cobas KRAS Mutation Test

Transkrypt

cobas® KRAS Mutation Test
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
cobas® DNA Sample Preparation Kit
DNA SP
24 Tests
P/N: 05985536190
KRAS
24 Tests
P/N: 05852170190
UWAGA: Zakup niniejszego produktu umożliwi nabywcy zastosowanie go do amplifikacji i detekcji sekwencji kwasu
nukleinowego z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz związanych z nią procesów w ramach
diagnostyki in vitro z użyciem materiału ludzkiego. Wraz z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje
żadnego patentu ogólnego ani innej licencji, oprócz prawa do określonego, szczególnego zastosowania produktu.
ZASTOSOWANIE
Test cobas® KRAS Mutation Test, przeznaczony do stosowania z systemem cobas® 4800, to test oparty na reakcji real-time
PCR, przeznaczony do identyfikacji mutacji w kodonach 12, 13 i 61 genu KRAS w DNA uzyskanym z utrwalonych w formalinie
i zatopionych w parafinie próbek ludzkiej tkanki raka jelita grubego oraz niedrobnokomórkowego raka płuc.
PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU
Białko KRAS:
Białko KRAS należy do nadrodziny małych białek G. Białko KRAS działa jak przełącznik regulowany przez GDP/GTP,
przekazujący sygnały zewnątrzkomórkowe, które wpływają na proliferację komórkową, apoptozę i przebudowę cytoszkieletu
aktynowego. Mutacje w aminokwasach numer 12, 13 oraz 61, występujące w wielu rodzajach nowotworów u ludzi, w tym w raku
jelita grubego (ang. colorectal cancer, CRC) oraz niedrobnokomórkowym raku płuc (ang. non-small cell lung cancer, NSCLC),
powodują zablokowanie enzymu w aktywowanej formie związanej z GTP, co powoduje stałe przekazywanie sygnału i stymulację
procesu onkogennego1.
Rak jelita grubego (CRC):
Mutacje w genie KRAS występują w 24–43% przypadków nowotworów jelita grubego2-3. Chociaż zidentyfikowano ponad
3000 mutacji punktowych w genie KRAS, większość z nich występuje w kodonie 12 lub 13 (ok. 82% w kodonie 12 oraz ok. 17%
w kodonie 13); mutacje genu KRAS występujące w innych kodonach (np. kodonie 61) są rzadsze (1–4% mutacji). Chociaż
mutacje w kodonie 61 nie są częste, wykazano, że podobnie jak mutacje w kodonie 12 i 13 również skutkują konstytutywną
aktywacją białka KRAS4, a opublikowane dane wskazują, że wystąpienie mutacji w kodonie 61 pozwala przewidzieć brak
odpowiedzi na leczenie z użyciem przeciwciał monoklonalnych anty-EGFR5-6.
Cetuximab oraz panitumumab to przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu
(ang. Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) i zatwierdzone do stosowania u pacjentów z dającym przerzuty rakiem jelita
grubego. Mimo że od 50% do 80% guzów jelita grubego cechuje się nadekspresją genu EGFR, ekspresja białka EGFR
i amplifikacja kodującego go genu mają ograniczoną wartość prognostyczną w ocenie prawdopodobieństwa odpowiedzi na
leczenie cetuximabem lub panitumumabem7.
Istnieją jednak silne dowody na to, że mutacja w genie KRAS koreluje z brakiem odpowiedzi na stosowanie przeciwciał
skierowanych przeciwko białku EGFR u pacjentów z dającym przerzuty rakiem jelita grubego oraz że stosowanie przeciwciał
przeciwko białku EGFR może być szkodliwe dla tych pacjentów8-9. Dowody popierające te ustalenia pochodzą z:
• retrospektywnych analiz badań bez grupy kontrolnej10-11,
• retrospektywnych analiz badań randomizowanych12-13,
• prospektywnych badań randomizowanych14.
Wyniki tych badań przyczyniły się do sformułowania przez główne organizacje onkologiczne w Stanach Zjednoczonych (ASCO,
NCCN)15-16 i Europie (ESMO)17 zalecenia wykonywania testów wykrywających mutacje w genie KRAS u pacjentów, którzy mają
zostać poddani leczeniu z użyciem przeciwciał anty-EGFR. Co więcej, organy regulacyjne w Stanach Zjednoczonych i Europie
ograniczyły stosowanie tej metody leczenia wyłącznie do pacjentów z guzami charakteryzującymi się naturalnie występującą
sekwencją genu KRAS18-19.
Niedrobnokomórkowy rak płuc (NSCLC):
W przypadku NSCLC zidentyfikowano wiele powtarzających się nieprawidłowości molekularnych. Mutacje punktowe w genie
KRAS stwierdzono w 10–30% przypadków zaawansowanego raka niedrobnokomórkowego płuc, głównie w gruczolakorakach20.
Najczęściej mutacje somatyczne występują w kodonach 12, 13 i 61 genu KRAS/RAS i powodują nagromadzenie w komórce
aktywnego białka KRAS/RAS, co skutkuje aktywacją ścieżek sygnałowych biorących udział w transformacji nowotworowej.
Rozdział Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu.
06322379001-03PL
1
Doc Rev. 3.0
W opublikowanym piśmiennictwie można znaleźć informacje, że w przypadku pacjentów z zaawansowanym NSCLC z mutacją
w genie KRAS rokowanie jest gorsze21, a chemioterapia uzupełniająca22 lub leczenie z wykorzystaniem terapii TKI skierowanej
przeciwko białku EGFR może nie przynieść korzyści23. Stwierdzono również, że u pacjentów z guzami obarczonymi mutacjami
w genie EGFR nie występują mutacje w genie KRAS i na odwrót24. W związku z tym pacjenci ci stanowią podgrupę chorych
z NSCLC z niespełnionym istotnym zapotrzebowaniem klinicznym ze względu na mniejszą liczbę dostępnych opcji leczenia
w porównaniu z pacjentami, u których w tkankach guza nie stwierdzono mutacji w genie KRAS.
Test cobas® KRAS Mutation Test
Test cobas® KRAS Mutation Test to test oparty na reakcji PCR, przeznaczony do wykrywania obecności mutacji somatycznych
w kodonach 12, 13 i 61 protoonkogenu KRAS i umożliwiający dzięki temu identyfikację pacjentów z zaawansowanym rakiem
jelita grubego (CRC), w przypadku których leczenie z użyciem przeciwciał monoklonalnych anty-EGFR może nie być korzystne,
lub pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC), którzy mogą nie odnieść korzyści ze stosowania chemioterapii
uzupełniającej lub leczenia erlotynibem.
ZASADY PROCEDURY
cobas® KRAS Mutation Test oparty jest na dwóch głównych procesach: (1) ręcznym przygotowaniu próbki w celu pozyskania
genomowego DNA z utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek tkanki (ang. formalin-fixed, paraffin-embedded
tissue, FFPET) oraz (2) amplifikacji w reakcji PCR docelowego DNA z użyciem par primerów komplementarnych oraz dwóch
znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym sond oligonukleotydowych. Jedna z sond przeznaczona jest do detekcji sekwencji
kodonu 12/13 genu KRAS w eksonie 2, natomiast druga sonda wykrywa sekwencję kodonu 61 genu KRAS w eksonie 3 genu
KRAS. Detekcję mutacji uzyskuje się w toku analizy krzywej topnienia z użyciem analizatora cobas z 480. Do każdego
przebiegu testowego włącza się kontrolę mutacji, kontrolę ujemną oraz kalibrator w celu potwierdzenia ważności przebiegu.
Przygotowanie próbki
Przetwarzanie próbek FFPET oraz izolowanie genomowego DNA wykonuje się za pomocą zestawu do przygotowywania próbek
cobas® DNA Sample Preparation Kit według ogólnej metody ręcznego przygotowywania próbek, opartej na wiązaniu kwasu
nukleinowego przez włókna szklane. Pozbawiony parafiny skrawek próbki FFPET o grubości 5 µm zostaje poddany lizie przez
inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do lizy/wiążącym, który uwalnia kwasy nukleinowe
i chroni uwolniony genomowy DNA przed DNazami. W dalszej kolejności do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje się
izopropanol, po czym mieszaninę wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym, zawierającym włókna szklane.
W trakcie wirowania genomowy DNA ulega związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie jak
sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w wyniku wirowania. Zaadsorbowane kwasy
nukleinowe są przemywane i poddane elucji roztworem wodnym. Ilość genomowego DNA określa się spektrofotometrycznie
i dostosowuje do ustalonego stężenia dodawanego do mieszaniny do amplifikacji/detekcji. Następnie docelowy DNA amplifikuje
się i poddaje detekcji w analizatorze cobas z 480 z użyciem odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz
z zestawem cobas® KRAS Mutation Test.
Amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
W teście cobas® KRAS Mutation Test stosowane są primery określające w ludzkim genomowym DNA fragment sekwencji
eksonu 2 składający się z 85 par zasad, obejmujący kodon 12 i 13 genu KRAS, oraz fragment o długości 75 par zasad
w eksonie 3, obejmujący kodon 61 genu KRAS. Amplifikacja zachodzi jedynie w regionach genu kodującego KRAS między
primerami; całość genu KRAS nie ulega amplifikacji.
Amplifikacja sekwencji docelowej
Do amplifikacji sekwencji docelowej wykorzystuje się polimerazę DNA Z05 pochodzącą z gatunku Thermus. Mieszanina
reakcyjna PCR jest najpierw podgrzewana w celu zdenaturowania genomowego DNA oraz odsłonięcia sekwencji docelowych
primerów. W miarę ochładzania się mieszaniny primery sensowne oraz antysensowne hybrydyzują z docelowymi sekwencjami
DNA. Polimeraza DNA Z05 w obecności jonu dwuwartościowego metalu oraz nadmiaru dezoksyrybonukleotydów (dNTP)
wydłuża każdy przyłączony w wyniku hybrydyzacji primer i w ten sposób następuje synteza drugiej nici DNA. Proces ten kończy
pierwszy cykl reakcji PCR, dostarczając dwuniciowej kopii DNA, zawierającej regiony genu kodującego KRAS z docelowymi
sekwencjami o długości 85 i 75 par zasad. Proces ten powtarza się wielokrotnie, przy czym w każdym z cykli ilość
zwielokrotnionego DNA (amplikonu) ulega podwojeniu. Amplifikacja zachodzi jedynie w regionach genu kodującego KRAS
między parami primerów; całość genu KRAS nie ulega amplifikacji.
06322379001-03PL
2
Doc Rev. 3.0
Zautomatyzowana detekcja mutacji w czasie rzeczywistym
Analizator cobas z 480 umożliwia wykonywanie w czasie rzeczywistym pomiarów poziomu fluorescencji generowanej przez
określone produkty reakcji PCR. Po procesie amplifikacji każdy amplikon wytworzony z użyciem testu cobas® KRAS Mutation
Test jest poddawany programowi topnienia, w którym temperatura jest podnoszona stopniowo od 40°C do 95°C (TaqMelt).
W niskich temperaturach sonda swoista do naturalnie występującej sekwencji genu wiąże się zarówno do amplikonu o naturalnie
występującej sekwencji, jak i zawierającego mutację. W stanie związanym fluoresceina znajdująca się na końcu 5' sondy,
będąca barwnikiem reporterowym, jest zlokalizowana wystarczająco daleko od umieszczonego na końcu 3' barwnika
wygaszającego, co powoduje, że barwnik fluorescencyjny emituje światło o określonej długości fali. Wraz ze wzrostem
temperatury sonda oddysocjowuje od amplikonu, umożliwiając barwnikowi wygaszającemu kontakt z barwnikiem
fluorescencyjnym, co powoduje obniżenie poziomu mierzalnej fluorescencji. Amplikony z idealnym dopasowaniem do sondy
(naturalnie występująca sekwencja) ulegają topnieniu w temperaturze wyższej niż amplikony z jednym lub większą liczbą
niedopasowań (sekwencja z mutacją). Na każdym etapie przyrostu temperatury mierzony jest poziom fluorescencji, a następnie
obliczana temperatura topnienia. Obecność sekwencji genu KRAS z mutacją w kodonach 12 i 13 eksonu 2 oraz w kodonie 61
eksonu 3 można wykryć, gdy temperatury topnienia mieszczą się w określonych przedziałach. Aby uniknąć wykrycia
w kodonie 12 i 13 mutacji cichych (niewywołujących zmian sekwencji aminokwasów), wprowadzono zmodyfikowaną zasadę,
pełniącą rolę zasady uniwersalnej, która jest odpowiedzialna za wygenerowanie temperatury topnienia mieszczącej się
w zakresie temperatur dla sekwencji bez mutacji.
Amplifikacja wybiórcza
Amplifikację wybiórczą docelowego kwasu nukleinowego z próbki podczas przeprowadzania testu cobas® KRAS Mutation
Test uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylazy) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dUTP)25.
Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę, lecz nie łańcuchów DNA
zawierających tymidynę. Dezoksyurydyna nie wchodzi w skład występującego w naturze DNA, jest natomiast zawsze obecna
w amplikonie wskutek użycia dUTP zamiast trójfosforanu tymidyny jako jednego z trójfosforanów nukleotydów
w odczynnikach Reaction Mix; dlatego wyłącznie amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość
zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Zawarty
w odczynniku Reaction Mix enzym AmpErase katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt
dezoksyurydynowych przez otwarcie łańcucha dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu
termicznym przy wartościach pH oznaczających środowisko zasadowe łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, w którym
znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny
w temperaturach powyżej 55°C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu
docelowego. Wykazano, że cobas® KRAS Mutation Test dezaktywuje na każdą reakcję PCR co najmniej 103 kopii
zawierającego dezoksyurydynę amplikonu zmutowanej sekwencji genu KRAS.
