Część III - Wydział Chemii UW
Transkrypt
Część III - Wydział Chemii UW
Synteza związków znakowanych i ich zastosowanie w chemii organicznej, biochemii i medycynie Część III Prof. dr hab. Marianna Kańska IZOTOPOWE METODY BADANIA MECHANIZMÓW REAKCJI Ustalenie mechanizmów reakcji jest jednym z bardzo ważnych zadań fizykochemii organicznej, która ułatwia zrozumienie i sterowanie złożonymi syntezami związków biologicznie czynnych. Znajomość mechanizmów reakcji ułatwia odtworzenie in vitro przebiegu syntez, zachodzących in vivo w organizmach żywych, oraz opracowanie nowych dróg syntezy bardzo skomplikowanych związków organicznych. W badaniach mechanizmów reakcji stosuje się różne metody eksperymentalne, a wśród nich również metody izotopowe. W chemii organicznej można wyróżnić trzy metody, gdzie stosuje się znakowanie izotopami zarówno promieniotwórczymi, jak i stabilnymi. 1. Metoda wskaźników izotopowych, która umożliwia w warunkach laboratoryjnych lub in vivo prześledzenie drogi interesującego nas atomu, lub stabilnych grup atomów, w cząsteczce biorącej udział w reakcji organicznej lub bioorganicznej. 2. Metoda specyficznej wymiany izotopowej, która jest stosowana w radiochemii i znajduje szerokie zastosowanie w syntezie znakowych związków organicznych oraz w badaniu trwałości wiązań. Dzięki tej metodzie ustalono, które atomy wodoru w cząsteczce organicznej są labilne i wymieniają się miejscami z wodorami labilnymi cząsteczek rozpuszczalnika zawierającymi wodory np. w grupach aminowych, hydroksylowych, czy merkaptanowych. Takie radiochemiczne wstępne informacje są często wykorzystywane w syntezach związków organicznych znakowanych metodą wymiany izotopowej. Istnieje bogata literatura na temat wymian izotopowych, a mimo to metoda ta w dalszym ciągu jest wykorzystywana do ustalania struktury skomplikowanych związków organicznych 3. Metoda kinetycznego efektu izotopowego, KEI- (Kinetic Isotope Effect, KIE), która polega na wyznaczeniu stałych szybkości przebiegających reakcji z użyciem cięższego i lżejszego izotopu. Najczęściej wyznaczane są KEI deuteru, trytu i węgla. Cząsteczka chemiczna, wykorzystywana w tych badaniach, jest znakowana izotopem w ściśle określonym miejscu. Korelacja między doświadczalnie zmierzonym, a teoretycznie wyliczonym KEI jest jedną z najlepszych metod do wyjaśnienia struktury i detali kompleksu aktywnego, a także zmian, jakie zachodzą w wiązaniu w trakcie przechodzenia od substratu do produktu. Metoda KEI jest szczególnie użyteczna, kiedy do badania mechanizmu danej reakcji używa się kolejno substratów znakowanych w różnych pozycjach, przy których mogą występować zmiany w wiązaniach chemicznych. Dodatkowych cennych szczegółów może dostarczyć użycie substratu z różnymi podstawnikami, indukującymi zmiany w otoczeniu wiązań ulegających przekształceniu w trakcie badanego procesu. Mechanizm reakcji Mechanizm opisuje przebieg reakcji chemicznej. Mówi on o tym: a) które wiązania ulegają pęknięciu, b) jakie wiązania się się tworzą, c) jaka jest kolejność tych zjawisk, d) z ilu etapów składa się rozpatrywany proces, e) jakie są względne szybkości poszczególnych etapów Poznanie odpowiedzi na te pytania jest często bardzo trudnym zadaniem. Szczególnie może to być skomplikowane w przypadku reakcji enzymatycznych, ze względu na złożoną strukturę enzymu i zachodzące procesy katalityczne. Metody wyznaczania mechanizmów reakcji 1. Badanie produktów produktów reakcji: • identyfikacja, • dowody stereochemiczne. 