142: 474-484.
13. Christensen RD, Henry E. Hereditary Spherocytosis in Neonates with hyperbilirubinemia. Pediatrics 2010; 126: 455-474.
14. Zanella A, Izzo C, Rebulla P, Zanuso F, Perroni L, Sirchia G. Acidified glycerol lysis
test: a screening for hereditary spherocytosis. Br J Haematol 1980; 45: 481-486.
15. Perrota S, Gllagher PG, Mohandas N. Hereditary spherocytosis. The Lancet
2008; 372: 1411-1426.
16. Vettore L, Zanella A, Molaro GL. A new test for the laboratory diagnosis of
spherocytosis. Acta Haemat 1984; 72: 258-63.
17. Sureda Balari A, Villarrubia Espinosa J, Fernandez Fuertes I. A New Madification
of the ‘Pink Test’ for the Diagnosis of Hereditary. Acta Hemat 1989; 82: 213-214.
18. Warang P, Gupta M, Kedar P. Flow Cytometric Osmotic Fragility– An effective screening approach for red cell membranopathies. Cytometry 2011; 80 (B): 186-190.
19. Won DI, Suh JS. Flow cytometric detection of erythrocyte osmotic fragility.
Cytometry 2009; 76 (B): 135-141.
20. Hara Prasad P, Sonal J. Flow Cytometry in Hematological Disorders; Indian
J Pediatr 2013; 80: 772-778.
21. Lei L, Jing S, Jing L. A microfluidic platform for osmotic fragility test of red blood
cells. RSC Advances 2012; 2: 7161-7165.
22. Cooper McDonald J, Duffy D. C, Anderson J.R. Fabrication of microfluidic systems
in poly (dimethylsiloxane). Electrophoresis 2000; 21: 27-40.
Adres do korespondencji:
dr n. med. Olga Ciepiela
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej
Wieku Rozwojowego
Warszawski Uniwersytet Medyczny
02-091 Warszawa, ul. Żwirki i Wigury 63a
Tel. +48 22 6296517
e-mail: [email protected]
Zaakceptowano do druku: 23.10.2015
233
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
234