ODCZYNNIKI
cobas® DNA Sample Preparation Kit
Zestaw do przygotowywania próbek DNA cobas®
(P/N: 05985536190)
DNA SP
DNA TLB
(DNA Bufor do lizy tkanek)
Bufor Tris-HCl
Chlorek potasu
0,04% EDTA
0,1% Tritonu X-100
0,09% azydku sodu
24 testy
1 x 10 ml
PK
(Proteinaza K)
Proteinaza K (liofilizowana)
Xn
Proteinaza K
1 x 100 mg
Produkt szkodliwy
06322379001-03PL
3
Doc Rev. 3.0
DNA PBB
(DNA Bufor wiążący parafinę)
Bufor Tris-HCl
49,6% chlorowodorku guanidyny
0,05% mocznika
17,3% Tritonu X-100
Xn
49,6% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny
1 x 10 ml
Produkt szkodliwy
WB I
(DNA Bufor płuczący I)
Bufor Tris-HCl
64% chlorowodorku guanidyny
Xn
64% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny
1 x 25 ml
Produkt szkodliwy
WB II
(DNA Bufor płuczący II)
Bufor Tris-HCl
Chlorek sodu
1 x 12,5 ml
DNA EB
(DNA bufor do elucji)
Bufor Tris-HCl
0,09% azydku sodu
1 x 6 ml
FT
(Probówki z filtrem i z zatyczkami)
1 x 25 sztuk
CT
(Probówki zbiorcze)
3 x 25 sztuk
(P/N: 05852170190)
KRAS
24 testy
KRAS MIX
(Mieszanina reakcyjna KRAS)
Bufor Tricine
Octan potasu
Wodorotlenek potasu
Glicerol
4,76% dimetylosulfotlenku
0,1% substancji konserwującej ProClin 300
< 0,9% dNTP
< 0,1% polimerazy DNA Z05 (bakteryjnej)
< 0,1% enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylazy) (bakteryjnej)
4 x 0,3 ml
MGAC
(Octan magnezu)
Octan magnezu
0,09% azydku sodu
4 x 0,2 ml
KRAS 12/13 OM
(Odczynnik KRAS Oligo Mix kodon 12/13)
Bufor Tris-HCl
EDTA
Poli-rA RNA (syntetyczny)
< 0,01% primerów sensownych i antysensownych KRAS
< 0,01% sondy KRAS znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym
2 x 0,3 ml
06322379001-03PL
4
Doc Rev. 3.0
KRAS 61 OM
(Odczynnik KRAS Oligo Mix kodon 61)
Bufor Tris-HCl
EDTA
< 0,01% primerów sensownych i antysensownych KRAS
< 0,01% sondy KRAS znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym
2 x 0,3 ml
KRAS MC
(Kontrola mutacji genu KRAS)
Bufor Tris-HCl
EDTA
0,05% azydku sodu
< 0,001% plazmidowego DNA (bakteryjnego) zawierającego sekwencję eksonu 2 i 3 genu KRAS
< 0,001% DNA z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS (z hodowli komórkowej)
4 x 0,1 ml
KRAS CAL
(Kalibrator KRAS)
Bufor Tris-HCl
EDTA
0,05% azydku sodu
< 0,001% DNA z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS (z hodowli komórkowej)
4 x 0,1 ml
DNA SD
(DNA Rozcieńczalnik próbki)
Bufor Tris-HCl
0,09% azydku sodu
2 x 3,5 ml
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
B. Niniejszy test jest przeznaczony do badania utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek tkanki raka jelita
grubego oraz niedrobnokomórkowego raka płuc.
C. Nie należy pipetować za pomocą ust.
D. Nie wolno jeść, pić ani palić w obszarach roboczych laboratorium.
E. Należy unikać zakażenia odczynników: bakteryjnego i przez DNA.
F. Należy wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki oraz zlewki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi,
stanowymi i lokalnymi.
G. Nie wolno używać zestawów po upływie ich dat przydatności.
H. Nie należy poddawać pulowaniu odczynników pochodzących z różnych zestawów lub serii.
I.
Aby zapobiec kontaminacji próbek i odczynników, należy nakładać rękawice i zmieniać je przed wznowieniem pracy z tymi
materiałami.
J.
Aby zapobiec kontaminacji roboczego odczynnika Master Mix (roboczego odczynnika MMX) próbkami DNA, należy
przeprowadzać amplifikację i detekcję w miejscu oddzielonym od obszaru wykonywania izolacji DNA. Przed
przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy amplifikacji i detekcji. W celu właściwego
oczyszczenia należy dokładnie przetrzeć wszystkie powierzchnie, włącznie ze statywami i pipetorami, 0,5% roztworem
podchlorynu sodu*, a następnie 70% roztworem etanolu.
K. Odczynniki DNA PBB i WB I zawierają chlorowodorek guanidyny. Jeśli płyn zawierający wspomniany bufor ulegnie rozlaniu,
do czyszczenia należy używać odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i wody. W przypadku rozlania płynu
zawierającego potencjalne czynniki zakaźne do czyszczenia należy używać najpierw detergentu laboratoryjnego i wody,
a następnie 0,5% roztworu podchlorynu sodu. W razie rozlania płynu na powierzchni analizatora cobas z 480 należy
postępować zgodnie ze wskazówkami zamieszczonymi w instrukcji obsługi analizatora cobas z 480.
06322379001-03PL
5
Doc Rev. 3.0
*UWAGA: Dostępne na rynku typowe płyny wybielające do zastosowania w gospodarstwach domowych zawierają
podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 pozwoli uzyskać
0,5-procentowy roztwór podchlorynu sodu.
L. Z próbkami należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak
określone w dokumentach: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories26 oraz CLSI Document M29-A3.27
M. Odczynnik DNA PBB zawiera Triton X-100, środek drażniący błony śluzowe. Należy unikać kontaktu tych odczynników
z oczami, skórą i błonami śluzowymi.
N. Odczynniki DNA TLB, DNA EB, MGAC, KRAS MC, KRAS CAL oraz DNA SD zawierają azydek sodu. Azydek sodu może
reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali.
Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą ilością zimnej wody, aby
zapobiec nagromadzeniu azydków.
O. Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny i podczas używania go należy korzystać z wyciągu chroniącego przed
chemikaliami. Należy go wyrzucać wraz z odpadami chemicznymi zgodnie z przepisami lokalnymi, stanowymi i federalnymi.
P. Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami należy używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic
jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do
kontaktu, trzeba natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do
oparzeń. W razie rozlania należy przed wytarciem rozcieńczyć wodą.
Q. Wszystkie przedmioty jednorazowego użytku są przeznaczone do jednokrotnego użycia. Nie należy ich używać powtórnie.
R. Nie wolno używać przedmiotów jednorazowego użytku po upływie daty ważności.
S. Do czyszczenia analizatora cobas z 480 nie wolno używać roztworu podchlorynu sodu (wybielacza). Czyszczenie
analizatora cobas z 480 należy przeprowadzać zgodnie z procedurami opisanymi w instrukcji obsługi analizatora cobas
z 480.
T. Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności i procedury mające na celu zmniejszenie ryzyka kontaminacji analizatora cobas
z 480 zamieszczono w instrukcji obsługi analizatora cobas z 480.
U. Zaleca się używanie jałowych, jednorazowych pipet oraz końcówek pipetorów wolnych od DNaz.
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA
A. Odczynniki DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT oraz CT przechowywać w temperaturze od 15°C do 30°C.
Po otwarciu odczynniki DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB oraz PK zachowują stabilność w przypadku
maksymalnie 8-krotnego użycia, przez 90 dni lub do momentu upływu daty ważności (w zależności od tego, który termin
wypada wcześniej).
B. Po dodaniu jałowej wody wolnej od nukleaz do odczynnika PK niezużyty, rozpuszczony odczynnik PK należy przechowywać
w porcjach o równych objętościach po 450 µl w temperaturze –20°C. Po rozpuszczeniu odczynnik PK trzeba zużyć w ciągu
90 dni albo do daty ważności, zależnie od tego, który termin wypada wcześniej.
C. Po dodaniu etanolu bezwodnego odczynniki WB I i WB II należy przechowywać w temperaturze od 15°C do 30°C.
Wymienione roztwory robocze zachowują stabilność przez 90 dni albo do daty ważności, w zależności od tego, który termin
wypada wcześniej.
D. Odczynniki KRAS MIX, MGAC, KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM, KRAS MC, KRAS CAL oraz DNA SD należy
przechowywać w temperaturze od –15°C do –25°C. Po otwarciu odczynniki te zachowują stabilność w przypadku
maksymalnie 4-krotnego użycia, przez 60 dni albo do daty ważności, w zależności od tego, który termin wypada wcześniej.
E. Przed użyciem wszystkie odczynniki należy pozostawić do rozmrożenia na co najmniej 1 godzinę w temperaturze od
15°C do 30°C. Po rozmrożeniu odczynniki należy użyć w ciągu 1 godziny, a niezużyty odczynnik w ciągu 1 godziny
zwrócić do przechowywania w temperaturze od –15°C do –25°C. Po otwarciu każda fiolka z odczynnikiem z wyjątkiem
odczynnika DNA SD może zostać wykorzystana do wykonania dozowania maksymalnie 4 porcji w ciągu 60 dni lub do
upływu daty ważności (zależnie od tego, który termin jest wcześniejszy).
F. Odczynniki KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM i odczynnik roboczy MMX (przygotowany przez dodanie odczynników
KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM oraz MGAC do odczynnika KRAS MIX) powinny być chronione przed długotrwałą
ekspozycją na światło.
06322379001-03PL
6
Doc Rev. 3.0
G. Przygotowany odczynnik roboczy MMX należy przechowywać w zaciemnionym miejscu w temperaturze od 2°C do 8°C.
Przygotowane próbki i kontrole należy dodać do roboczego odczynnika MMX w ciągu 1 godziny od jego przygotowania.
H. Próbki poddane obróbce (wyizolowany DNA) są stabilne przez 24 godziny w temperaturze od 20°C do 30°C, przez 14 dni
w temperaturze od 2°C do 8°C lub przez 60 dni w temperaturze od –15°C do –25°C. Poddane obróbce próbki zachowują
stabilność również w temperaturze od –15°C do –25°C po przebyciu 4 cykli zamrażania i rozmrażania.
I.
Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 1 godziny od chwili dodania przetworzonych próbek i kontroli do roboczego
odczynnika MMX (przygotowanego przez dodanie odczynnika KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM oraz MGAC do
odczynnika KRAS MIX).
DOSTARCZONE MATERIAŁY
DNA SP
A. cobas® DNA Sample Preparation Kit
Zestaw do przygotowywania próbek DNA cobas®
(P/N: 05985536190)
24 testy
DNA TLB
(DNA Bufor do lizy tkanek)
PK
(Proteinaza K)
DNA PBB
(DNA Bufor wiążący parafinę)
WB I
(DNA Bufor płuczący I)
WB II
(DNA Bufor płuczący II)
DNA EB
(DNA Bufor do elucji)
FT
(Probówki z filtrem i zatyczkami)
CT
(Probówki zbiorcze)
B. cobas® KRAS Mutation Test
(P/N: 05852170190)
KRAS
24 testy
KRAS MIX
(Mieszanina reakcyjna) (zatyczka z bezbarwnym przyciskiem)
MGAC
(Octan magnezu) (zatyczka z żółtym przyciskiem)
KRAS 12/13 OM
(Odczynnik KRAS Oligo Mix kodon 12/13) (zatyczka z białym przyciskiem)
KRAS 61 OM
(Odczynnik KRAS Oligo Mix kodon 61) (zatyczka ze złotym przyciskiem)
KRAS MC
(Kontrola mutacji KRAS) (zatyczka z czerwonym przyciskiem)
KRAS CAL
(Kalibrator KRAS) (zatyczka z fioletowym przyciskiem)
DNA SD
(DNA Rozcieńczalnik próbki)
06322379001-03PL
7
Doc Rev. 3.0
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
•
Ksylen (Sigma, nr kat. 247642, lub Fisher Scientific, nr kat. X5-4)
•
Etanol bezwodny (Sigma, nr kat. E7023 lub Fisher Scientific, nr kat. BP2818-500)
•
Izopropanol (Sigma, nr kat. 190764, lub Fisher Scientific, nr kat. A451-1)
•
Jałowa woda niezawierająca nukleazy (Applied Biosystems, woda o stopniu czystości odpowiednim do PCR,
nr kat. AM9937, lub Thermo Scientific, woda o stopniu czystości odpowiednim do zastosowań w biologii molekularnej,
nr kat. SH-3053801)
•
Jałowe, jednorazowe pipety serologiczne: 5 ml oraz 25 ml
•
Płytka z mikrodołkami (płytka AD) systemu cobas® 4800 i folia uszczelniająca (Roche P/N 05232724001)
•
Aplikator folii uszczelniającej cobas® 4800 (Roche P/N 04900383001)
•
Pipetory zmiennopojemnościowe* (pojemność 10 µl, 20 µl, 200 µl i 1000 µl) z końcówkami z barierą aerozolową lub
dodatniego wypierania, wolnymi od DNaz
•
Rękojeść pomocnicza do pipety (Drummond P/N: 4-000-100 lub jej odpowiednik)
•
Mikrowirówka stojąca laboratoryjna, umożliwiająca wirowanie z przyspieszeniem 8000 x g oraz od 16 000 do 20 000 x g
(Eppendorf 5417C lub jej odpowiednik)**
•
Dwa (2) suche bloki grzejne, umożliwiające ogrzewanie probówek do mikrowirówki do temperatury 56°C i 90°C**
•
Jałowe probówki do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml, niezawierające RNazy/DNazy, odpowiednie do PCR
(Eppendorf, nr kat. 022363212)
•
Spektrofotometr Nanodrop UV-Vis (Thermo Scientific ND-1000 lub ND-2000)**
•
Mieszadło wibracyjne**
•
Statywy do probówek do mikrowirówki
•
Rękawice jednorazowe bezpudrowe
•
Kalibrowane termometry do suchego bloku grzejnego**
•
Łaźnia wodna**, umożliwiająca utrzymywanie temperatury 37°C
•
Skalpel z jednostronnym ostrzem lub podobne narzędzie
•
Zamrażarka umożliwiająca przechowywanie w temperaturze od –15°C do –25°C
*
Pipetory powinny być konserwowane zgodnie z instrukcją producenta, a ich dokładność powinna mieścić się w granicach 3%
podanej objętości. W sytuacjach określonych w dokumentacji należy używać wolnych od DNaz końcówek z barierą
aerozolową lub dodatniego wypierania, aby zapobiec degradacji próbki i kontaminacji krzyżowej.
** Całe wyposażenie powinno być odpowiednio konserwowane zgodnie z instrukcjami producenta
Przyrządy i oprogramowanie
•
Analizator cobas z 480
•
Jednostka sterująca systemu cobas® 4800 SR2 z obrazem systemu Windows XP
•
Oprogramowanie systemu cobas® 4800 SR2 w wersji 2.0 lub nowsze
•
Pakiet oprogramowania do analizy genu KRAS w wersji 1.0 lub nowszy
•
Zewnętrzny czytnik kodów kreskowych, podłączany do portu USB
•
Drukarka
06322379001-03PL
8
Doc Rev. 3.0
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
UWAGA:
Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym.
A. Pobieranie próbek
Próbki FFPET raka jelita grubego oraz niedrobnokomórkowego raka płuc zostały zatwierdzone do wykorzystania w teście
cobas® KRAS Mutation Test.
B. Transport próbek
Próbki FFPET można transportować w temperaturze od 15°C do 30°C. Próbki FFPET muszą być transportowane zgodnie
z krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi przepisami dotyczącymi transportu czynników chorobotwórczych. 28
C. Przechowywanie próbek
Próbki FFPET można przechowywać w temperaturze od 15°C do 30°C przez maksymalnie 12 miesięcy od daty pobrania tkanki.
Osadzone na szkiełkach skrawki o grubości 5 mikronów można przechowywać w temperaturze od 15°C do 30°C przez
maksymalnie 60 dni.
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
UWAGA:
W teście cobas® KRAS Mutation Test można wykorzystywać wyłącznie skrawki FFPET o grubości 5 µm,
zawierające co najmniej 10% tkanki guza. Każdą próbkę zawierającą mniej niż 10% tkanki guza należy przed
usunięciem parafiny przeciąć makroskopowo.