2. Badanie produktów pośrednich: • izolacja produktów pośrednich, • wykrywanie produktów pośrednich (metody spektroskopowe i rezonansowe), • wychwycenie produktów pośrednich (przy założeniu, że produkt pośredni będzie reagować z danym reagentem dając ściśle określony produkt), • dodatek oczekiwanego produku pośredniego. 3. Badania kinetyczne: • równanie kinetyczne (mechanizm musi objaśniać obserwowane równanie i rząd reakcji), • badania katalizy (również inhibicji), • efekty izotopowe. 4. Stosowanie cząsteczek znakowanych izotopowo (analiza produktów takimi technikami, jak MS, NMR itp.). Kinetyczny efekt izotopowy k1 A + 1 B ------------→ A1B k2 A + 2 B ------------→ k1 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego ( 1B) k2 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego ( 2B) k1 = 1 k2 k1 1 k2 k1 1 k2 nie ma KIE jest KIE odwrotny KIE A2B Kinetyczny efekt izotopowy Jednym z najpotężniejszych narzędzi w badaniu mechanizmów reakcji jest metoda kinetycznego efektu izotopowego. Jest ona bardzo często stosowana do badania mechanizmów reakcji enzymatycznych. Teoretyczne wyjaśnienie kinetycznych efektów izotopowych jest złożonym i trudnym zadaniem. Z praktycznego punktu widzenia istotne jest jedynie uzmysłowienie sensu fizycznego tego zjawiska. Zastąpienie atomu pierwiastka, w cząsteczce związku biorącym udział w reakcji, na jego cięższy izotop często powoduje zmianę szybkości reakcji. Różna szybkość tych dwóch reakcji jest nazywana kinetycznym efektem izotopowym i określa się ją jako stosunek stałych szybkości: kiz. lżejszego / kiz. cięższego Różnica ta wynika z tego, że energia oscylacyjna wiązania chemicznego na najniższym możliwym poziomie (zero-point energy) nie jest zerowa (wynosi: E = hυ) i zależy od masy zredukowanej: µ= m1m 2 m1 + m 2 zgodnie z prawem Hook’a: υ ≈ 1 2 k µ (k- stała siłowa niezależna od masy). Z tego wynika że wiązanie z cięższym izotopem będzie miało niższą energię oscylacji i rozerwanie wiązania będzie wymagało większej energii. Obrazowo przedstawiono to na poniższym schemacie: Energia dysocjacji wiązań C-H i C-D Ta właśnie różnica w energiach dysocjacji jest powodem różnych szybkości procesów z udziałem izotopów. Efekt izotopowy obserwujemy jedynie wówczas, gdy rozpatrywany etap jest wystarczająco wolny, aby mieć decydujący wpływ na szybkość całego procesu. Kinetyczne efekty izotopowe. Najważniejsze kryteria podziału. 1. Podział KEI ze względu na wielkość stosunku k is.lighter k is. heavier • efekty normalne, występują wówczas gdy szybkość reakcji dla związku z izotopem lżejszym jest większa niż dla związku z izotopem cięższym k is.lighter k is.heavier >1 • brak efektu izotopowego k is.lighter k is.heavier =1 • efekty odwrotne (obserwowane rzadko) gdy: k is .lighter k is .heavier <1 Metody wyznaczania mechanizmów reakcji 1. Badanie produktów produktów reakcji: • identyfikacja, • dowody stereochemiczne. 2. Badanie produktów pośrednich: • izolacja produktów pośrednich, • wykrywanie produktów pośrednich (metody spektroskopowe i rezonansowe), • wychwycenie produktów pośrednich (przy założeniu, że produkt pośredni będzie reagować z danym reagentem dając ściśle określony produkt), • dodatek oczekiwanego produku pośredniego. 