Białka rekombinowane i ukierunkowana mutageneza (2011/2012)

INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
Instrukcja do ćwiczenia nr 4
Przygotowanie komórek kompetentnych
CEL
Przygotowanie do transformacji komórek E. coli ze szczepu DH5α lub Origami B(DE3).
MATERIAŁY
PŁYNNA HODOWLA BAKTERYJNA
• Szczep E. coli DH5α
• Szczep E. coli Origami B(DE3)
ROZTWORY
• 50 mM CaCl2
• 50 mM CaCl2, 10% glicerol
• H2O sterylna
• 10% glicerol
WYKONANIE ĆWICZENIA
PODGRUPA A
PRZYGOTOWANIE KOMÓREK ELEKTROKOMPETENTNYCH
1. Do sterylnej kolby Erlenmeyera przelać 100 ml LB a następnie zaszczepić pięcioma
mililitrami całonocnej hodowli bakterii DH5α. Brzeg kolby oraz folię, którą była
przykryta kolba, zdezynfekować (opalić nad płomieniem). Starannie zasłonić otwór
kolby folią.
2. Kolbę umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, włączyć wytrząsanie. Co 20
minut mierzyć wartość OD600. Prowadzić hodowlę do momentu, gdy gęstość optyczna
zawiesiny osiągnie wartość z przedziału 0,3–0,5.
3. Po uzyskaniu odpowiedniego OD przenieść hodowlę do pudełka z lodem i inkubować
przez 10 minut. Dodatkowo umieścić na lodzie dwie sterylne probówki
o obj. 50 ml, dwie probówki o obj. 2 ml i 5 probówek o obj. 1,5 ml. Probówki o obj. 1,5
ml podpisać wg schematu: DH5α, elektrokomp., data, nr grupy.
UWAGA! Od tej chwili temperatura zawiesiny komórek nie powinna przekroczyć 4°C.
4. Przelać zawiesinę komórek do schłodzonych probówek (2 x 50 ml). Wirować komórki
przez 10 minut przy prędkości 4000 rpm, w temperaturze 4°C.
5. Delikatnie wylać nadsącz. Osad komórek zawiesić w 100 ml sterylnej, schłodzonej
wody (2 x 50 ml). Zwirować, jak w pkt. 4.
6. Delikatnie usunąć nadsącz. Komórki zawiesić w 50 ml sterylnej schłodzonej wody (2 x
25 ml). Zwirować, jak w pkt. 4.
7. Delikatnie usunąć nadsącz. Zawiesić bakterie w 1800 µl schłodzonego, sterylnego
10-procentowego roztworu glicerolu (2 x 0,9 ml) i przenieść do jednej dwumililitrowej
probówki. Ponownie zwirować przez 10 minut z prędkością 4000 rpm (temp. 4°C.)
8. Używając pipety dokładnie usunąć nadsącz. Rozpuścić komórki w 250 µl sterylnego
schłodzonego 10-procentowego glicerolu i rozdzielić po 50 µl do opisanych sterylnych
probówek typu Eppendorf. Zamrozić w temperaturze -80°C.
1
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015)
PODGRUPA B
PRZYGOTOWANIE KOMÓREK KOMPETENTNYCH METODĄ CHEMICZNĄ
1. Do sterylnej kolby Erlenmeyera przelać 50 ml LB (w przypadku komórek Origami
B(DE3) LB powinno dodatkowo zawierać antybiotyki kanamycynę oraz tetracyklinę)
a następnie dodać 2,5 ml całonocnej hodowli bakterii DH5α lub Origami B(DE3).
Brzeg kolby oraz folię, którą była przykryta kolba, zdezynfekować (opalić nad
płomieniem). Starannie zasłonić otwór kolby folią.
2. Kolbę umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, włączyć wytrząsanie. Co 20
minut mierzyć wartość OD600. Prowadzić hodowlę do momentu, gdy gęstość optyczna
zawiesiny osiągnie wartość z przedziału 0,3–0,5.
3. Po uzyskaniu odpowiedniego OD przenieść hodowlę do pudełka z lodem i inkubować
przez 10 minut. Dodatkowo umieścić na lodzie dwie sterylne probówki o obj. 50 ml
i 10 probówek o obj. 1,5 ml. Probówki o obj. 1,5 ml podpisać wg schematu: Kom.
komp. DH5α, data, nr grupy lub Kom. komp. Origami B (DE3), data, nr grupy
UWAGA! Od tej chwili temperatura zawiesiny komórek nie powinna przekroczyć 4°C.
4. Przelać zawiesinę komórek do schłodzonych probówek (2 x 25 ml). Wirować komórki
przez 10 minut, przy prędkości 4000 rpm, w temperaturze 4°C.
5. Delikatnie wylać nadsącz. Komórki bakteryjne zawiesić w sterylnym schłodzonym
buforze: 50mM CaCl2, pH 8 w objętości równej ½ początkowej objętości hodowli (2 x
12,5 ml).
6. Inkubować na lodzie 10 minut.
7. Powtórnie zwirować (15 minut, 4000 rpm, 4°C).
8. Delikatnie usunąć nadsącz. Komórki zawiesić w roztworze: 50mM CaCl2, 10%
glicerol, pH 8 w 1/15 objętości wyjściowej hodowli (2 x 1,66 ml).
9. Do każdej z podpisanych, schłodzonych probówek typu Eppendorf dodać po 300 µl
zawiesiny komórek, delikatnie wymieszać i zamrozić w temperaturze -80°C.
WYTYCZNE DO SPRAWOZDANIA NR 1
Po czwartych ćwiczeniach w sprawozdaniu proszę napisać, którą z metod wykorzystywali
Państwo do przygotowania komórek kompetentnych oraz podać wartość OD600, przy której
rozpoczęto procedurę.
2