Izolacja DNA z żelu agarozowego

Izolacja DNA z żelu agarozowego.
1. Wykonanie kolumn.
 Konieczne są dowolne kolumienki np. do oczyszczania plazmidów lub inne pasujące
do "eppendorfek".
 Z kolumienek usunąć złoże i ewentualnie odciąć dolną część lejka.
 Z gęstej tkaniny nylonowej wyciąć kwadracik wielkości około 1 cm 2.
 Rozgrzać dolną część kolumienki nad palnikiem, tak aby plastik zaczął się topić.
 Tak rozgrzaną kolumienkę przyłożyć do kawałka tkaniny nylonowej i odczekać
chwilę, aby kolumna z wtopionym w nią nylonem dobrze wystygła.
 Nylon i nadtopione fragmenty kolumienki można usunąć rozgrzanym skalpelem, tak,
aby kolumna pasowała do eppendorfki.
2. Rozdział DNA prowadzić w niezbyt gęstym (~1%) żelu agarozowym (bufor najlepiej
TAE).
3. Prążki wyciąć za pomocą czystego skalpela. (po użyciu skalpel można opalić nad
płomieniem)
4. Bloczki agarozy z DNA umieścić we wcześniej przygotowanych kolumienkach
umieszczonych w eppendorfkach. Kolumienkę można przykryć kawałkiem folii, aby
bloczek nie wysychał nadmiernie.
5. Wirować kolumny z bloczkami agarozy przez około 10 minut przy obrotach 16000 rpm.
Wirówkę można nastawić na chłodzenie do +4C
6. Po wirowaniu w eppendorfce zbiera się wyciśnięty z bloczka bufor wraz z rozpuszczonym
w nim DNA. Kolumnę wyciągnąć i odstawić. Przygotowanie kolumny do ponownego
użycia opisane niżej.
7. Do eppendorfki z przesączem (lepsze rezultaty gdy przesącz schłodzony) dodać taką samą
lub większą objętość zimnego (-20C) izopropanolu i delikatnie wymieszać przez
obracanie eppendorfki.
8. Zwirować przez 10 minut przy 16000 rpm w +4C (koniecznie).
9. Wylać supernatant dobrze wytrzepując eppendorfkę o ręcznik papierowy.
10. Przemyć 70% etanolem (zimnym).
11. Eppendorfki suszyć (po dokładnym wytrzepaniu resztek etanolu) na ręczniku papierowym.
12. Po dokładnym wysuszeniu pelet rozpuścić TE lub 10 mM Tris o pH ~8 (około 25 l).
13. Aby ponownie użyć kolumny należy:
 Wytrzepać z nich resztki bloczków agarozowych. (nie przejmować się, i tak nie
wypadną w całości i trochę zostanie na siatce)
 Umieścić kolumienki w zlewce z wodą destylowaną tak aby woda dostała się do
środka, nakryć szalką i gotować w kuchence mikrofalowej przez około 30 minut
pilnując aby nie wyparowała woda.
 Czy dokładnie pozbyliśmy się resztek agarozy można sprawdzić pod lupą binokularną.
 W celu ostatecznego pozbycia się resztek DNA kolumny można jeszcze poddać
autoklawowaniu.
 Używać ponownie wysuszone.
Andrzej Stefan Czech