3. Badania kinetyczne: • równanie kinetyczne (mechanizm musi objaśniać obserwowane równanie i rząd reakcji), • badania katalizy (również inhibicji), • efekty izotopowe. 4. Stosowanie cząsteczek znakowanych izotopowo (analiza produktów takimi technikami, jak MS, NMR itp.). 3. Podział KEI ze względu na położenie znacznika izotopowego w stosunku do miejsca w cząsteczce, gdzie zachodzi etap determinujący szybkość reakcji: a) pierwszorzędowe, b) α−drugorzędowe c) β−drugorzędowe Na przykładzie mechanizmu E1 można wyjaśnić te efekty. Według tego mechanizmu, najwolniejszym etapem jest rozerwanie wiązania pomiędzy atomem węgla a grupą X (odchodzącą), co prowadzi do utworzenia karbokationu. Ten etap będzie decydował o szybkości całego procesu. W związku z tym podstawienie atomu 12C1 izotopem 14C spowolni reakcję. Taki efekt izotopowy jest nazywany efektem pierwszorzędowym. Analogicznie dla wodoru H2 wystąpi efekt α−drugorzędowy, a dla wodoru H3 wystąpi efekt β−drugorzędowy. 3 H H 2 3 H C C1 X wolno H H 2 + H C C1 H H H H 3 H H 2 + H C C1 szybko H H Mechanizm E1 H 3 H C C1 H H 2 4. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe • substratowe – występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratu powoduje zmianę szybkości reakcji, • rozpuszczalnikowe – występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np. • z H2O na D2O powoduje zmianę szybkości reakcji. 5. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie w zmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych: kinetyczne efekty izotopowe na Vmax kinetyczne efekty izotopowe na Vmax /Km 4. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe • substratowe – występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratu powoduje zmianę szybkości reakcji, • rozpuszczalnikowe – występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np. • z H2O na D2O powoduje zmianę szybkości reakcji. 5. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie w zmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych: kinetyczne efekty izotopowe na Vmax kinetyczne efekty izotopowe na Vmax /Km METODY WYZNACZANIA KINETYCZNYCH EFEKTÓW IZOTOPOWYCH 1. Bezpośrednie wyznaczanie kinetycznych efektów izotopowych. 2. Metoda zaburzeń równowagi. 3. Metody z użyciem spektrometrii mas. Wyznaczanie KIE wg równań Bigeleisena i Wolsgerga R0 + 1 R ) ln(1 − f ∗ 0 ) Rp + 1 Rp α = ≈ R ∗ f ∗ ( R0 + 1) ln(1 − f ) ln[1 − p ] R0 ∗ ( R p + 1) ln(1 − f ∗ (1 − f ) ∗ ( R0 + 1) (1 − f ) ∗ R0 ln Rs + 1 Rs α = ≈ R ∗ (1 − f ) ∗ ( R0 + 1) ln(1 − f ) ln s R0 ∗ ( Rs + 1) ln f ∗ ( R p − Rs ) f ∗ ( R p − Rs ) 1 1 ln[ − ] ln[ − ] 1 − f (1 − f ) ∗ ( R p + 1) 1− f (1 − f ) ∗ R p α = ≈ f ∗ ( R p − Rs ) f ∗ ( R p − Rs ) 1 1 ln[ − ] ln[ − ] 1 − f (1 − f ) ∗ Rs ∗ ( R p + 1) 1 − f (1 − f ) ∗ Rs ∗ R p ln α = ln R p − Rs ( R p − R0 ) ∗ Rs ( R p − Rs ) ∗ R0 - R0 - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w substracie przed rozpoczęciem reakcji, - Rp - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w produkcie w chwili, gdy stopień przereagowania wynosi f, - Rs - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w substracie, gdy stopień przereagowania wynosi f, - f - stopień przereagowania. - α - kinetyczny efekt izotopowy, R p − R0 Badanie mechanizmu elektrofilowej substytucji w pierścieniu aromatycznym H (1) ArH + Y Ar Powoli; etap określajacy szybkość reakcji Y H (2) Ar + Z ArY + Szybko H: Z Y H (1a) ArH + Y Ar ArY + H Y Mechanizm elektrofilowej substytucji w