UWAGA:
Szczegółowe wskazówki dotyczące obsługi analizatora cobas z 480 zamieszczono w instrukcji obsługi
analizatora cobas z 480.
UWAGA:
Suche bloki grzejne, umożliwiające ogrzewanie probówek do mikrowirówki, należy włączyć i nastawić na
temperaturę 56°C i 90°C.
Liczba testów w cyklu pracy
Pojedynczy przebieg testowy może obejmować od 1 do 45 próbek (plus kontrole i kalibrator) w każdej płytce z 96 mikrodołkami.
Do przeprowadzenia przebiegu testowego obejmującego więcej niż 24 próbki należy użyć kilku zestawów testu cobas® KRAS
Mutation Test z tej samej serii.
cobas® KRAS Mutation Test zawiera ilość odczynników wystarczającą do wykonania 8 przebiegów testowych po 3 próbki (plus
kontrole i kalibrator), czyli maksymalnie na 24 próbki na zestaw.
Przebieg pracy
Wykonanie testu cobas® KRAS Mutation Test obejmuje etap ręcznego przygotowywania próbek za pomocą zestawu cobas®
DNA Sample Preparation Kit, po którym następuje amplifikacja/detekcja w analizatorze cobas z 480 z zastosowaniem zestawu
cobas® KRAS Mutation Test.
Przygotowanie odczynników
1. Rozpuścić proteinazę K (PK) przez dodanie do fiolki 4,5 ml jałowej wody wolnej od nukleaz (o stopniu czystości
odpowiednim do reakcji PCR) za pomocą jałowej, jednorazowej pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Wymieszać
zawartość, odwracając fiolkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Rozdzielić jednakowe objętości po 450 µl rozpuszczonego
odczynnika PK do probówek do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze –20°C. Jeśli
proteinaza K została wcześniej rozpuszczona i zamrożona, należy przed deparafinizacją próbek rozmrozić ilość porcji
wystarczającą do przetworzenia planowanej liczby próbek (do każdej próbki potrzebne jest 70 µl rozpuszczonego
odczynnika PK).
2. Wszystkie roztwory przechowywane w temperaturze 15–30°C powinny być klarowne. Jeżeli w którymkolwiek odczynniku
obecny jest osad, ogrzać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37°C aż do rozpuszczenia się osadu. Nie wolno używać
odczynnika do czasu rozpuszczenia się całego osadu.
3. Przygotować roboczy odczynnik DNA bufor płuczący I (WB I) przez dodanie do butelki z odczynnikiem WB I 15 ml etanolu
bezwodnego. Wymieszać zawartość, odwracając butelkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano do
niej etanol i wpisać datę. Przechowywać roboczy odczynnik WB I w temperaturze od 15°C do 30°C.
06322379001-03PL
9
Doc Rev. 3.0
4. Przygotować roboczy odczynnik DNA bufor płuczący II (WB II) przez dodanie do butelki z odczynnikiem WB II 50 ml etanolu
bezwodnego. Wymieszać zawartość, odwracając butelkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano do
niej etanol i wpisać datę. Przechowywać roboczy odczynnik WB II w temperaturze od 15°C do 30°C.
Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkiełkach
UWAGA:
Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek parafiny należy
wykonywać pod wyciągiem chroniącym przed chemikaliami. Patrz rozdział „Ostrzeżenia i środki
ostrożności”.
A. Włożyć szkiełko z osadzonym skrawkiem FFPET o grubości 5 µm do pojemnika zawierającego ksylen w ilości
wystarczającej do przykrycia tkanki; pozostawić do nasiąknięcia przez 5 minut.
B. Przenieść szkiełko do pojemnika z etanolem bezwodnym w ilości wystarczającej do przykrycia tkanki; pozostawić do
nasiąknięcia przez 5 minut.
C. Wyjąć szkiełko z etanolu i odczekać, aż skrawek całkowicie wyschnie na powietrzu (od 5 do 10 minut).
D. Jeśli próbka zawiera mniej niż 10% tkanki guza, należy wykonać procedurę makroskopowego przecięcia.
E. Oznakować jedną probówkę do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml na każdą próbkę informacjami umożliwiającymi
zidentyfikowanie próbki.
F. Dodać 180 µl odczynnika DNA TLB do probówki do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml.
G. Dodać 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK do probówki Safe-Lock, zawierającej odczynnik DNA TLB.
H. Zeskrobać tkankę ze szkiełka do probówki Safe-Lock. Zanurzyć tkankę w mieszaninie odczynników DNA TLB/PK.
I.
Kontynuować postępowanie od punktu A procedury izolacji DNA.
Pozbawienie parafiny skrawków FFPET nieosadzonych na szkiełkach
UWAGA:
Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek parafiny należy
wykonywać pod wyciągiem chroniącym przed chemikaliami. Patrz rozdział „Ostrzeżenia i środki
ostrożności”.
UWAGA:
Jeśli próbka zawiera mniej niż 10% tkanki guza, należy osadzić skrawek na szkiełku w celu
makroskopowego przecięcia, a następnie postępować zgodnie z procedurą omówioną w rozdziale
„Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkiełkach”.
A. Włożyć jeden skrawek FFPET o grubości 5 mikronów do probówki do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml,
oznakowanej informacjami umożliwiającymi zidentyfikowanie każdej próbki.
B. Dodać 500 µl ksylenu do probówki Safe-Lock, zawierającej skrawek FFPET.
C. Mieszać dokładnie na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
D. Odstawić probówkę na 5 minut w temperaturze od 15°C do 30°C.
E. Dodać 500 µl etanolu bezwodnego i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
F. Odstawić probówkę na 5 minut w temperaturze od 15°C do 30°C.
G. Wirować z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant bez uszkodzenia peletki.
Wyrzucić supernatant do odpadów chemicznych.
H. Dodać 1 ml etanolu bezwodnego i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
I.
Wirować z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant bez uszkodzenia peletki.
Wyrzucić supernatant do odpadów chemicznych.
UWAGA:
Jeśli peletka unosi się w pozostałym supernatancie, ponownie wirować przez 1 minutę z przyspieszeniem
od 16 000 x g do 20 000 x g. Usunąć pozostały supernatant.
06322379001-03PL
10
Doc Rev. 3.0
J.
Suszyć peletkę tkanki w otwartej probówce przez 10 minut w bloku grzejnym o temperaturze 56°C.
UWAGA:
Przed przejściem do następnego etapu należy upewnić się, że etanol został całkowicie odparowany
i peletka jest sucha.
UWAGA:
W razie potrzeby suche peletki można przechowywać do 24 godzin w temperaturze od 2°C do 8°C.
K. Wytworzyć z peletki tkanki ponownie zawiesinę w 180 µl odczynnika DNA bufor do lizy tkanek (DNA TLB).
L. Dodać 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK.
M. Kontynuować postępowanie od punktu A procedury izolacji DNA.
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Procedura izolacji DNA
UWAGA:
Jednocześnie z próbką(-ami) należy przeprowadzić przetwarzanie kontroli ujemnej. Przygotować kontrolę
ujemną przez połączenie 180 µl odczynnika DNA Bufor do lizy tkanki (DNA TLB) oraz 70 µl roztworu PK
w probówce do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml, oznakowanej napisem NEG CT. Przetwarzanie
kontroli ujemnej powinno przebiegać według takiej samej procedury, jak przetwarzanie próbek.
A. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 30 sekund probówki zawierające mieszaninę próbka/DNA TLB/PK i mieszaninę
kontroli ujemnej (NEG CT).
UWAGA:
Tkanka musi być całkowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK.
B. Umieścić probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 56°C i inkubować przez 60 minut.
C. Mieszać probówki na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
UWAGA:
Tkanka musi być całkowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK.
D. Umieścić probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 90°C i inkubować przez 60 minut.
UWAGA:
Podczas inkubacji należy przygotować wymaganą liczbę probówek z filtrem (FT) z zawiasowymi zatyczkami,
umieszczając każdą FT na probówce zbiorczej (CT) i oznakowując zatyczkę każdej FT odpowiednimi
informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę.
UWAGA:
Na każdą próbkę będą potrzebne: 1 FT, 3 CT i 1 probówka do elucji (probówka do mikrowirówki
o pojemności 1,5 ml).
UWAGA:
Podczas inkubacji należy oznakować wymaganą liczbę probówek do elucji (probówek do mikrowirówki
o pojemności 1,5 ml) odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę.
E. Pozostawić probówki do schłodzenia do temperatury od 15°C do 30°C. Po schłodzeniu odwirować pulsacyjnie, aby
zgromadzić płyn z zatyczek.
F. Dodać do każdej probówki po 200 µl odczynnika DNA PBB i wymieszać zawartość przez trzykrotne pobranie mieszaniny
pipetą i jej wypuszczenie.
G. Inkubować probówki w temperaturze od 15°C do 30°C przez 10 minut.
H. Dodać do każdej probówki 100 µl izopropanolu i 3 razy wymieszać lizat przez nabieranie pipetą i wypuszczanie.
I.
Przenieść każdy lizat do właściwie oznakowanej jednostki FT/CT.
J.
Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę.
K. Umieścić każdą FT na nowej CT. Wyrzucić zawartość ze starej CT do odpadów chemicznych i usunąć w odpowiedni sposób
zużytą CT.
L. Dodać po 500 µl roboczego odczynnika WB I do każdej FT.
06322379001-03PL
11
Doc Rev. 3.0
UWAGA:
Przygotowanie roboczego odczynnika WB I opisano w rozdziale „Przygotowanie odczynników”.
M. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę.
N. Wyrzucić zawartość każdej CT do odpadów chemicznych. Umieścić FT z powrotem na tej samej CT.
O. Dodać po 500 µl roboczego odczynnika WB II do każdej FT.
UWAGA:
Przygotowanie roboczego odczynnika WB II opisano w rozdziale „Przygotowanie odczynników”.
P. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę.
Q. Umieścić każdą FT na nowej CT. Wyrzucić zawartość ze starej CT do odpadów chemicznych i usunąć w odpowiedni sposób
zużytą CT.
R. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem od 16 000 do 20 000 x g przez 1 minutę, aby osuszyć membrany filtrów.
S. Umieścić każdą FT w probówce do elucji (probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml), oznakowanej uprzednio
informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę. Wyrzucić zawartość ze starej CT do odpadów chemicznych i usunąć
w odpowiedni sposób zużytą CT.
T. Dodać po 100 µl odczynnika DNA EB na środek membrany każdej FT bez dotykania membrany FT.
U. Inkubować FT z probówką do elucji w temperaturze od 15°C do 30°C przez 5 minut.
V. Wirować FT z probówką do elucji z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę, aby zebrać eluat do probówki do elucji.
Usunąć w odpowiedni sposób zużytą FT.
W. Zamknąć zatyczkę na probówce do elucji. Probówka do elucji zawiera roztwór podstawowy DNA. Przejść do punktu A
w rozdziale Ocena ilościowa stężenia DNA.
UWAGA:
Pomiar stężenia DNA należy przeprowadzać natychmiast po zakończeniu procedury izolacji DNA i przed
odłożeniem materiału do przechowywania.
Ocena ilościowa stężenia DNA:
A. Wymieszać każdy roztwór podstawowy DNA na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund.
B. Przeprowadzić ocenę ilościową stężenia DNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop UV-Vis (ND-1000 lub ND-2000)
zgodnie z protokołem postępowania, podanym przez producenta urządzenia. Do wyzerowania urządzenia użyć odczynnika
DNA EB. Należy obliczyć średnią z dwóch zgodnych odczytów. Wyniki dwóch pomiarów powinny mieścić się w granicach
± 10% każdego z nich przy odczytach stężenia DNA ≥ 20,0 ng/µl. W przypadku odczytów stężenia DNA < 20,0 ng/µl wyniki
dwóch pomiarów powinny mieścić się w granicach ± 2 ng/µl. Jeżeli wyniki dwóch pomiarów nie mieszczą się w granicach
± 10% każdego z nich przy odczytach stężenia DNA ≥20,0 ng/µl lub w granicach ± 2 ng/µl przy odczytach stężenia DNA
< 20,0 ng/µl, należy uzyskać dodatkowe 2 odczyty, aby wymogi badania zostały spełnione. Wówczas należy obliczyć
średnią z dwóch nowych wyników pomiarów.
UWAGA:
Nie ma potrzeby wykonywania pomiarów w przypadku roztworu podstawowego DNA, pochodzącego
z przetworzonej kontroli ujemnej (NEG CT).
C. Stężenie roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbek, musi być ≥4 ng/µl, aby można było wykonać cobas®
KRAS Mutation Test. Każdą próbkę poddaje się dwukrotnej amplifikacji/detekcji z użyciem w każdej amplifikacji/detekcji
25 µl rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl (co daje ogółem 50 ng DNA).
UWAGA:
Aby można było przeprowadzić cobas® KRAS Mutation Test, każdy roztwór podstawowy DNA musi mieć
minimalne stężenie 4 ng/µl. Jeżeli stężenie roztworu podstawowego DNA jest < 4 ng/µl, należy powtórzyć
procedury: pozbawiania próbek parafiny, izolacji DNA i oceny ilościowej stężenia DNA z użyciem dwóch
skrawków FFPET tej próbki o grubości 5 µm. W przypadku próbek osadzonych na szkiełkach po
pozbawieniu ich parafiny należy połączyć tkankę z obu skrawków w jednej probówce, zanurzyć tkankę
w odczynnikach DNA TLB + PK i przeprowadzić izolację oraz ocenę ilościową stężenia DNA w sposób
opisany powyżej. W przypadku próbek nieosadzonych na szkiełkach należy połączyć oba skrawki w jednej
probówce i zanurzyć tkankę w odczynnikach DNA TLB + PK, po czym przeprowadzić izolację oraz ocenę
ilościową stężenia DNA w sposób opisany powyżej. Jeżeli stężenie roztworu podstawowego DNA nadal jest
niższe od 4 ng/µl, należy poprosić o przysłanie kolejnej próbki FFPET.
UWAGA:
Roztwór podstawowy DNA (przetworzoną próbkę i kontrolę ujemną) przechowuje się w temperaturze 2–8°C
przez maksymalnie 2 tygodnie albo w temperaturze –20°C przez 60 dni.
06322379001-03PL
12
Doc Rev. 3.0
AMPLIFIKACJA I DETEKCJA
UWAGA:
Aby zapobiec kontaminacji roboczego odczynnika MMX próbkami DNA, należy przeprowadzać amplifikację
i detekcję w miejscu oddzielonym od obszaru wykonywania izolacji DNA. Przed przygotowaniem roboczego
MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy amplifikacji i detekcji. W celu właściwego oczyszczenia
należy dokładnie przetrzeć wszystkie powierzchnie, włącznie ze statywami i pipetorami, 0,5% roztworem
podchlorynu sodu, a następnie 70% roztworem etanolu. Dostępny w handlu płynny wybielacz przeznaczony
do zastosowań domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego
wybielacza w stosunku 1:10 pozwoli uzyskać 0,5-procentowy roztwór podchlorynu sodu.
