REDUKTAZA GLUTATIONOWA
Transkrypt
REDUKTAZA GLUTATIONOWA
REDUKTAZA GLUTATIONOWA ZESTAW ODCZYNNIKÓW TYLKO DO ZASTOSOWAŃ BADAWCZYCH Składniki Nr kat. GR 2368 5 x 5 ml 1. Bufor 2. Substrat 3. NADPH 1x 5x 5x 70 ml 5 ml 3 ml ZNACZENIE KLINICZNE Oznaczanie reduktazy glutationowej (Glutathione Reductase) znalazło zastosowanie przy wykrywaniu chorób wątroby i złośliwych zmian nowotworowych, oceny sposobu Ŝywienia (stanu ryboflawiny - witaminy B2) i wykrywaniu uwarunkowanych genetycznie stanów deficytów (deficjencji). NB. NaleŜy zachować ostroŜność, aby mieć pewność, Ŝe ujawnione stany niedoborów enzymatycznych nie są spowodowane ubytkiem ryboflawiny. (1) Zasada Oznaczenia Reduktaza glutationowa jest katalizatorem redukcji glutationu (GSSG) w obecności NADPH, który ulega utlenieniu + i przemianie w NADP . Wielkością mierzoną jest zmniejszenie absorbancji dla światła o długości fali 340 nm. + NADPH + H + GSSG GR + NADP + 2 GSH (GSH = Zredukowany Glutation) PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Surowica krwi, osocze lub erytrocyty. Przygotowanie erytrocytów. Objętość 0.5 ml pełnej krwi odwirowywać przez 5 min przy prędkości 2000 obr./min. Oddzielić osocze i koŜuszek leukocytarny (buffy coat), zwracając uwagę na to, aby nie usunąć zbyt wielu erytrocytów, co powodowałoby ryzyko uzyskania próbki komórek, która nie byłaby reprezentatywna dla danego materiału. Trzykrotnie wypłukać erytrocyty zawieszając je w 0.9% NaCl, odwirowując przez 5 min przy prędkości 2000 obr./min po kaŜdym płukaniu. Spowodować lizę komórek zawieszając je w zimnej redestylowanej H20, tak aby objętość wynosiła 0.5 ml. Odstawić na 10 min w miejsce o temperaturze od +2 do +8°C. Lizat odwirowywać przez 5 min przy prędkości 2000 obr./min w celu usunięcia zrębu (stroma). Objętość 100 l lizatu rozpuścić w 1.9 ml 0.9% roztworu NaCl w celu przeprowadzenia oznaczenia. 1. Bufor Fosforan potasu EDTA 2. Substrat GSSG 3. NADPH StęŜenia w teście 250 mmol/l pH 7.3 0.5 mmol/l 2.2 mmol/l 0.17 mmol/l Wymieszać i jednocześnie uruchomić czasomierz. Pomiar początkowej absorbancji przeprowadzić po 1 minucie. Pomiar powtórzyć ponownie po 2, 3, 4 i 5 minutach. OBLICZENIA Aktywność reduktazy glutationowej moŜe być obliczona na podstawie wzoru podanego poniŜej: U/l = 4983 x -A 340 nm/min PROCEDURA DLA ERYTROCYTÓW ŚRODKI OSTROśNOŚCI I OSTRZEśENIA Tylko do prowadzenia badań diagnostycznych w warunkach in vitro. Nie pipetować przy uŜyciu ust. Zachować typowe środki ostroŜności obowiązujące przy kontakcie z odczynnikami stosowanymi w warunkach laboratoryjnych. Długość fali światła: Kuweta: Temperatura: Pomiar: Na Ŝądanie dostępne są arkusze danych dotyczących zdrowia i bezpieczeństwa Health and Safety Data Sheets. Pipetować do kuwety Odczynniki mogą być uŜywane tylko zgodnie z ich przeznaczeniem, przez odpowiednio wykwalifikowany personel