pierścieniu aromatycznym Badanie mechanizmu elektrofilowej substytucji w pierścieniu aromatycznym Znajomość efektu izotopowego oraz ogólna znajomość przyczyn jego występowania, stwarza możliwość wyjaśnienia, dlaczego ten efekt interesuje chemika organika. Z dotychczasowych ustaleń eksperymentalnych, dotyczących reakcji elektrofilowej substytucji w związkach aromatycznych, wynika, że zachodzą one według jednego mechanizmu, niezależnie od rodzaju reagenta biorącego w niej udział. Dla reagenta YZ ogólny mechanizm tej reakcji można zapisać następująco: H (1) ArH + Y Ar Powoli; etap określajacy szybkość reakcji Y H (2) Ar + Z ArY + H:Z Szybko Y Mechanizm elektrofilowej substytucji w pierścieniu aromatycznym Mechanizm obejmuje dwa zasadnicze etapy: Etap (1) – atak reagenta elektrofilowego na pierścień z utworzeniem karbokationu oraz etap (2) – oderwanie protonu od karbokationu przez dowolną zasadę. Pytanie skąd wiadomo, że elektrofilowa substytucja w pierścieniu aromatycznym obejmuje dwa etapy, a nie tylko jeden. H (1a) ArH + Y Ar ArY + H Y Oraz skąd wiadomo, że pierwszy z dwóch etapów [etap (1)] przebiega znacznie wolniej niż [etap (2)]? Odpowiedź uzyskano w wyniku serii badań rozpoczętych przez Melandera (z Instytutu Chemii im. Nobla w Sztokholmie) i prowadzonych także przez wielu innych badaczy. Różnorodne związki aromatyczne znakowane atomami deuteru i trytu w pierścieniu aromatycznym poddano nitrowaniu, bromowaniu i alkilowaniu metodą Friedla-Craftsa. Stwierdzono, że w reakcjach tych następuje wymiana atomów deuteru lub trytu z taką samą szybkością jak atomów zwykłego wodoru (protu). Również nie zaobserwowano wyraźnego efektu izotopowego. Wiadomo, że wiązanie węgiel-deuter ulega rozerwaniu wolniej niż wiązanie węgiel-prot, a wiązanie węgiel-tryt jeszcze wolniej. Jak więc możemy interpretować fakt, że nie stwierdza się w tym przypadku efektu izotopowego? Jeżeli szybkości substytucji różnych izotopów wodoru są taki same, może to tylko oznaczać, że w reakcjach, których szybkość porównujemy, nie następuje rozerwanie wiązania węgiel-wodór. Interpretacja ta jest zgodna z przyjętym mechanizmem. Powolne przyłączenie reagenta elektrofilowego określa szybkość całego procesu substytucji. Powstający karbokation szybko traci jon wodorowy i przekształca się w cząsteczkę produktu. Etap (1) jest etapem określającym szybkość reakcji. W etapie tym nie następuje rozerwanie wiązania węgiel-wodór, dlatego szybkość tego etapu, a więc szybkość całej reakcji, nie zależy od rodzaju izotopu wodoru, który znajduje się w pierścieniu. Gdyby reakcja substytucji obejmowała etap (1a), to musiał by on być etapem określającym szybkość reakcji, a ponieważ następowałoby w nim rozerwanie wiązania węgiel-wodór, powinniśmy zaobserwować kinetyczny efekt izotopowy. Gdyby natomiast etap (2) w sekwencji dwuetapowej przebiegał dostatecznie wolno w porównaniu z etapem (1), wówczas musiałby on wpływać na całkowitą szybkość reakcji i ponownie należałoby się spodziewać wystąpienia KEI. Badanie mechanizmu kondensacji Dieckmana Reakcja kondensacji Dieckmana polega na katalizowanej przez zasadę cyklizacji wewnętrznej estru dikarboksylowego do β-ketoestru CH2COOR CH2COOR B - CHCOOR (1) CH2 C O OR (2) O O OR O OR O (3) OR Mechanizm kondensacji Dieckmana Każdy z trzech etapów może określać kinetykę procesu. Problem który z etapów jest kinetycznie istotnym, rozwiązano znakując kolejno ester węglem grupie karbonylowej. 