Konfiguracja urządzenia:
Szczegółowe wskazówki dotyczące konfigurowania analizatora cobas z 480 zamieszczono w instrukcji obsługi analizatora
cobas z 480.
Konfiguracja zlecenia testu:
Szczegółowe instrukcje dotyczące etapów przebiegu pracy podczas wykonywania badań genu kodującego KRAS zamieszczono
w podręczniku użytkownika systemu cobas® 4800 w części dotyczącej testu cobas® KRAS Mutation Test (Podręcznik
użytkownika testu cobas® KRAS).
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbki:
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA w przypadku stężeń od 4 ng/µl do 28 ng/µl
UWAGA:
Roztwory podstawowe DNA, pochodzące z próbek, należy rozcieńczać bezpośrednio przed amplifikacją
i detekcją.
UWAGA:
Każdą próbkę poddaje się dwukrotnej (2 x) amplifikacji/detekcji, co wymaga objętości rozcieńczonego
roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl wynoszącej ogółem 50 µl (po 25 µl na każdą z reakcji dla
kodonu 12/13 oraz kodonu 61) (ogółem 100 ng DNA).
A. Obliczyć dla każdej próbki potrzebną objętość (µl) roztworu podstawowego DNA:
ilość µl roztworu podstawowego DNA = (70 µl x 2 ng/µl) ÷ stężenie roztworu podstawowego DNA [ng/µl]
B. Obliczyć dla każdej próbki potrzebną objętość (µl) odczynnika DNA Rozcieńczalnik próbki (DNA SD):
ilość µl odczynnika DNA SD = 70 µl – ilość µl roztworu podstawowego DNA
Przykład:
stężenie roztworu podstawowego DNA = 6,5 ng/µl
A. ilość µl roztworu podstawowego DNA = (70 µl x 2 ng/µl) ÷ 6,5 ng/µl = 21,5 µl
B. ilość µl odczynnika DNA SD = (70 µl – 21,5 µl) = 48,5 µl
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA w przypadku stężeń > 28 ng/µl
UWAGA:
Roztwory podstawowe DNA, pochodzące z próbek, należy rozcieńczać bezpośrednio przed amplifikacją
i detekcją.
UWAGA:
Każdą próbkę poddaje się dwukrotnej (2 x) amplifikacji/detekcji, co wymaga objętości rozcieńczonego
roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl wynoszącej ogółem 50 µl (po 25 µl na każdą z reakcji dla
kodonu 12/13 oraz kodonu 61) (ogółem 100 ng DNA).
A. W przypadku stężeń roztworu podstawowego DNA > 28 ng/µl do obliczania ilości odczynnika DNA Rozcieńczalnik próbki
(DNA SD), wymaganej do przygotowania co najmniej 70 µl rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA, należy użyć
zamieszczonego poniżej wzoru. Ma to na celu zapewnienie, że do badania każdej próbki zostanie użyta objętość co
najmniej 5 µl roztworu podstawowego DNA.
B. Obliczyć dla każdej próbki objętość (µl) odczynnika DNA SD, potrzebną do rozcieńczenia 5 µl roztworu podstawowego DNA
do stężenia 2 ng/µl:
wymagana obj. DNA SD w µl = [(5 µl roztworu podstawowego DNA x stężenie roztworu podstawowego DNA w ng/µl) / 2 ng/µl] – 5 µl
06322379001-03PL
13
Doc Rev. 3.0
Przykład:
stężenie roztworu podstawowego DNA = 31,7 ng/µl
A.
Wymagana obj. DNA SD w µl = [(5 µl x 31,7 ng/µl) / 2 ng/µl] – 5 µl = 74,3 µl
B.
Użyć obliczonej objętości odczynnika DNA SD do rozcieńczenia 5 µl roztworu podstawowego DNA.
Rozcieńczanie próbki
UWAGA:
Przed rozcieńczeniem DNA należy wyjąć rozcieńczalnik do próbek (DNA SD) z miejsca przechowywania
w temperaturze od –15°C do –25°C i rozmrażać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze od 15°C do 30°C.
Przed użyciem każdego odczynnika mieszać go przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym, po czym
zgromadzić płyn na dnie probówki.
A. Przygotować stosowną liczbę probówek do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml na rozcieńczenia DNA,
oznakowując je odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę.
B. Używając pipetora z końcówką zabezpieczoną przed powstawaniem aerozolu, przenieść pipetą obliczone objętości
odczynnika DNA SD do odpowiednio oznakowanych probówek. Przenieść pipetą 35 µl odczynnika DNA SD do probówki
Safe-Lock, oznakowanej napisem NEG CT.
C. Mieszać każdy roztwór podstawowy DNA i kontrolę ujemną na mieszadle wibracyjnym od 5 do 10 sekund.
D. Używając pipetora z końcówką zabezpieczoną przed powstawaniem aerozolu (nowa końcówka do przenoszenia każdej
próbki), delikatnie przenieść pipetą obliczoną objętość każdego roztworu podstawowego DNA do odpowiedniej probówki
zawierającej odczynnik DNA SD. Przenieść pipetą 35 µl kontroli ujemnej (wyizolowanego eluatu) do probówki z napisem
NEG CT.
E. Zamknąć probówki zatyczkami i mieszać zawartość każdej z nich na mieszadle wibracyjnym od 5 do 10 sekund.
F. Zmienić rękawiczki.
Przygotowanie roboczych odczynników Master Mix (MMX 12/13 oraz MMX 61)
UWAGA:
Odczynniki KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM oraz roboczy odczynnik MMX są wrażliwe na światło i należy je
chronić przed długotrwałą ekspozycją na światło.
UWAGA:
Ze względu na lepkość odczynników KRAS MIX oraz roboczego odczynnika MMX przenoszenie pipetą
należy wykonywać powoli, aby zagwarantować podanie z końcówki całej objętości mieszaniny.
UWAGA:
Odczynniki KRAS MIX, KRAS 12/13 OM oraz KRAS 61 OM mogą mieć barwę od przezroczystej do żółtej. Nie
wpływa to na działanie odczynnika.
Przygotować w oddzielnych probówkach do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml dwie większe porcje odczynników
potrzebnych do sporządzenia roboczych odczynników MMX — jedną z odczynnikiem KRAS 12/13 OM i drugą zawierającą
odczynnik KRAS 61 OM.
A. Obliczyć objętość odczynnika KRAS MIX, wymaganą do sporządzenia każdego z odczynników roboczych MMX, według
następującego wzoru:
wymagana objętość odczynnika KRAS MIX = (liczba próbek + 2 kontrole + 1 kalibrator + 1) x 10 µl
B. Obliczyć objętość odczynnika KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM, wymaganą do sporządzenia każdego z odczynników
roboczych MMX, według następującego wzoru:
wymagana objętość odczynnika KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM = (liczba próbek + 2 kontrole + 1 kalibrator + 1) x 10 µl
C. Obliczyć objętość odczynnika MGAC, wymaganą do sporządzenia każdego z odczynników roboczych MMX, według
następującego wzoru:
wymagana objętość odczynnika MGAC = (liczba próbek + 2 kontrole + 1 kalibrator + 1) x 6 µl
Posługując się tabelą 1, określić objętość każdego odczynnika, potrzebną do przygotowania roboczego odczynnika MMX, na
podstawie liczby próbek włączonych do przebiegu testowego.
06322379001-03PL
14
Doc Rev. 3.0
Tabela 1
Objętości odczynników potrzebne do sporządzenia roboczego odczynnika MMX 12/13 i roboczego odczynnika MMX 61
Objętości odczynników potrzebne do przygotowania odczynnika roboczego MMX
Liczba próbek*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
KRAS MIX
10 µl
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM
10 µl
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
MGAC
6 µl
30
36
42
48
54
60
66
72
78
84
130
156
182
208
234
260
286
312
338
364
Całkowita objętość (μl)
* Zawiera objętość wystarczającą na 1 probówkę na próbkę, 2 probówki z materiałem kontrolnym, 1 probówkę z kalibratorem i 1 nadprogramową probówkę
D. Wyjąć odpowiednią liczbę fiolek z odczynnikami KRAS MIX, KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM i MGAC z miejsca, w którym
były przechowywane w temperaturze od –15°C do –25°C. Przed użyciem wszystkie odczynniki należy pozostawić do
rozmrożenia na co najmniej 1 godzinę w temperaturze od 15°C do 30°C. Przed użyciem każdego odczynnika mieszać go
przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym, po czym zgromadzić płyn na dnie probówki. Oznakować jałową probówkę do
mikrowirówki, przeznaczoną na roboczy odczynnik MMX 12/13 i roboczy odczynnik MMX 61.
UWAGA:
Robocze odczynniki MMX należy przygotować w ciągu 1 godziny od rozmrożenia odczynników. Po
rozmrożeniu jakiekolwiek pozostałości niewykorzystanych odczynników należy w ciągu 1 godziny od
użycia ponownie umieścić w miejscu przechowywania w temperaturze od –15°C do –25°C.
E. Dodać obliczoną objętość odczynnika KRAS MIX do probówek przeznaczonych na robocze odczynniki MMX.
F. Dodać obliczoną objętość odczynnika KRAS 12/13 OM lub KRAS 61 OM do odpowiedniej probówki przeznaczonej na
odczynnik MMX.
G. Dodać obliczoną objętość odczynnika MGAC do probówek przeznaczonych na robocze odczynniki MMX.
H. Mieszać zawartość probówek na mieszadle wibracyjnym od 3 do 5 sekund, aby zapewnić dostateczne wymieszanie
odczynnika.
UWAGA:
Próbki, kontrole i kalibratory należy dodać do płytki z mikrodołkami (płytki AD) w ciągu 1 godziny od
przygotowania roboczych odczynników MMX.
UWAGA:
Należy używać wyłącznie płytki z mikrodołkami (płytki AD) systemu cobas® 4800 oraz odpowiedniej folii
uszczelniającej (Roche P/N 05232724001).
Rysunek 1
Rozmieszczenie próbek na płytce
Rozmieszczenie próbek na płytce
1
2
3
4
5
6
7
8
KRAS MC
12/13
KRAS MC
61
Próbka 6
12/13
Próbka 6
61
Próbka 14
12/13
Próbka 14
61
Próbka 22
12/13
Próbka 22
61
CTL
B NEG
12/13
NEG CTL
61
Próbka 7
12/13
Próbka 7
61
Próbka 15
12/13
Próbka 15
61
Próbka 23
12/13
Próbka 23
61
Próbka 24
12/13
Próbka 24
61
A
C
KRAS CAL
12/13
KRAS CAL
61
Próbka 8
12/13
Próbka 8
61
Próbka 16
12/13
Próbka 16
61
D
Próbka 1
12/13
Próbka 1
61
Próbka 9
12/13
Próbka 9
61
Próbka 17
12/13
Próbka 17
61
E
Próbka 2
12/13
Próbka 2
61
Próbka 10
12/13
Próbka 10
61
Próbka 18
12/13
Próbka 18
61
F
Próbka 3
12/13
Próbka 3
61
Próbka 11
12/13
Próbka 11
61
Próbka 19
12/13
Próbka 19
61
G
Próbka 4
12/13
Próbka 4
61
Próbka 12
12/13
Próbka 12
61
Próbka 20
12/13
Próbka 20
61
H
Próbka 5
12/13
Próbka 5
61
Próbka 13
12/13
Próbka 13 Próbka 21
61
12/13
Próbka 21
61
06322379001-03PL
15
9
10
11
12
Doc Rev. 3.0
A. Przenieść pipetą 25 µl roboczego odczynnika MMX do każdego dołka reakcyjnego płytki z mikrodołkami (płytki AD),
potrzebnego do przeprowadzenia przebiegu testowego. Nie dopuścić do tego, aby końcówka pipetora dotknęła płytki poza
obrębem dołka.
•
Dodać roboczy odczynnik MMX 12/13 (zawierający odczynnik KRAS 12/13 OM) do dołków płytki z mikrodołkami
(płytki AD) w kolumnach nieparzystych (1, 3, 5 itd.).
•
Dodać roboczy odczynnik MMX 61 (zawierający odczynnik KRAS 61 OM) do dołków płytki z mikrodołkami
(płytki AD) w kolumnach parzystych (2, 4, 6 itd.).
B. Przenieść pipetą 25 µl odczynnika KRAS MC do dołków A1 oraz A2 płytki z mikrodołkami (płytki AD); dokładnie wymieszać,
aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka.
C. Używając nowej końcówki pipetora, przenieść 25 µl odczynnika NEG CT do dołków B1 i B2 płytki z mikrodołkami (płytki AD);
dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka.
D. Używając nowej końcówki pipetora, przenieść 25 µl odczynnika KRAS CAL do dołków C1 i C2 płytki z mikrodołkami
(płytki AD); dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obrębie
danego dołka.
UWAGA:
Każdy przebieg testowy musi zawierać kontrolę dodatnią (odczynnik KRAS MC) w dołkach A1 i A2, kontrolę
ujemną (odczynnik NEG CT) w dołkach B1 i B2 oraz kalibrator (odczynnik KRAS CAL) w dołkach C1 i C2;
w przeciwnym razie przebieg testowy zostanie uznany za nieważny.
UWAGA:
Należy zmieniać rękawice zgodnie z potrzebami, aby chronić próbki przed wzajemną kontaminacją
zawartym w nich materiałem oraz chronić probówki do reakcji PCR przed kontaminacją na ich
zewnętrznych powierzchniach.
E. Używając nowych końcówek pipetora do każdej rozcieńczonej próbki DNA, dodać 25 µl pierwszej próbki DNA do dołków D1
oraz D2 płytki z mikrodołkami (płytki AD); dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co
najmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka. Powtórzyć tę procedurę z rozcieńczonym roztworem DNA z drugiej próbki
(dołki E1 oraz E2). Postępować według szablonu przedstawionego na rysunku 1, dopóki rozcieńczone roztwory DNA ze
wszystkich próbek nie zostaną umieszczone na płytce z mikrodołkami (płytce AD). Upewnić się, że cały płyn zebrał się na
dnie dołków.
F. Przykryć płytkę z mikrodołkami (płytkę AD) folią uszczelniającą (dostarczoną wraz z płytkami). Użyć aplikatora folii
uszczelniającej do szczelnego przytwierdzenia folii do płytki z mikrodołkami (płytki AD).
G. Przed rozpoczęciem reakcji PCR potwierdzić, że cały płyn zebrał się na dnie każdego z dołków.
UWAGA:
Amplifikacja i detekcja powinny rozpocząć się w ciągu 1 godziny od dodania rozcieńczonego roztworu DNA
z pierwszej próbki do roboczego odczynnika MMX.
Rozpoczęcie reakcji PCR
Szczegółowe instrukcje dotyczące etapów przebiegu pracy podczas wykonywania badań genu kodującego KRAS zamieszczono
w podręczniku użytkownika testu mutacji cobas® KRAS.
06322379001-03PL
16
Doc Rev. 3.0
INTERPRETACJA WYNIKÓW
UWAGA:
Cały przebieg testowy i walidację próbek przeprowadza oprogramowanie cobas® 4800.
UWAGA:
Ważny przebieg testowy może obejmować zarówno ważne, jak i nieważne wyniki badania próbek.
