Monoclonal Mouse

MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human CD38/FITC
Anti-Human CD56/RPE
Anti-Human CD19/APC
Nr kat. TC674
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Odczynnik TC674 przeznaczony jest do stosowania w cytometrii przepływowej. Odczynnik jest przeznaczony
do stosowania w identyfikacji komórek wykazujących ekspresję CD38, CD56 i CD19. CD38 stanowi przydatny
marker immunofenotypowania ostrych białaczek. Dodatkowo, przeciwciała przeciw CD38 są cenne
w identyfikacji komórek plazmatycznych, ponieważ słabo zróżnicowane komórki plazmatyczne mogą udawać
inne blastyczne komórki limfoidalne (1). CD56 to prototypowy marker ludzkich komórek NK, występujący także
w podzbiorze limfocytów T z krwi obwodowej wykazujących ekspresję CD4 i CD8 (2). CD19 jest najszerzej
rozpowszechnionym markerem powierzchniowym swoistym dla linii komórkowych limfocytów B i występuje na
powierzchni niemal wszystkich limfocytów B, łącznie ze wczesnymi komórkami progenitorowymi typu B (3).
Ekspresja CD19 utrzymuje się w limfocytach B, które przeszły zwyrodnienie nowotworowe (4). Uważa się, że
przeciwciała skierowane przeciwko CD19 mają kluczowe znaczenie we wstępnej ocenie ostrych i przewlekłych
zaburzeń proliferacji limfocytów (5). Interpretacji wyniku — z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz
wyników innych metod diagnostycznych — powinien dokonać wykwalifikowany patolog.
Dostarczany odczynnik
TC674 składa się z trzech specjalnie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych:
Monoclonal Mouse Anti-Human CD38, Clone AT13/5, sprzężone z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny
(FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD56, Clone C5.9, sprzężone z R-fikoerytryną (RPE).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD19, Clone HD37, sprzężone z allofikocyjaniną (APC).
Trzy koniugaty wchodzące w skład odczynnika TC674 zostały wytworzone z oczyszczonych monoklonalnych
przeciwciał mysich należących do izotypów IgG1, kappa (anty-CD38), IgG2b, kappa (anty-CD56) i IgG1, kappa
(anty-CD19). Odczynnik TC674 dostarczany jest w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy
surowicy wołowej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Każda fiolka zawiera koniugat na 50 testów (20 µL
koniugatu dla leukocytów, w ilości do 106, z prawidłowej ludzkiej krwi obwodowej).
Swoistość
Przeciwciała anti-CD38, AT13/5, opisano podczas warsztatów Sixth International Workshop and Conference on
Human Leucocyte Differentiation Antigens (6. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów
różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD38 została potwierdzona przez wiele laboratoriów (6).
W przypadku stosowania cytometrii przepływowej do komórek „kożuszka” (warstwy włóknika i leukocytów
w górnej części skrzepu) krwi obwodowej oraz bramkowanych populacji limfocytów lub hodowli komórek NK,
Anty-CD56, C5.9, znakuje limfocyty NK. Swoistość przeciwciał anty-CD56 C5.9 odpowiada swoistości
przeciwciała MOC-1 przeciw CD56 (7).
Przeciwciało anty-CD19, HD37,opisano podczas warsztatów Second, Third, Fourth and Fifth International
Workshops and Conferences on Human Leucocyte Differentiation Antigens (2., 3., 4. i 5. międzynarodowe
warsztaty i konferencja na temat antygenów różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD19
została potwierdzona przez wiele laboratoriów (8, 9).
Środki ostrożności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3
z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć
gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą należy nosić odpowiednie osobiste wyposażenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
Przechowywać w ciemności w temperaturze 2–8 °C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na
opakowaniu. Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na ulotce dołączanej do
opakowania, Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących
o niestabilności tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów,
należy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego
nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z odczynnikiem,
należy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Wykonanie odczynu
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej
o wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 20 µL TC674 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
(112934-003)
Dako Denmark A/S
TC674/PL/JLA/2010.10.15 str 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
3.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub przez 15–30 minut
w temperaturze pokojowej (20–25°C).
4.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
5.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
6.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
7.
Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę za pomocą
mieszadła wibracyjnego.
8.
Powtórzyć etap 6.
9.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
10.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności
i temperaturze 2–8°C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie
wykonywania odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne
w celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą
się zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone
indywidualnie w każdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do izotypów i fluorochromów sprzężonego przeciwciała.
Etapy 4 i 5: Jeśli używany jest inny odczynnik do lizy komórek, należy przy jego doborze kierować się
poniższymi zaleceniami. Należy zauważyć, że jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza (np.
Dako EasyLyse™, nr kat. S2364), PBS w kroku 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba że próbka
zostanie przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 10: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej liczby komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca
ekspresji antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru.
Dzięki minimalnemu nakładaniu się pasm emisyjnych fluorochromów FITC, RPE i APC, ich połączenie
umożliwia wyjątkowo łatwą analizę.
Piśmiennictwo
(112934-003)
Dako Denmark A/S
1.
Leong AS-Y, Cooper K, Leong FJW-M. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. London:
Oxford University Press; 1999. p. 87-8.
2.
Poggi A. CD56. CD Guide. In: Mason D, André P, Bensussan A, Buckley C, Civin C, Clark E, et al.,
editors. Leucocyte typing VII. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 7th International
Workshop and Conference; 2000 Jun 19-23; Harrogate, United Kingdom. New York: Oxford University
Press Inc.; 2002. p. 805-6.
3.
Pezzutto A, Dörken B, Rabinovitch PS, Ledbetter JA, Moldenhauer G, Clark EA. CD19 monoclonal
antibody HD37 inhibits antiimmunoglobulin-induced B cell activation and proliferation. J Immunol
1987;138:2793-9.
4.
Sato S, Tedder TF. BC3. CD68 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG,
Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation
antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan.
New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 133-5.
5.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate
hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.
6.
Morra M, Deaglio S, Mallone R, di Rosa G, Tibaldi E, Zini G, et al. BC10. CD68 workshop panel report.
In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors.
Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop
and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p.
151-4.
7.
Costa P. NK4. CD68 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert
SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens.
Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New
York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 271-2.
8.
Nadler LM. B cell/leukemia panel workshop: summary and comments. In: Reinherz EL, Haynes BF,
Nadler LM, Bernstein ID, editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the 2nd International Workshop on
Human Leukocyte Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston, USA. New York, Berlin, Heidelberg,
Tokyo: Springer-Verlag; 1986. Volume 2. p. 3-43.
9.
Mason DY, Ladyman H, Gatter KC. Immunohistochemical analysis of monoclonal anti-B cell antibodies.
In: Reinherz EL, Haynes BF, Nadler LM, Bernstein ID, editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the
TC674/PL/JLA/2010.10.15 str 2/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
2nd International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston,
USA. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo: Springer-Verlag; 1986. Volume 2. p. 245-55.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
W
y
d
i
a
r
g
ó
b
n
m
o
s
e
t
d
y
k
y
i
c
i
n
z
n
v
y
i
t
d
r
Temperatura przechowywania
o
o
Chronić przed słońcem (patrz
s
e
k
c
j
a
n
t
.
p
r
z
e
c
h
o
w
y
w
a
n
i
a
Zużyć przed
Producent
)
Sprawdzić w instrukcji
N
s
t
o
s
o
w
a
(112934-003)
Dako Denmark A/S
n
i
u
m
e
r
s
e
r
i
i
a
TC674/PL/JLA/2010.10.15 str 3/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17