14 C, raz w grupie metylenowej, drugi raz w 1. Jeżeli etap (1) jest istotny kinetycznie, wtedy powinniśmy obserwować KEI 14 C w grupie metylenowej oraz brak KEI 14C w grupie karbonylowej. 2. Jeżeli etap drugi jest istotny kinetycznie, wtedy powinniśmy obserwować KEI zarówno dla węgla w grupie metylenowej jak i w grupie karbonylowej, gdyż w stanie przejściowym tego etapu ulegają zmianie wiązania chemiczne przy obu tych węglach. 3. Jeżeli etap trzeci jest istotny kinetycznie, wtedy w stanie przejściowym reakcji wiązania chemiczne przy węglu grupy metylenowej nie ulegają zmianie. W tym przypadku KEI 14C grupy karbonylowej powinien być obserwowany. Pomiary doświadczalne wykazały istnienie kinetycznego efektu izotopowego zarówno dla węgla metylenowego i dla węgla z grupy karbonylowej; Grupa metylenowa; k12/k14 = 1,089 Grupa karbonylowa; k12/k14 = 1,084 Oznacza to, że etap drugi tj. tworzenie nowego wiązania węgiel – węgiel decyduje o kinetyce reakcji. Badanie mechanizmu reakcji addycji elektrofilowej chlorku 2,4 dinitrobenzenosulfenowego do styrenu i jego para pochodnych w środowisku kwasu octowego R β α Z 1 ArSX R R β X α ArS β Z 2 Ar α S X R β Ar α Z Z 3 4 S X R X ArS Z Mechanizm reakcji addycji elektrofilowej chlorku 2,4-dinitrobenzenosulfenowego Jeżeli reakcje addycji chlorku 2,4-dinitrobenzenosulfenylowego do styrenu i jego para pochodnych prowadzi się w kwasie octowym, to wiadomo, że reakcja przebiega zgodnie z regułą Markownikowa i dodatnia część cząsteczki chlorku 2,4-dinitrobenzenosulfenowego przyłącza się do βC natomiast ujemny chlor przyłącza się do αC i powstają odpowiednie siarczki chloro fenyloetylowo-2,4dinitrofenylowe. Powstaje pytanie, jaką strukturę posiada kompleks aktywny powstający w etapie określającym szybkość reakcji w reakcji elektrofilowej? Prezentowany schemat zawiera trzy różne struktury stanów przejściowych dające ten sam produkt końcowy. Na temat reakcji elektrofilowej addycji do nienasyconych węglowodorów ukazało się wiele prac, ale nie było jednomyślności jaką strukturę ma kompleks aktywny. Problem ten mógł być rozwiązany przez 14 wyznaczenie KEI C w pozycji α- i β-styrenów zawierających elektronodonorowe i elektronoakceptorowe podstaw\niki. Przewidziano, że jeżeli kompleks aktywny posiada strukturę (2) to powinniśmy obserwować kinetyczny efekt izotopowy dla βC, ponieważ tworzy się wiązanie z siarką tylko przy tym węglu. Natomiast jeżeli kompleks aktywny posiada strukturę (3) bądź (4) wówczas powinniśmy obserwować KEI dla αC i dla βC. Badania doprowadziły do wyznaczenia KEI dla αC i βC następujących dla kolejno podstawionych styrenów: C β C α p-CH3; p-H; p-Cl; k/kα = 1,004; 1,022; 1,027 p-CH3; p-H: p-Cl; k/kβ = 1,037; 1,032; 1,035 Oznaczenia wartości k/kα i k/kβ wykazały, że kinetyczny efekt izotopowy dla węgla 14C jest zależny od miejsca podstawienia izotopowego oraz od charakteru podstawników w pierścieniu aromatycznym. Wyznaczona wartość k/kβ dla βC jest dość duża i nie zależny od charakteru podstawników w pozycji para pierścienia. Natomiast k/k α jest zależny od charakteru podstawnika. Wyraźnie mały kinetyczny efekt izotopowy węgla 14C w reakcji addycji ArSCl do styrenu, posiadający elektronodonorowy podstawnik w pozycji para pierścienia aromatycznego, sugeruje, że struktura stanu przejściowego jest zbliżona do struktury otwartej karbokationu (2), w