W przypadku ważnego przebiegu testowego wyniki badania próbek interpretuje się w sposób przedstawiony w tabeli 2.
Tabela 2
Interpretacja wyniku testu cobas® KRAS Mutation Test
Wynik testu
Wynik badania mutacji
Interpretacja
Mutation
Detected
Kodon 12/13 lub kodon 61
(mogą być obecne obie mutacje)
Wykryto mutację w kodonie 12/13 lub 61 genu KRAS
bądź w obu.
Mutation Not
Detected*
Nie dotyczy
Nie wykryto mutacji genu KRAS w kodonie 12/13 oraz
61.
Invalid
Nie dotyczy
Wynik badania próbki jest nieważny. Powtórzyć test
próbek z nieważnymi wynikami, postępując zgodnie
z instrukcją przedstawioną poniżej w rozdziale
Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami.
Failed
Nie dotyczy
Przebieg testowy nie powiódł się wskutek awarii
sprzętu lub oprogramowania. Skontaktować się
z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania
pomocy technicznej.
* A Wynik „Mutation Not Detected” nie wyklucza obecności mutacji w kodonach 12/13 lub 61 genu KRAS, ponieważ wyniki
zależą od odsetka zmutowanych sekwencji, dostatecznej integralności próbki, braku inhibitorów i wystarczającej do wykrycia
ilości DNA.
Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami
A. Powtórzyć rozcieńczanie roztworu podstawowego DNA z próbki, która dała wynik nieważny, rozpoczynając od procedur:
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbki i Rozcieńczanie próbki, opisanych
w rozdziale AMPLIFIKACJA I DETEKCJA.
B. Po rozcieńczeniu roztworu podstawowego DNA do stężenia 2 ng/µl, co opisano w rozdziale „Rozcieńczanie próbki”,
kontynuować wykonywanie czynności opisanych w rozdziale „Przygotowanie odczynników roboczych Master Mix (MMX
12/13 i MMX 61)” oraz pozostałych czynności należących do procedury amplifikacji i detekcji.
UWAGA:
Jeżeli po ponownym przeprowadzeniu testu wynik badania próbki nadal jest nieważny lub jeśli nie było
dostatecznej ilości roztworu podstawowego DNA do przygotowania kolejnego rozcieńczenia zgodnie
z opisem w punkcie A rozdziału Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami, należy powtórzyć całą
procedurę testu dla tej próbki od etapu pozbawienia parafiny i izolacji DNA, używając nowego skrawka
FFPET o grubości 5 mikronów.
KONTROLA JAKOŚCI
W każdym przebiegu uwzględniany jest jeden zestaw kontroli mutacji testu cobas® KRAS(KRAS MC), kontroli ujemnej (NEG CT)
oraz kalibratora KRAS (KRAS CAL) dla odczynnika roboczego MMX 12/13 oraz odczynnika roboczego MMX 61. Przebieg jest
ważny, jeśli wyniki uzyskane w studzienkach z kontrolą mutacji KRAS (KRAS MC) (A1 oraz A2), kontrolą ujemną (NEG CT) (B1
oraz B2) i kalibratorem KRAS (KRAS CAL) (C1 oraz C2) są ważne. Jeśli wyniki oznaczeń kontroli mutacji KRAS (KRAS MC),
kontroli ujemnej (NEG CT) lub kalibratora KRAS (KRAS CAL) dla odczynników roboczych MMX 12/13 lub MMX 61 są nieważne,
cały przebieg testowy jest nieważny i trzeba go powtórzyć. Należy wówczas przygotować świeże rozcieńczenie roztworu
podstawowego DNA, wyizolowanego uprzednio z próbki, aby skonfigurować nową płytkę z mikrodołkami (płytkę AD) wraz
z kontrolami w celu przeprowadzenia amplifikacji i detekcji.
Kontrola dodatnia
Oznaczenie kontroli mutacji KRAS (KRAS MC) musi dać wynik „Valid” dla obu odczynników roboczych MMX 12/13 i MMX 61.
Jeżeli wyniki oznaczenia KRAS MC stale są nieważne, należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche w celu
uzyskania pomocy technicznej.
06322379001-03PL
17
Doc Rev. 3.0
Kontrola ujemna
Oznaczenie kontroli ujemnej (NEG CT) musi dać wynik „Valid” dla obu odczynników roboczych MMX 12/13 i MMX 61. Jeżeli
wyniki oznaczenia NEG CT stale są nieważne, należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania
pomocy technicznej.
Kalibrator
Oznaczenie kalibratora KRAS (KRAS CAL) musi dać wynik „Valid” dla obu odczynników roboczych MMX 12/13 i MMX 61.
Jeżeli wyniki oznaczenia KRAS CAL stale są nieważne, należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche w celu
uzyskania pomocy technicznej.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie
zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu należy zachować wyjątkową
ostrożność, używając odczynników oraz mieszanin do amplifikacji, aby zapobiec ich kontaminacji.
OGRANICZENIA METODY
1. Do badań należy używać tylko określonych rodzajów próbek. Test cobas® KRAS Mutation Test został zatwierdzony
wyłącznie do badania próbek FFPET raka jelita grubego i niedrobnokomórkowego raka płuc.
2. cobas® KRAS Mutation Test został zatwierdzony do użytku wyłącznie z zestawem do przygotowywania próbek cobas®
DNA Sample Preparation Kit (Roche P/N: 05985536190).
3. Detekcja mutacji zależy od liczby kopii obecnych w próbce, na którą wpływać może integralność próbki, ilość wyizolowanego
DNA i obecność substancji zakłócających detekcję.
4. Wiarygodność wyników zależy od dostatecznego utrwalenia próbki, jej transportu, przechowywania i przetwarzania. Należy
przestrzegać procedur opisanych w niniejszej ulotce dołączonej do opakowania testu oraz w podręczniku użytkownika testu
mutacji cobas® KRAS.
5. Dodanie do odczynnika Master Mix testu cobas® KRAS Mutation Test enzymu AmpErase umożliwia selektywną
amplifikację docelowego DNA; jednak dla uniknięcia kontaminacji odczynników konieczne jest stosowanie dobrej praktyki
laboratoryjnej i dokładne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w niniejszej ulotce dołączonej do opakowania testu.
6. Tego produktu mogą używać wyłącznie osoby przeszkolone w zakresie technik PCR i używania systemu cobas® 4800.
7. Do użycia z tym produktem został zatwierdzony wyłącznie analizator cobas z 480. Z tym produktem nie wolno używać
żadnego innego termocyklera z systemem optycznym do detekcji w czasie rzeczywistym.
8. Z uwagi na nieodłączne różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod użytkownik
przeprowadził w laboratorium badanie korelacji wykorzystywanych technik w celu określenia różnic występujących pomiędzy
nimi.
9. Wpływ innych możliwych zmiennych, takich jak te związane z utrwaleniem próbki, nie został zbadany.
10. Mutacje w obrębie regionów genomowego DNA tworzącego gen KRAS, z którymi wiążą się primery i/lub sondy używane
w teście cobas® KRAS Mutation Test, chociaż rzadkie, mogą spowodować niewykrycie obecności mutacji.
11. Obecność inhibitorów PCR może prowadzić do uzyskiwania wyników fałszywie ujemnych lub nieważnych.
12. Chociaż zdarza się to rzadko (< 0,2%29), w przypadku niektórych mutacji złożonych i wielokrotnych w kodonie 12/13 i 61
cobas® KRAS Mutation Test daje wyniki „Mutation Not Detected”, a także ograniczoną reaktywność krzyżową (wyniki
„Mutation Detected”) w przypadkach mutacji otaczających kodon 12/13 w eksonie 2 i kodon 61 w eksonie 3.
13. Test cobas® KRAS Mutation Test został zatwierdzony do zastosowania z DNA w ilości 50 ng w każdym dołku reakcyjnym.
Nie zaleca się stosowania początkowych ilości DNA na poziomie niższym niż 50 ng w każdym dołku reakcyjnym.
14. W celu wykrycia w tle DNA z naturalnie występującymi sekwencjami ≥5% zmutowanych sekwencji genu KRAS29
obejmujących mutacje przedstawione w tabeli 3 należy postępować zgodnie z procedurą opisaną powyżej.
06322379001-03PL
18
Doc Rev. 3.0
Tabela 3
Mutacje wykryte przez test cobas® KRAS Mutation Test
Mutacja
Zmiana aminokwasu
Identyfikator COSMIC
c.34G>T
12C
516
c.34G>A
12S
517
c.34G>C
12R*
518
c.35G>T
12V
520
c.35G>A
12D
521
c.35G>C
12A
522
c.37G>T
13C
527
c.37G>A
13S
528
c.37G>C
13R*
529
c.38G>A
13D
532
c.38G>C
13A
533
c.38G>T
13V
534
c.181C>A
61K*
549
c.181C>G
61E
550
c.182A>C
61P
551
c.182A>G
61R
552
c.182A>T
61L
553
c.183A>C
61H (CAC)
554
c.183A>T
61H (CAT)
555
* Nie przebadano w odniesieniu do próbek FFPET NSCLC.
Czcionka pogrubiona = przebadano w odniesieniu do plazmidów
OCENA DZIAŁANIA W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
Ocena skuteczności w badaniach nieklinicznych w przypadku tkanek raka jelita grubego
Czułość analityczna
Badanie czułości analitycznej testu cobas® KRAS Mutation Test zostało przeprowadzone z zastosowaniem paneli rozcieńczeń
przygotowanych z czterech rodzajów próbek:
•
Mieszanina linii komórkowych przygotowana przez zmieszanie roztworów podstawowych DNA uzyskanych z linii
komórkowej z mutacją KRAS oraz linii komórkowej z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS.
•
Mieszanina plazmidów przygotowana przez wymieszanie plazmidów z mutacją KRAS oraz roztworów podstawowych DNA
uzyskanych z linii komórkowej z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS.
•
Mieszaniny próbek przygotowane przez zmieszanie roztworów podstawowych DNA otrzymanych z próbek FFPET
z mutacją KRAS oraz próbek FFPET z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS.
•
Roztwór podstawowy DNA uzyskany z pojedynczej próbki FFPET.
Wszystkie próbki wykorzystane w tym badaniu zostały poddane procesowi oznaczenia sekwencji na drodze sekwencjonowania
z użyciem sekwenatora 454 Genome Sequencer FLX Titanium (sekwencjonowanie metodą 454) w celu określenia udziału
procentowego mutacji w każdej z próbek.
06322379001-03PL
19
Doc Rev. 3.0
Czułość analityczna testu cobas® KRAS Mutation Test badana z użyciem mieszanin plazmidowych lub pochodzących
z linii komórkowych
DNA z linii komórkowych raka jelita grubego, zawierających mutację KRAS w kodonie 12 lub 13 eksonu 2, wyizolowano
i wymieszano z izolatami DNA uzyskanymi z linii komórkowych z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS w celu
osiągnięcia próbki zawierającej ok. 5% mutacji, co zweryfikowano na drodze sekwencjonowania metodą 454. Trzy oddzielne
panele rozcieńczeń obejmowały następujące rozcieńczenia (50,0; 25,0; 12,5; 6,3; 3,1; 1,6; 0,8 oraz 0,4 ng/25 µl).
Z zastosowaniem każdej z 3 serii zestawu cobas® KRAS Mutation Test zbadano dwadzieścia cztery (24) powtórzenia każdego
elementu panelu (w sumie 72 powtórzenia). Czułość określono na podstawie najmniejszej ilości DNA, która dała odsetek
wyników „Mutation Detected”, dotyczących mutacji KRAS, wynoszący co najmniej 95%, co pokazano w tabeli 4.
Tabela 4
Czułość testu cobas® KRAS Mutation Test badana z użyciem mieszanin plazmidowych
lub pochodzących z linii komórkowych CRC
Odsetek
procentowy
mutacji*
Ilość DNA w elemencie panelu (ng/25 µl)
konieczna do uzyskania odsetka ≥ 95% wyników
„Mutation Detected” (N = 72 powtórzenia)
Mieszanina linii
komórkowych
5,3%
0,8
Kodon 13
(Ekson 2)
Mieszanina linii
komórkowych
4,9%
1,6
Kodon 61
(Ekson 3)
Mieszanina
plazmidowa
5,8%
6,3
Mutacja KRAS
Typ próbki
Kodon 12
(Ekson 2)
* Średni udział procentowy mutacji na podstawie sekwencjonowania metodą 454
Test dał 95% wyników „Mutation Detected” przy stężeniu 0,8 ng/25 µl, 1,6 ng/25 µl oraz 6,3 ng/25 µl (rozcieńczenia 1:64, 1:32
oraz 1:8 zalecanej wyjściowej ilości DNA wynoszącej 50 ng/25 µl) odpowiednio w przypadku kodonu 12, 13 i 61 genu KRAS.
Może to wskazywać, że test wykryje mutację KRAS w przypadku degradacji lub niemożności amplifikacji ok. 87% DNA na
skutek procesu utrwalenia, przy założeniu, że DNA mieszanin linii komórkowych i plazmidowych zawierał w 100% nienaruszony
i nadający się do amplifikacji DNA.
Czułość analityczna badana z użyciem próbek FFPET i mieszanin pochodzących z próbek
DNA wyizolowane z próbek FFPET obarczonych mutacją genu KRAS w kodonie 12, 13 i 61 wymieszano z izolatami z próbek
FFPET z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS w celu osiągnięcia próbek o poziomie mutacji ok. 5%. Do
przeprowadzenia testu mutacji w kodonie 12 genu KRAS wykorzystano jedną naturalnie występująca próbkę. Końcowe poziomy
mutacji dla wszystkich próbek zostały ocenione z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454. Każda z próbek/mieszanin
próbek została rozcieńczona w celu uzyskania elementów panelu (50,0; 25,0; 12,5; 6,3; 3,1; 1,6; 0,8 oraz 0,4 ng/25 µl). Element
panelu 50 ng/25 µl nie został przebadany dla mieszaniny nr 2 pod kątem mutacji kodonu 61 w eksonie 3.
Wykonano osiem (8) powtórzeń każdego elementu panelu z użyciem każdej z 3 serii zestawu cobas® KRAS Mutation Test
(n = 24/element panelu). Czułość każdej próbki określono na podstawie najmniejszej ilości DNA, która dała odsetek wyników
„Mutation Detected”, dotyczących mutacji KRAS, wynoszący co najmniej 95%, co pokazano w tabeli 5.
Tabela 5
Czułość testu cobas® KRAS Mutation Test badana z użyciem próbki CRC i mieszanin pochodzących z próbek
Mutacja KRAS
Kodon 12
(Ekson 2)
Kodon 13
(Ekson 2)
Kodon 61
(Ekson 3)
06322379001-03PL
Typ próbki
Próbka FFPET
Mieszanina próbek FFPET
Odsetek
procentowy
mutacji
4,3%
4,2%
4,7%
5,0%
4,6%
7,2%
4,4%
5,5%
3,8%
20
„Mutation Detected” (N = 24 powtórzenia)
3,1
3,1
3,1
3,1
1,6
1,6
3,1
3,1
6,3
Doc Rev. 3.0
Wyniki tego badania wykazują, że cobas® KRAS Mutation Test może wykrywać mutacje w kodonie 12, 13 i 61 genu KRAS przy
poziomie mutacji wynoszącym ok. 5% z zastosowaniem standardowego stężenia o wartości 50 ng/25 µl. Zdolność opisywanego
testu do wykrywania mutacji przy niższych poziomach wejściowych DNA pokazuje, że mutacja może zostać wykryta nawet
w próbkach zawierających DNA zdegradowany w procesie utrwalania lub nienadający się do amplifikacji.