laboratoryjny, w odpowiednich warunkach laboratoryjnych. STABILNOŚĆ I PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW REAKCJI 1. Bufor Zawartość gotowa do uŜycia. Zachowuje stabilność do upływu daty waŜności, pod warunkiem, Ŝe jest przechowywany w temperaturze od +2 do +8°C. 2. Substrat Zrekonstytuować zawartość jednej fiolki substratu 2 przy uŜyciu 5 ml bufora 1. Zachowuje stabilność przez 2 dni, pod warunkiem, Ŝe jest przechowywany w temperaturze od +2 do +8°C. 3. NADPH Zrekonstytuować jedną fiolkę NADPH 3 przy uŜyciu 3 ml redestylowanej H20. Zachowuje stabilność przez 2 dni, pod warunkiem, Ŝe jest przechowywany w temperaturze od +2 do +8°C. PROCEDURA DLA SUROWICY/OSOCZA Długość fali: Kuweta: Temperatura: Pomiar: 340 nm droga światła 1 cm 37°C względem powietrza Pipetować do kuwety Próbka Substrat 40 l 1000 l Dobrze wymieszać. NADPH 200 l 340 nm droga światła 1 cm 37ºC. względem powietrza 40 µl 1000 µl Rozcieńczony lizat Substrat Dobrze wymieszać 200 µl NADPH Wymieszać i jednocześnie uruchomić czasomierz. Pomiar początkowej absorbancji przeprowadzić po 1 minucie. Pomiar powtórzyć ponownie po 2, 3, 4 i 5 minutach. OBLICZENIA Aktywność reduktazy glutationowej moŜe być obliczona na podstawie wzoru podanego poniŜej: a) b) U/l pełnej krwi = 4983 x -A 340 nm/min x Współczynnik Rozcieńczenia (20) Przeprowadzić konwersję do u/g Hemoglobiny Przykład Stwierdzono, Ŝe próbka zawiera hemoglobinę, której poziom wynosi 16 g/dl lub 160 g/l. Wartość reduktazy glutationowej: 1488 U/l. Stąd wartość dla próbki = 1488 ─── = 160 9.3 u/gHb INSTRUKCJA - REDUKTAZA GLUTATIONOWA - GR 2368 Strona 2 / 2 KONTROLA JAKOŚCI W celu uzyskania kontroli dokładności i powtarzalności:Zalecamy uŜycie kontrolnych surowic reduktazy glutationowej Randox Glutathione Reductase Control Sera GR 2608. SPECYFICZNOŚĆ Reduktaza Glutationowa wykazuje wysoką specyficzność dla Glutationu (GSSG). (2) ZAKRES REFERENCYJNY Osocze/Surowica 33 - 73 U/l Erytrocyty 4.7 -13.2 U/gHb Zaleca się, aby kaŜde laboratorium określiło swój własny zakres prawidłowy, poniewaŜ mogą występować lokalne róŜnice. LINIOWOŚĆ JeŜeli zmiana absorbancji na minutę przekracza 0.06 przy długości fali światła 340 nm, wówczas 0.1 ml próbki naleŜy rozcieńczyć przy uŜyciu 0.9 ml bufora 1. Wynik pomnoŜyć przez 10. CZUŁOŚĆ Jako wartość progową wykrywania naleŜy przyjąć poziom 10 U/l. LITERATURA 1. Goldberg D.M. & Spooner RJ (1983) w „Methods of rd Enzymatic Analysis” (Bergmeyen, H.V. Ed.) 3 edn. vol 3, pp 258-265, Verlog Chemie, Deerfield Beach, Fl. 2. Melissinos, K.G.,Delidov, A.Z., Varsov, A.G., Begietti, S.S., Drivas, G.J., Nephron, 28: 76-79, (1981). Wersja zweryfikowana 18/10/00AM RANDOX Laboratories Ltd., Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom, BT29 4QY Tel:CRUMLIN(028) 9442 2413 Telex:748135 RANDOX G Fax.No.INT.44 28 9445 2912 UK(028) 9445 2912 abcd abc