której dodatni ładunek jest zlokalizowany przy węglu α. Wiązanie βC-S tworzy się niezależnie od mechanizmu i dlatego jest jasne, że KEI występuje i jego wartość nie zmienia się, niezależnie od tego jaki podstawnik jest w pierścieniu aromatycznym. Jeśli aktywny kompleks miałby strukturę (3) lub (4) to utworzone wiązanie pomiędzy αC i siarką powinno być taki samo lub podobne i wówczas KEI dla αC powinien być podobny. Im silniejsze jest wiązanie αC-S tym większy powinien być KEI. Jeżeli ładunek dodatni na αC jest bardziej zdelokalizowany w pierścieniu wówczas wiązanie αC-S jest bardzo słabe lub go nie ma i wtedy jest brak kinetycznego efektu izotopowego. Jeżeli podstawnik jest elektronodonorowy (-CH3), to wolna para elektronowa jest do pewnego stopnia zdelokalizowana, co powoduje zwiększenie chmury elektronowej pierścienia, a następnie osłabienie ładunku dodatniego przy αC. Wiązanie αC-S jest wtedy bardzo słabe i w konsekwencji tego KEI jest bardzo mały. Obecność chloru w pozycji para pierścienia powoduje, że gęstość elektronowa w pierścieniu jest mniejsza niż w cząsteczce styrenu i dlatego też wiązanie αC-S jest silniejsze i KEI jest większy. A więc jeżeli podstawnik jest elektronodonorowy, to aktywny kompleks ma strukturę (2). Jeżeli podstawnik jest elektronoakceptorowy, to aktywny kompleks ma strukturę (3) lub (4). Reasumując, struktura kompleksu aktywnego powstającego w etapie określającym szybkość reakcji zależy od budowy podstawnika znajdującego się przy podwójnym wiązaniu. Badania mechanizmu reakcji eliminacji bromu z kwasów dibromocynamonowych do odpowiednich kwasów cynamonowych I etap: Br COOH R Br COOH + KI + KBr R II etap: KJ + IBr › I2 + KI › KBr + I2 KI3(KI, J2) + IBr Mechanizm eliminacji kwasu para metylo[(2R),(3S)]-dibromocynamonowego COOH Br Br Br wolno CH3 COOH COOH szybko CH3 CH3 Mechanizm eliminacji kwasu para metylo[(2R),(3S)]-dibromocynamonowego E 1 (jednocząsteczkowy)? Br α β COOH Br α - Br COOH Br β - R R - - Br , - Br - Br + α COOH β R + E 2 (zsynchronizowany)? Badania wykazały, że kinetyczny efekt izotopowy 14C występuje w pozycjach α, β, oraz jest zależny od miejsca podstawienia izotopowego i od charakteru podstawnika w pierścieniu aromatycznym. Gdy: R = H, p-CH3, oraz p-NO2 wtedy (k12\k14) w pozycji α wynoszą odpowiednio: 1,05226; 1,0094; 1,0233. Natomiast (k12\k14) w pozycji β dla podstawników R = p-CH3 i H wynoszą odpowiednio: 1,072; 1,0483 Wnioski dotyczące mechanizmu reakcji eliminacji bromu z kwasu [(2R),(3S)]-dibromocynamonowego Zakładany mechanizm E1 (jednocząsteczkowy) E2 (zsynchronizowany) KEI k/α k k/β k k / *k nie tak nie tak tak nie Badanie mechanizmu eliminacji amin z soli p-nitrofenylo-2-etylo-N,N,Ntrimetyloamoniowej i n-propylo-N,N,N-trimetyloamoniowej Reakcje eliminacji, badane metodą KEI z zastosowaniem ciężkich atomów zachodziły głownie według mechanizmu E1 i E2. W związku z tym prowadzone badania były głównie ukierunkowane w stronę wyznaczenia trwałości wiązań przy βC-H i αC-X. Skomplikowana natura takiej reakcji została wyjaśniona na przykładzie wyznaczenia KEI dla kolejno znakowanych związków w trakcie rozkładu soli npropylo-N,N,N-trimetyloamoniowej oraz p-nitrofenylo-2-etylo-N,N,N-trimetyloamoniowej α R CH CH2 NMe3 T β B β - R CH − α CH2 δ + NMe3 δB T α β R CH CH2 + NMe3 + BT Mechanizm eliminacji soli amoniowych do styrenu Badano kinetyczny efekt izotopowy dla węgla 14C, wodoru