Korelacja z metodą referencyjną
Przebadano sto osiemdziesiąt osiem (188) próbek FFPET raka jelita grubego z użyciem 2 serii zestawów testu cobas® KRAS
Mutation Test. Wszystkie próbki poddano badaniom porównawczym z wykorzystaniem dwukierunkowego sekwencjonowania 2X
metodą Sangera. Niezgodność wyników pomiędzy testem cobas® KRAS Mutation Test i dwukierunkowym sekwencjonowaniem
2X metodą Sangera rozstrzygano z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454.
Wyniki testu cobas® KRAS Mutation Test i dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera
Informacje dotyczące próbek i wyników dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera dla 188 próbek
podsumowano w tabeli 6. Osiemdziesiąt jeden (81) próbek ze 188 próbek zawierało mutację w kodonie 12/13 genu KRAS,
natomiast 7 — w kodonie 61 genu KRAS. W drodze sekwencjonowania metodą Sangera ustalono, że 107 próbek zawierało
naturalnie występujące sekwencje genu KRAS albo mutację poza kodonem 12/13 genu KRAS, natomiast 181 próbek zawierało
naturalnie występującą sekwencję genu KRAS lub mutację genu KRAS poza kodonem 61.
Tabela 6
Stadium guza a sekwencjonowanie metodą Sangera
Wyniki dwukierunkowego sekwencjonowania 2X
metodą Sangera
Stadium guza
kodon 12
kodon 13
kodon 61
naturalnie
występująca
Ogółem
% ogółu
Stadium I
6
2
0
3
11
5,8%
Stadium II
20
5
3
37
65
34,4%
Stadium III
21
8
1
38
68
36,0%
Stadium IV
17*
3*
3
20
43
22,8%
Stadium nieznane
0
0
0
2
2
1,1%
Ogółem
64
18
7
100
189
100,0%
* Jedna z 81 próbek zawierających mutację w kodonie 12/13 wykazała obecność mutacji zarówno
w kodonie 12, jak i 13.
Zestawienie wyników badań dla 188 próbek guza pochodzących od pacjentów z rakiem jelita grubego w kierunku mutacji
genu KRAS w kodonie 12/13 eksonu 2 i kodonie 61 eksonu 3, przeprowadzonych z wykorzystaniem dwóch serii testu cobas®
KRAS Mutation Test, w porównaniu z wynikami dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera przedstawiono
w tabelach 7 i 8.
Tabela 7
Seria 1 testu cobas® KRAS Mutation Test w porównaniu z dwukierunkowym sekwencjonowaniem 2X metodą Sangera
Dwukierunkowe sekwencjonowanie 2X metodą Sangera
Kodon 12/13 MT
Kodon 61 MT
WT
Ogółem
Kodon 12/13 MT
78
0
6
84
®
Kodon 61 MT
0
6
1
7
Test cobas KRAS,
seria 1
WT
2
1
93
96
Ogółem
80
7
100
187*
Zgodność wyników dodatnich = 96,6% (95% CI = 90,3–98,8%)
Zgodność wyników ujemnych = 93,0% (95% CI = 86,3–96,6%)
Ogólna zgodność = 94,7% (95% CI = 90,4–97,1%)
MT: z mutacją WT: naturalnie występująca sekwencja
* Jedna próbka nie została przebadana z użyciem serii 1.
06322379001-03PL
21
Doc Rev. 3.0
Tabela 8
Kodon 12/13 MT
Kodon 61 MT
WT
Ogółem
Kodon 12/13 MT
79
0
6
85
®
Kodon 61 MT
0
6
1
7
Test cobas KRAS,
seria 2
WT
2
1
93
96
Ogółem
81
7
100
188
Ogólna zgodność wyników testu cobas® KRAS Mutation Test w porównaniu z wynikami dwukierunkowego sekwencjonowania
2X metodą Sangera w przypadku mutacji w kodonie 12/13 i 61 genu KRAS wyniosła 94,7% (ogółem 10 wyników niezgodnych
dla każdej serii), zarówno dla pierwszej, jak i drugiej serii odczynników testu cobas® KRAS Mutation Test.
Badanie niezgodności wyników z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454
Niezgodność wyników pomiędzy testem cobas® KRAS Mutation Test a dwukierunkowym sekwencjonowaniem 2X metodą
Sangera dla serii 1 i 2 rozstrzygano z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454; wyniki przedstawiono odpowiednio
w tabelach 9 i 10.
Tabela 9
Rozstrzygnięcie niezgodności wyników serii 1 testu cobas® KRAS Mutation Test
i dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera za pomocą sekwencjonowania metodą 454
Dwukierunkowe sekwencjonowanie metodą Sangera 2X,
rozstrzygnięcie niezgodności wyników
za pomocą sekwencjonowania metodą 454
Kodon 12/13 MT
Kodon 61 MT
WT
Ogółem
Kodon 12/13 MT
83
0
1
84
®
Kodon 61 MT
0
7
0
7
Test cobas KRAS,
seria 1
WT
0
0
96
96
Ogółem
83
7
97
187*
* Jedna próbka nie została przebadana z użyciem serii 1.
Tabela 10
Dwukierunkowe sekwencjonowanie metodą Sangera 2X,
rozstrzygnięcie niezgodności wyników
za pomocą sekwencjonowania metodą 454
Kodon 12/13 MT
Kodon 61 MT
WT
Ogółem
Kodon 12/13 MT
84
0
1
85
®
Kodon 61 MT
0
7
0
7
Test cobas KRAS,
seria 2
WT
0
0
96
96
Ogółem
84
7
97
188
06322379001-03PL
22
Doc Rev. 3.0
Po rozstrzygnięciu z użyciem sekwencjonowania metodą 454 wyników testu cobas® KRAS Mutation Test niezgodnych
z wynikami dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera ogólna zgodność uległa poprawie do 99,5%, zarówno dla
pierwszej, jak i drugiej serii odczynników testu cobas® KRAS Mutation Test.
Swoistość
Swoistość testu cobas® KRAS Mutation Test określono przez poddanie testom 188 próbek FFPET raka jelita grubego
w połączeniu z badaniem korelacji z metodą referencyjną.
Sekwencjonowanie metodą Sangera
Swoistość testu cobas® KRAS Mutation Test obliczono przez określenie udziału procentowego próbek FFPET określonych jako
naturalnie występujące sekwencje genu KRAS za pomocą dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera
i prawidłowo określonych jako naturalnie występujące sekwencje genu KRAS za pomocą testu cobas® KRAS Mutation Test
(procentowa zgodność wyników ujemnych).
Swoistość (procentowa zgodność wyników ujemnych) uzyskana podczas badania 188 próbek guza pod kątem mutacji
w kodonie 12/13 i 61 genu KRAS z użyciem testu cobas® KRAS Mutation Test w porównaniu z wynikami uzyskanymi za
pomocą dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera wyniosła 93,0% (tabele 6 i 7), zarówno dla pierwszej, jak
i drugiej serii odczynników testu cobas® KRAS Mutation Test.
Swoistość w przypadku analizy mutacji w kodonie 12/13 i 61 genu KRAS uległa poprawie do 99,0%, zarówno dla pierwszej, jak
i drugiej serii odczynników testu cobas® KRAS Mutation Test (tabele 8 i 9), po wykonaniu sekwencjonowania metodą 454 w celu
rozstrzygnięcia niezgodnych wyników uzyskanych z użyciem testu cobas® KRAS Mutation Test oraz dwukierunkowego
sekwencjonowania DNA 2X metodą Sangera.
Poprawa swoistości testu cobas® KRAS Mutation Test po rozstrzygnięciu sprzecznych wyników z użyciem sekwencjonowania
metodą 454 była w głównej mierze spowodowana zdolnością wykrycia w sekwencjonowaniu metodą 454 mutacji w genie KRAS,
które zostały pominięte w trakcie sekwencjonowania metodą Sangera ze względu na niższą czułość tej techniki w porównaniu
z sekwencjonowaniem metodą 454.
Reaktywność krzyżowa
Reaktywność krzyżową testu cobas® KRAS Mutation Test poddano ocenie w następujących badaniach:
•
badanie plazmidów z cichą mutacją w genie KRAS,
•
badanie homologów plazmidowych KRAS,
•
badanie mikroorganizmów występujących w jelicie.
Przeprowadzono również ocenę reaktywności krzyżowej, określając, czy obecność plazmidów z cichą mutacją genu KRAS,
homologów plazmidowych KRAS lub mikroorganizmów występujących w jelicie miała wpływ na detekcję mutacji w kodonie 12,
13 i 61 genu KRAS.
Plazmidy z cichą mutacją KRAS
Przygotowano próbki plazmidów w tle DNA linii komórkowych z naturalnie występującymi sekwencjami i przeprowadzono
analizę pod kątem następujących trzech cichych mutacji w kodonie 12 eksonu 2 genu KRAS: GGA, GGC oraz GGG, a także
trzech mutacji cichych w kodonie 13 eksonu 2 genu KRAS: GGA, GGT oraz GGG. W przypadku plazmidów nie obserwowano
reaktywności krzyżowej dla cichych mutacji w kodonie 12 i 13 w eksonie 2 genu KRAS.
Przygotowano mieszaniny plazmidów z 5% zawartością mutacji w kodonie 12 lub 13 genu KRAS w tle DNA linii komórkowych
z naturalnie występującymi sekwencjami i przeprowadzono analizę w obecności odpowiednich plazmidów z mutacjami cichymi.
Nie wykryto żadnego wpływu ze strony plazmidów z mutacjami cichymi.
Homologi plazmidowe KRAS
Przygotowano próbki zawierające po sześć homologów plazmidowych KRAS (pseudogen kodonu 12/13 KRAS, pseudogen
kodonu 61, ekson 2 genu NRAS, ekson 3 genu NRAS, ekson 2 genu HRAS oraz ekson 3 genu HRAS) w tle DNA z linii
komórkowej z naturalnie występującymi sekwencjami i przeprowadzono analizę w trzech powtórzeniach z użyciem testu cobas®
KRAS Mutation Test. Nie zaobserwowano reaktywności krzyżowej z którąkolwiek próbką zawierającą plazmidy.
Przygotowano mieszaniny plazmidów z 5% zawartością mutacji w kodonie 12, 13 lub 61 genu KRAS w tle DNA linii
komórkowych z naturalnie występującymi sekwencjami i przeprowadzono analizę w obecności odpowiednich homologów
plazmidowych. Nie wykryto żadnego wpływu ze strony homologów plazmidowych.
06322379001-03PL
23
Doc Rev. 3.0
Drobnoustroje występujące w jelicie grubym
Stwierdzono, że wymienione niżej drobnoustroje występujące w jelicie grubym nie wykazują reaktywności krzyżowej w teście
cobas® KRAS Mutation Test po dodaniu podczas etapu lizy tkanki do 5 próbek zawierających naturalnie występujące sekwencje
kodonu 12, 13 i 61 genu KRAS w ilości 1 x 106 jednostek tworzących kolonie:
1. Bacteroides caccae
2. Prevotella intermedia
3. Escherichia coli (E. coli)
Badane drobnoustroje nie zakłócały także detekcji docelowych mutacji w kodonie 12 (2 próbki), kodonie 13 (1 próbka) lub
kodonie 61 (2 próbki) genu KRAS po dodaniu podczas etapu lizy tkanki w ilości 1 x 106 jednostek tworzących kolonie do próbki
zawierającej mutację genu kodującego KRAS na poziomach wymienionych w tabeli 11.
Tabela 11
Odsetek mutacji w próbkach badanych pod kątem zakłóceń wywoływanych przez drobnoustroje występujące
w jelicie grubym
Nr próbki
Status
mutacji
1
2
3
4
5
kodon 12
kodon 12
kodon 13
kodon 61
kodon 61
% mutacji na podstawie
sekwencjonowania
metodą 454
15,9
16,1
42,8
17,0
19,8
Substancje wpływające na wynik testu
Wykazano, że triglicerydy (≤ 37 mM, granica podwyższonego stężenia, zalecana przez Clinical and Laboratory Standards
Institute [CLSI]30), hemoglobina (≤ 2 mg/ml, granica podwyższonego stężenia, zalecana przez CLSI30) oraz obecność ≤ 50%
tkanki martwiczej nie zakłócają działania testu cobas® KRAS Mutation Test w przypadku dodania potencjalnej substancji
zakłócającej podczas procedury przygotowania próbki na etapie lizy.
Odporność na błędy
Odporność na błędy testu cobas® KRAS Mutation Test określono z użyciem dwóch próbek FFPET raka jelita grubego — jednej
obarczonej mutacją w kodonie 12 eksonu 2 genu KRAS i drugiej z mutacją w kodonie 61 eksonu 3 genu KRAS, występujących
w odsetku odpowiednio 13,1% i 17%. Każda próbka została pocięta na potrzeby analizy na 100 skrawków o grubości
5 mikronów.
Genomowy DNA wyizolowano z każdego skrawka za pomocą zestawu do przygotowywania próbek cobas® DNA Sample
Preparation Kit. Zbadano jedno powtórzenie wyizolowanego genomowego DNA z każdego ze 100 skrawków pochodzących
z każdej z 2 próbek. Wykonano dziesięć oddzielnych przebiegów testu cobas® KRAS Mutation Test, analizując w każdym
przebiegu 20 skrawków. Sto procent (100%) powtórzeń wykonanych z użyciem testu cobas® KRAS Mutation Test uzyskało
wynik „Mutation Detected”, zarówno w przypadku próbki z mutacją w kodonie 12 genu KRAS, jak i próbki z mutacją
w kodonie 61 genu KRAS. Odsetek wyników fałszywie ujemnych wyniósł 0%.
06322379001-03PL
24
Doc Rev. 3.0
Powtarzalność
Powtarzalność testu cobas® KRAS Mutation Test zbadano z użyciem ośmiu próbek FFPET niedrobnokomórkowego raka płuc.
Charakterystykę próbek przedstawiono w tabeli 12.
Próbki badało dwukrotnie dwóch operatorów, używając dwóch różnych serii odczynników i czterech analizatorów cobas z 480,
w ciągu 4 dni (n = 32/próbkę).
Tabela 12
Powtarzalność testu cobas® KRAS Mutation Test
Numer
próbki
1
2
3
4
5
6
7
8
Status mutacji
KRAS
Kodon 12
Kodon 12
Kodon 13
Kodon 13
Kodon 61
Kodon 61
Naturalnie
występująca
Naturalnie
występująca
% mutacji
16,4%
20,6%
16,7%
10,3%
28,1%
31,5%
-
Mutation Detected
(n = 32)
32
32
32
32
32
32
0
0
-
Mutation Not
Detected
0
0
0
0
0
0
32
32
Procent
zgodności
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Test cobas® KRAS Mutation Test charakteryzował się dokładnością wynoszącą 100% prawidłowych rozpoznań (256/256)
w analizie połączonych danych dotyczących wszystkich dni, próbek, powtórzeń, operatorów i serii odczynników.
Ocena skuteczności w badaniach nieklinicznych w przypadku tkanek niedrobnokomórkowego raka płuc
Czułość analityczna
Badanie czułości analitycznej testu cobas® KRAS Mutation Test zostało przeprowadzone z zastosowaniem paneli rozcieńczeń
przygotowanych z dwóch rodzajów próbek:
•
Mieszanina linii komórkowych przygotowana przez zmieszanie roztworów podstawowych DNA uzyskanych z linii
komórkowej z mutacją w genie KRAS oraz linii komórkowej z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS.
•
Mieszaniny próbek przygotowane przez zmieszanie roztworów podstawowych DNA otrzymanych z próbek FFPET
z mutacją w genie KRAS oraz próbek FFPET z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS.
Wszystkie próbki wykorzystane w tym badaniu zostały poddane procesowi oznaczenia sekwencji na drodze sekwencjonowania
z użyciem sekwenatora 454 Genome Sequencer FLX Titanium (sekwencjonowanie metodą 454) w celu określenia udziału
procentowego mutacji w każdej z próbek.
Czułość analityczna testu cobas® KRAS Mutation Test badana z użyciem mieszanin pochodzących z linii komórkowych
DNA z linii komórkowych pochodzących z tkanek płuc, zawierających mutację w kodonie 12, 13 lub 61 genu KRAS,
wyizolowano i wymieszano z izolatami DNA uzyskanymi z linii komórkowych z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS
w celu otrzymania próbek zawierających 2,5%, 5% i 10% mutacji, co zweryfikowano na drodze sekwencjonowania metodą 454.
Trzy oddzielne panele rozcieńczeń obejmowały następujące rozcieńczenia (50,0; 12,5; 3,1; 0,8 i 0 ng/25 µl). Z zastosowaniem
każdej z 3 serii zestawu cobas® KRAS Mutation Test zbadano dwadzieścia cztery (24) powtórzenia każdego elementu panelu
(w sumie 72 powtórzenia). Czułość określono na podstawie najmniejszej ilości DNA, która dała odsetek wyników „Mutation
Detected”, dotyczących mutacji KRAS, wynoszący co najmniej 95%, co pokazano w tabeli 13.
06322379001-03PL
25
Doc Rev. 3.0
Tabela 13
Czułość testu cobas® KRAS Mutation Test badana z użyciem mieszanin linii komórkowych pochodzących z tkanek płuc
Mutacja KRAS
Kodon 12
(ekson 2)
Kodon 13
(ekson 2)
Kodon 61
(ekson 3)
Typ próbki
konieczna do uzyskania odsetka ≥ 95%
wyników „Mutation Detected”
(n = 72 powtórzenia)
0,8
Odsetek procentowy
mutacji*
12,1%
Linia komórkowa
Linia komórkowa
Linia komórkowa
6,1%
3,1
2,4%
50,0
7,8%
0,8
4,9%
3,1
2,8%
3,1
10,2%
0,8
6,1%
0,8
2,7%
12,5
Test dał 95% wyników „Mutation Detected” podczas analizy kodonów 12, 13 i 61 genu KRAS przy zawartości mutacji
odpowiednio na poziomie 2,4% (przy stężeniu 50 ng/25 µl), 2,8% (przy stężeniu 3,1 ng/25 µl), 2,7% (przy stężeniu 12,5 ng/25 µl).
Wyniki te oznaczają, że test może wykrywać mutacje w genie KRAS przy poziomie mutacji wynoszącym co najmniej 5%
z zastosowaniem wyjściowego stężenia DNA o wartości 50 ng/25 µl.
Dodatkowo test dał 95% wyników „Mutation Detected” podczas analizy kodonów 12, 13 i 61 genu KRAS przy poziomie mutacji
wynoszącym ok. 5% i przy stężeniu odpowiednio 3,1 ng/25 µl, 3,1 ng/25 µl i 0,8 ng/25 µl (rozcieńczenia 1:16, 1:16 i 1:64
zalecanego stężenia wyjściowego DNA wynoszącego 50 ng/25 µl). Może to wskazywać, że test wykryje mutację w genie KRAS
w przypadku degradacji lub niemożności amplifikacji ok. 94% DNA na skutek procesu utrwalenia przy założeniu, że DNA
mieszanin linii komórkowych zawierał w 100% nienaruszony i nadający się do amplifikacji DNA.
Czułość analityczna, badana z użyciem mieszaniny z próbek FFPET
DNA wyizolowane z próbek FFPET obarczonych mutacją genu KRAS w kodonie 12, 13 i 61 wymieszano z izolatami z próbek
FFPET z naturalnie występującą sekwencją genu KRAS w celu osiągnięcia próbek o poziomie mutacji ok. 5%. Końcowe
poziomy mutacji dla wszystkich próbek zostały ocenione z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454. Każda z mieszanin
próbek została rozcieńczona w celu uzyskania elementów panelu (50,0; 12,5; 3,1; 0,8 oraz 0 ng/25 µl).
Wykonano osiem (8) powtórzeń każdego elementu panelu z użyciem każdej z 3 serii zestawu cobas® KRAS Mutation Test
(n = 24/element panelu). Czułość każdej próbki określono na podstawie najmniejszej ilości DNA, która dała odsetek wyników
„Mutation Detected”, dotyczących mutacji KRAS, wynoszący co najmniej 95%, co pokazano w tabeli 14.
Tabela 14
Czułość testu cobas® KRAS Mutation Test badana z użyciem mieszanin pochodzących z próbek raka płuc
Mutacja KRAS
Typ próbki
Kodon 12 (ekson 2)
Mieszanina próbek
FFPET
Kodon 13 (ekson 2)
Kodon 61 (ekson 3)
Mieszanina próbek
FFPET
Mieszanina próbek
FFPET
Odsetek
procentowy
mutacji*
„Mutation Detected” (n = 24 powtórzenia)
6,2%
12,5
6,0%
3,1
5,6%
3,1
6,2%
3,1
4,4%
3,1
4,4%
3,1
6,5%
3,1
6,4%
3,1
4,5%
3,1
Wyniki tego badania wykazują, że test cobas® KRAS Mutation Test może wykrywać mutacje w kodonie 12, 13 i 61 genu KRAS
przy poziomie mutacji wynoszącym ok. 5% z zastosowaniem standardowego stężenia o wartości 50 ng/25 µl. Zdolność
opisywanego testu do wykrywania mutacji przy niższych poziomach wejściowych DNA pokazuje, że mutacja może zostać
wykryta nawet w próbkach zawierających DNA zdegradowany w procesie utrwalania lub nienadający się do amplifikacji.
06322379001-03PL
26
Doc Rev. 3.0
Korelacja z metodą referencyjną
Przebadano sto dziewięćdziesiąt cztery (194) próbki FFPET niedrobnokomórkowego raka płuc z użyciem każdej z 2 serii testu
cobas® KRAS Mutation Test. Wszystkie próbki poddano badaniom porównawczym z wykorzystaniem dwukierunkowego
sekwencjonowania 2X metodą Sangera. Niezgodność wyników pomiędzy testem cobas® KRAS Mutation Test
i dwukierunkowym sekwencjonowaniem 2X metodą Sangera rozstrzygano z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454.
Wyniki testu cobas® KRAS Mutation Test i dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera
Informacje dotyczące próbek i wyników dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera dla 194 próbek
podsumowano w tabeli 15. Dziewięćdziesiąt pięć (95) próbek ze 194 próbek zawierało mutację w kodonie 12/13 genu KRAS
(jedna próbka zawierała mutacje w kodonie 12 i 61), natomiast jedna — w kodonie 61 genu KRAS. W drodze sekwencjonowania
metodą Sangera ustalono, że 98 próbek zawierało naturalnie występujące sekwencje genu KRAS albo mutację poza kodonem
12/13 genu KRAS, natomiast 192 próbki zawierały naturalnie występującą sekwencję genu KRAS lub mutację genu KRAS poza
kodonem 61.
Tabela 15
Stadium guza a sekwencjonowanie metodą Sangera
Wyniki dwukierunkowego
sekwencjonowania 2X metodą Sangera
Stadium guza
kodon
12
kodon
13
kodon
61
naturalnie
występująca Ogółem
Stadium I
15
2
0
29
46
% ogółu
23,7%
Stadium II
12
0
0
7
19
9,8%
Stadium III
21
4
1
9
35
18,0%
Stadium IV
11
3
0
1
15
7,7%
Stadium nieznane
24
3
0
52
79
40,7%
Ogółem
83
12
1
98
194
100,0%
Zestawienie wyników badań dla 194 próbek guza pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc
w kierunku mutacji w kodonie 12/13 eksonu 2 i kodonie 61 eksonu 3 genu KRAS, przeprowadzonych z wykorzystaniem testu
cobas® KRAS Mutation Test, w porównaniu z wynikami dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera
przedstawiono w tabelach 16 i 17.
Tabela 16
Kodon 12/13 MT
Kodon 61 MT
WT
Ogółem
Kodon 12/13 MT
90
0
6
96
®
Kodon
61
MT
0
1
1
2
Test cobas KRAS,
seria 1
WT
5
1
91
97
Ogółem
95
2
98
195*
* n = 194, w jednej próbce stwierdzono w drodze sekwencjonowania metodą Sangera mutację podwójną
(w kodonie 12 i 61)
2X metodą Sangera w przypadku mutacji w kodonie 12/13 i 61 genu KRAS wyniosła 93,8% (ogółem 13 wyników niezgodnych)
dla pierwszej serii odczynników testu cobas® KRAS Mutation Test.
06322379001-03PL
27
Doc Rev. 3.0
Tabela 17
Kodon 12/13 MT
Kodon 61 MT
WT
Ogółem
Kodon 12/13 MT
90
0
8
98
®
Kodon 61 MT
0
1
1
2
Test cobas KRAS,
seria 2
WT
5
1
88
94
Ogółem
95
2
97
194*
(w kodonie 12 i 61). W przypadku jednej spośród 194 próbek uzyskano wynik nieważny.
2X metodą Sangera w przypadku mutacji w kodonie 12/13 i 61 genu KRAS wyniosła 93,8% (ogółem 15 wyników niezgodnych)
dla drugiej serii odczynników testu cobas® KRAS Mutation Test.
Niezgodność wyników pomiędzy testem cobas® KRAS Mutation Test i dwukierunkowym sekwencjonowaniem 2X metodą
Sangera w kodonie 12/13 i 61 genu KRAS rozstrzygano z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454; wyniki
przedstawiono w tabelach 18 i 19.
Tabela 18
Wyniki sekwencjonowania metodą Sangera,
rozstrzygane za pomocą sekwencjonowania metodą 454
Kodon 12/13 MT
Kodon 61 MT
WT
Ogółem
Kodon 12/13 MT
96
0
0
96
®
Kodon 61 MT
0
1
1
2
Test cobas KRAS,
seria 1
WT
3
0
94
97
Ogółem
99
1
95
195*
(w kodonie 12 i 61)
06322379001-03PL
28
Doc Rev. 3.0
Tabela 19
Wyniki sekwencjonowania metodą Sangera,
rozstrzygane za pomocą sekwencjonowania metodą 454
Kodon 12/13 MT
Kodon 61 MT
WT
Ogółem
Kodon 12/13 MT
98
0
0
98
®
Kodon 61 MT
0
1
1
2
Test cobas KRAS,
seria 2
WT
0
0
94
94
Ogółem
98
1
95
194*
(w kodonie 12 i 61). W przypadku jednej spośród 194 próbek uzyskano wynik nieważny.
Po rozstrzygnięciu z użyciem sekwencjonowania metodą 454 wyników testu cobas® KRAS Mutation Test niezgodnych
z wynikami dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera ogólna zgodność uległa poprawie odpowiednio do 97,9%
i 99,5% dla pierwszej i drugiej serii odczynników testu cobas® KRAS Mutation Test.
Swoistość
Swoistość testu cobas® KRAS Mutation Test określono przez poddanie testom 194 próbek FFPET niedrobnokomórkowego raka
płuc w połączeniu z badaniem korelacji z metodą referencyjną.
Sekwencjonowanie metodą Sangera
Swoistość testu cobas® KRAS Mutation Test obliczono przez określenie udziału procentowego próbek FFPET określonych jako
naturalnie występujące sekwencje genu KRAS za pomocą dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera
i prawidłowo określonych jako naturalnie występujące sekwencje genu KRAS za pomocą testu cobas® KRAS Mutation Test
(procentowa zgodność wyników ujemnych).
Swoistość (procentowa zgodność wyników ujemnych) uzyskana podczas badania 194 próbek guza pod kątem mutacji
w kodonie 12/13 i 61 genu KRAS z użyciem testu cobas® KRAS Mutation Test w porównaniu z wynikami uzyskanymi za
pomocą dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera wyniosła 92,9% (tabela 15) oraz 90,7% (tabela 16),
odpowiednio dla pierwszej i drugiej serii odczynników testu cobas® KRAS Mutation Test.
Swoistość w przypadku analizy mutacji w kodonie 12/13 i 61 genu KRAS uległa poprawie do 98,9%, zarówno dla pierwszej, jak
i drugiej serii odczynników testu cobas® KRAS Mutation Test (tabele 18 i 19), po wykonaniu sekwencjonowania metodą 454
w celu rozstrzygnięcia niezgodnych wyników uzyskanych z użyciem testu cobas® KRAS Mutation Test oraz dwukierunkowego
sekwencjonowania DNA 2X metodą Sangera.
Poprawa swoistości testu cobas® KRAS Mutation Test po rozstrzygnięciu sprzecznych wyników z użyciem sekwencjonowania
metodą 454 była w głównej mierze spowodowana zdolnością wykrycia w sekwencjonowaniu metodą 454 mutacji w genie KRAS,
które zostały pominięte w trakcie sekwencjonowania metodą Sangera ze względu na niższą czułość tej techniki w porównaniu
z sekwencjonowaniem metodą 454.
Reaktywność krzyżowa z drobnoustrojami występującymi w płucach
Reaktywność krzyżową testu cobas® KRAS Mutation Test poddano ocenie, badając drobnoustroje występujące w płucach.
Przeprowadzono również ocenę reaktywności krzyżowej, określając, czy obecność mikroorganizmów występujących w płucach
miała wpływ na detekcję mutacji w kodonie 12, 13 i 61 genu KRAS.
Stwierdzono, że wymienione niżej drobnoustroje występujące w płucach nie wykazują reaktywności krzyżowej w teście cobas®
KRAS Mutation Test po dodaniu podczas etapu lizy tkanki do 5 próbek zawierających naturalnie występujące sekwencje
kodonu 12, 13 i 61 genu KRAS w ilości 1 x 106 jednostek tworzących kolonie:
1. Streptococcus pneumoniae
2. Haemophilus influenzae
Badane drobnoustroje nie zakłócały także detekcji mutacji w kodonie 12 (3 próbki), kodonie 13 (1 próbka) i kodonie 61
(1 próbka) genu KRAS po dodaniu podczas etapu lizy tkanki w ilości 1 x 106 jednostek tworzących kolonie do próbki zawierającej
mutację genu kodującego KRAS na poziomach wymienionych w tabeli 20.
06322379001-03PL
29
Doc Rev. 3.0
Tabela 20
Odsetek mutacji w próbkach badanych pod kątem zakłóceń wywoływanych
przez drobnoustroje występujące w płucach
Nr próbki
Status
mutacji
1
2
3
4
5
kodon 12
kodon 12
kodon 12
kodon 13
kodon 61
% mutacji na podstawie
sekwencjonowania
metodą 454
15,3
32,3
32,5
13,4
32,6
Substancje wpływające na wynik testu
Wykazano, że triglicerydy (≤ 37 mM, granica podwyższonego stężenia, zalecana przez Clinical and Laboratory Standards
Institute [CLSI]30), hemoglobina (≤ 2 mg/ml, granica podwyższonego stężenia, zalecana przez CLSI30) oraz obecność ≤ 80%
tkanki martwiczej nie zakłócają działania testu cobas® KRAS Mutation Test w przypadku dodania potencjalnej substancji
zakłócającej podczas procedury przygotowania próbki na etapie lizy.
Odporność na błędy
Odporność na błędy testu cobas® KRAS Mutation Test określono z użyciem próbek FFPET niedrobnokomórkowego raka płuc
obarczonych mutacją w kodonie 12, 13 i 61 genu KRAS.
Genomowy DNA wyizolowano z każdego skrawka za pomocą zestawu do przygotowywania próbek cobas® DNA Sample
Preparation Kit. Zbadano jedno powtórzenie wyizolowanego genomowego DNA z każdego ze 100 skrawków z mutacją
w kodonie 12, ze 102 skrawków z mutacją w kodonie 13 oraz ze 100 skrawków z mutacją w kodonie 61. Wykonano czternaście
oddzielnych przebiegów testu cobas® KRAS Mutation Test. W przypadku wszystkich ze stu powtórzeń próbek z mutacją
w kodonie 12 i 61 otrzymano wynik „Mutation Detected”. W przypadku stu próbek z mutacją w kodonie 13 otrzymano wynik
„Mutation Detected”, w jednym powtórzeniu uzyskano wynik „Mutation Not Detected”, natomiast jedno powtórzenie otrzymało
wynik „Invalid” w teście cobas® KRAS Mutation Test. Całkowity odsetek wyników fałszywie ujemnych wyniósł 0,7% (2/302).
Powtarzalność
Powtarzalność testu cobas® KRAS Mutation Test zbadano z użyciem ośmiu próbek FFPET niedrobnokomórkowego raka płuc.
Charakterystykę próbek przedstawiono w tabeli 21.
Próbki badało dwukrotnie dwóch operatorów, używając dwóch różnych serii odczynników i czterech analizatorów cobas z 480,
w ciągu 4 dni (n = 32/próbkę).
Tabela 21
Powtarzalność testu cobas® KRAS Mutation Test
Numer
próbki
1
2
3
4
5
6
7
8
Status
mutacji KRAS
Kodon 12
Kodon 12
Kodon 13
Kodon 13
Kodon 61
Kodon 61
Naturalnie
występująca
Naturalnie
występująca
% mutacji
15,3%
17,5%
13,3%
27,8%
14,1%
32,6%
-
Mutation Detected
(n = 32)
32
32
32
32
32
32
0
0
-
Mutation Not
Detected
0
0
0
0
0
0
32
32
Procent
zgodności
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Test cobas® KRAS Mutation Test charakteryzował się dokładnością wynoszącą 100% prawidłowych rozpoznań (256/256)
w analizie połączonych danych dotyczących wszystkich dni, próbek, powtórzeń, operatorów i serii odczynników.
06322379001-03PL
30
Doc Rev. 3.0
PIŚMIENNICTWO
1. Shankaran V, Obel J, Benson III AB. Predicting response to EGFR inhibitors in metastatic colorectal cancer: current practice
and future directions. The Oncologist 2010 15:157-67.
2. Samowitz WS, Curtin K, Schaffer D, et al. Relationship of Ki-ras mutations in colon cancers to tumor location, stage, and
survival: a population-based study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000 Nov 9(11):1193-7.
3. Andreyev HJ, Norman AR, Cunningham D, et al. Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: the 'RASCAL II'
study. Br J Cancer 2001 Sep 1;85(5):692-6.
4. Der CJ, Finkel T, Cooper GM. Biological and biochemical properties of human rasH genes mutated at codon 61. Cell 1986
Jan 17; 44:167-176.
5. Loupakis F, Ruzzo A, Cremolini C, et al. KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus
irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 2009 Aug 18;101(4):715-21.
6. De Roock W, Claes B, Bernasconi D. et al. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of
cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis.
Lancet Oncology, 2010 Aug 11(8):753-62.
7. Siena S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, et al. Biomarkers predicting clinical outcome of epidermal growth factor
receptor-targeted therapy in metastatic colorectal cancer. J Natl Cancer Inst 2009 Oct 7;101(19):1308-24.
8. Bokemeyer C, Bondarenko I, Makhson A, et al. Fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin with and without cetuximab in the
first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2009 Feb 10;27(5):663-71.
9. Tol J, Koopman M, Cats A, et al. Chemotherapy, bevacizumab, and cetuximab in metastatic colorectal cancer. N Engl J Med
2009 Feb 5;360(6):563-72.
10. Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal
cancer. Cancer Res 2006 Apr 15;66(8):3992-5.
11. Benvenuti S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, et al. Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the
response of metastatic colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res 2007 Mar
15;67(6):2643-8.
12. Amado RG, Wolf M, Peeters M, et al. Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic
colorectal cancer. J Clin Oncol 2008 Apr 1;26(10):1626-34.
13. Karapetis CS, Khambata-Ford S, Jonker DJ, et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal
cancer. N Engl J Med 2008 Oct 23;359(17):1757-65.
14. Douillard J-Y, Siena S, Cassidy J et al. randomized, Phase III trial of panitumumab with infusional fluorouracil, leucovin, and
Oxaliplatin (FOXFOX4) versus FOLFOX4 alone as first-line treatment in patients with previously untreated metastatic
colorectal cancer: The PRIME Study. J Clin Oncol 2010 28:4697-4705.
15. Allegra CJ, Jessup JM, Somerfield MR, et al. American Society of Clinical Oncology provisional clinical opinion: testing for
KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal carcinoma to predict response to anti-epidermal growth factor
receptor monoclonal antibody therapy. J Clin Oncol 2009 Apr 20;27(12):2091-6.
16. National Comprehensive Cancer Network. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. Colon cancer, 2010, v.2.
17. Van Cutsem E, Oliveira J; ESMO Guidelines Working Group. Advanced colorectal cancer: ESMO clinical recommendations
for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2009 May;20 Suppl 4:61-3.
18. Food and Drug Administration. Class labeling changes to anti-EGFR monoclonal antibodies, cetuximab (Erbitux) and
panitumumab (Vectibix): KRAS mutations. http://www.fda.gov/AboutFDA/CentersOffices/ CDER/ucml172905.htm.
19. European Medicines Agency: Committee for Medicinal Products for Human Use post-authorisation summary of positive
opinion for Erbitux. http://www.emea.europa.eu/pdfs/human Erbitux_28040208en.pdf.
20. Karachaliou, N, Mayo, C, Costa, C. et al. KRAS Mutations in Lung Cancer. Clinical Lung Cancer, (In press)
21. Mascaux, C, Lannino, N, Martin, B. et al. The role of RAS oncogene in survival of patients with lung cancer: a systematic
review of the literature with meta-analysis. British Journal of Cancer (2005) 92, 131 – 139.
22. Shepherd, F, Bourredjem, A, Brambilla, E. et al. Prognostic and predictive effects of KRAS mutation subtype in completely
resected non-small cell lung cancer (NSCLC): A LACE-bio study. J Clin Oncol 30, 2012 (suppl; abstr 7007)
23. Mao, C, Qiub, L, Liao R. et al. KRAS mutations and resistance to EGFR-TKIs treatment in patients with non-small cell lung
cancer: A meta-analysis of 22 studies. Lung Cancer 69 (2010) 272–278
24. Riely, G, Politi, K, Vincent, A. et al. Update on Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Non -Small Cell Lung Cancer.
Clin Cancer Res 2006;12:7232-7241.
25. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in
polymerase chain reactions. Gene. 93:125-128.
06322379001-03PL
31
Doc Rev. 3.0
26. Chosewood, L.C. and Wilson, D.E. Biosafety and Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Fifth #
edition.(CDC) 21-1112. 2009.
27. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections.
Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Villanova, PA:CLSI, 2005.
28. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 52nd Edition. 2011.
29. Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), 2011, v.51, http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/.
30. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP7-A2, Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guidelines –
Second Edition, Appendix D 2005.
06322379001-03PL
32
Doc Rev. 3.0
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 3.0
01/2013
1. Dodanie deklaracji dotyczącej próbek FFPET niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC).
• Dodanie części dotyczącej oceny skuteczności w badaniach nieklinicznych w przypadku tkanek
niedrobnokomórkowego raka płuc.
• Aktualizacja rozdziału PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU w celu uwzględnienia informacji
dotyczących CRC oraz NSCLC.
• Aktualizacja piśmiennictwa.
2. Aktualizacja rozdziału Powtarzalność w celu uwzględnienia informacji dotyczących CRC.
• Dodanie wyników badania obejmującego 8 próbek FFPET.
3. Aktualizacja rozdziału Korelacja z metodą referencyjną w celu uwzględnienia informacji
dotyczących CRC.
• Podział tabel porównujących zgodność wyników testu KRAS Mutation Test w porównaniu
z wynikami dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera według serii odczynników.
• Zmiana układu tabel porównujących zgodność wyników testu KRAS Mutation Test w porównaniu
z wynikami dwukierunkowego sekwencjonowania 2X metodą Sangera na format 3 x 3.
4. Wprowadzenie następujących aktualizacji:
• Usunięcie tekstu „raka jelita grubego (CRC)” w rozdziale OSTRZEŻENIA I ŚRODKI
OSTROŻNOŚCI.
• Dodanie tekstu „Aplikator folii uszczelniającej cobas 4800 (Roche P/N 04900383001)” w rozdziale
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE.
• Zmiana tekstu „Drukarka HP P2055d” na „Drukarka”.
• Dodanie tekstu „niedrobnokomórkowego raka płuc” w rozdziale Pobieranie próbek.
• Usunięcie tekstu „raka jelita grubego” w rozdziale Przechowywanie próbek.
• Usunięcie tekstu „CRC” z uwagi w rozdziale INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA.
• Zmiana tekstu „10% komórek nowotworowych” na „10% tkanki guza” w uwadze w rozdziale
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA oraz Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na
szkiełkach.
• Dodanie UWAGI w rozdziale Pozbawienie parafiny skrawków FFPET nieosadzonych na
szkiełkach.
• Zmiana tekstu „należy zwrócić się do ośrodka klinicznego, zlecającego wykonanie badania,
o przysłanie kolejnej próbki FFPET” na „należy poprosić o przysłanie kolejnej próbki FFPET”
w rozdziale Ocena ilościowa stężenia DNA.
• Wprowadzenie w rozdziale OGRANICZENIA METODY następujących aktualizacji:
a. Dodanie punktu 13 „Test cobas® KRAS Mutation Test został zatwierdzony do zastosowania
z DNA w ilości 50 ng w każdym dołku reakcyjnym. Nie zaleca się stosowania początkowych
ilości DNA na poziomie niższym niż 50 ng w każdym dołku reakcyjnym”.
b. Dodanie punktu 14 „W celu wykrycia w tle DNA z naturalnie występującymi sekwencjami
≥ 5% zmutowanych sekwencji genu KRAS29 obejmujących mutacje przedstawione
w tabeli 3 należy postępować zgodnie z procedurą opisaną powyżej”.
c.
Dodanie tabeli 3 „Mutacje wykryte przez test cobas® KRAS Mutation Test”.
Aktualizacja adresów Producenta i Autoryzowanego Przedstawiciela.
Dołączono stronę z ujednoliconymi symbolami znajdującą się na końcu ulotki dołączonej do
opakowania.
Powiększenie symboli ostrzeżeń o niebezpieczeństwie.
Zmiana numeru telefonu pomocy technicznej z 1-800-428-2336 na 1-800-526-1247.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche.
06322379001-03PL
33
Doc Rev. 3.0
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
Distributed by
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
COBAS, COBAS Z, TAQMELT i AMPERASE są znakami towarowymi firmy Roche.
Technologia zapobiegania zanieczyszczeniu preparatu enzymu AmpErase resztkami jest chroniona patentem USA nr 5,035,996
oraz jego zagranicznymi odpowiednikami, będącymi w posiadaniu firmy Invitrogen Corporation; udostępniono ją na zasadzie
licencji firmie Roche Molecular Systems, Inc.
EPPENDORF jest znakiem towarowym firmy Eppendorf AG.
PIPET-AID jest znakiem towarowym firmy Drummond Scientific.
NANODROP jest znakiem towarowym firmy Thermo Scientific.
©2013 Roche Molecular Systems, Inc. Wszelkie prawa zastrzeżone.
01/2013
Doc Rev. 3.0
06322379001-03PL
06322379001-03
34
Doc Rev. 3.0
Na etykietach produktów diagnostycznych Roche PCR stosuje się następujące oznaczenia.
Oprogramowanie pomocnicze
Wyrób do diagnostyki in vitro
Autoryzowany Przedstawiciel we
Wspólnocie Europejskiej
Wyłącznie do oceny działania
w badaniach IVD
Arkusz kodów kreskowych
Dolna granica przypisanego zakresu
Kod partii
Producent
Zagrożenie biologiczne
Przechowywać z dala od światła
Numer katalogowy
Przestrzegać zakresu temperatury
SW
Sprawdź w instrukcji obsługi
Plik definicji testów
TDF
Wystarcza dla
Górna granica przypisanego zakresu
Zawartość zestawu
Użyć przed
Dystrybucja
Ten produkt spełnia wymogi dyrektywy
Wspólnoty Europejskiej 98/79/WE
dotyczącej diagnostycznych urządzeń
medycznych do stosowania in vitro.
Linia pomocy technicznej dla klientów w Stanach Zjednoczonych 1-800-526-1247
06322379001-03PL
35
Doc Rev. 3.0

cobas KRAS Mutation Test

Transkrypt

Podobne dokumenty

Oddział Miejski - PTTK Ruda Śląska

rumunia nieznana - Towarzystwo Naukowe Płockie

Konferencja IMPACT

Lista organizacji pozarządowych , którym Urząd

Klasa I b Rok szkolny 2016/2017 1. Bogacz Julia 2. Dobrzyński

Pozew o zaprzeczenie ojcostwa - wzór - prawo

Morawski Kras, Praga

Pismo przewodnie zimowisko KRUS