i azotu. W literaturze występują znaczne różnice w wyznaczonych efektach izotopowych przez dwie oddzielne grupy badawcze. Pierwsza grupa dla podstawnika R = CH3 otrzymała: oraz k/kβ = 1,036 dla 14C w pozycji β, k/kα = 1,069 dla 14C w pozycji α, kH/kT = 2 dla trytu w pozycji β. Reakcja ta była prowadzona w temperaturze 50 oC. Ponadto wyznaczono KEI dla reakcji w tych samych warunkach z podstawnikiem R = p-NO 2C6H4 dla 14C w pozycji α, gdzie otrzymano: k/kα = 1,026. Z tego widać, że występujące znaczne efekty izotopowe przy αC, βC i βH wpływają na etapy determinujące szybkość reakcji. Druga grupa badawcza dla podstawnika R = p-NO2C6H4 wyznaczyła kinetyczny efekt izotopowy: k/kα = 1,078 dla14C w pozycji 2, k14/k15 = 1,024 dla azotu, H T i k /k = 2,12 dla trytu w pozycji β. Reakcję prowadzono w temperaturze 100 oC. Przyczyna tych rozbieżności nie jest znana, ale autorzy wyciągają podobne wnioski, że zmiany wiązań przy N, αC,βC i βH decydują o szybkości reakcji. Badanie mechanizmu reakcji dehydrohalogenacjii R β α C CCl3 R R para podstawiony 2,2-difenylo-1,1,1-trichloroetan α β CH2 CH2Cl para podstawiony 1-chloro-2-fenyloetan R β α CH2 CH2 NMe3 Br bromek para podstawiony 2-fenyloetylo-N,N,N-trimetyloamoniowy R α β CH CH3 Cl para podstawiony 1-chloro-1-fenyloetan Badanie mechanizmu reakcji dehydrohalogenacjii Zaproponowany mechanizm reakcji dehydrohalogenacji przedstawia poniższy schemat R CH3O H β C R - α CCl2 E1cb ? β C - CH3OH wolno Cl R R - Cl α CCl2 - β C szybko α CCl2 Cl R R zsynchronizowany E2 - CH3OH, - Cl- Przed dokładnym przebadaniem reakcji dehydrohalogenacji sądzono, że przebiega ona w środowisku zasadowym według mechanizmu E1cB, ale nie wykluczono również mechanizmu podobnego do E2. W związku z czym przebadano proces eliminacji z użyciem czterech uprzednio podanych układów. Zakładany mechanizm eliminacji amoniaku i odtworzenie miejsca aktywnego O Enzym O O N NR a) Enzym N Enzym NR N b) NH2 + + NH2 CO2- NR + CO2- CO2- + NH3 c) a) Addycja Michaela b) β − eliminacja c) odtworzenie dehydroalaniny przez O β -eliminację Enzym N NR + NH3 Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany przez Havir’a i Hanson’a + B B: H B: O H2N N H Ph HRe H Si OH Ph HRe H Si N H B:- N H H COO- H2N Ph N H H2N N H H H H COO- N H H H B: OH + B: HB - + H COO- HRe HB Ph OH N H H2N N H H H COO- Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany przez Schuster’a i Retey’a H N OH OH + H N N H H ReHSi N H H ReHSi COO + COO + H3N H + H3N H H N :B OH + HB N H COO H N OH + N H + HB COO + H3N H NH3 Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji 3-pro-S L-tyrozyny Liaza fenyloalaninowa katalizuje również eliminację amoniaku z L-tyrozyny, co pozwala na zbadanie wpływu grupy elektrodonorowej na wielkość kinetycznego efektu izotopowego w tej reakcji. Nie można jednocześnie wykluczyć, że reakcja eliminacji z udziałem L-tyrozyny przebiega według innego mechanizmu. Potwierdzeniem takiej tezy byłby wynik znacząco różny od otrzymanego dla L-Phe, czyli na przykład brak efektu lub duży efekt. T 14 COOH HO NH2 14 COOH PAL pH = 8,7, 30 oC + NH2T HO Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji orto pierścienia aromatycznego L-fenyloalaniny O T 14 C T T PAL OH O 14 C pH = 8,7 NH2 OH + NH3 T Wyniki badań kinetycznego efektu izotopowego H/T w pozycji 2 i 6 pierścienia aromatycznego L-fenyloalaniny. Nr eksperymentu – Stopień nr frakcji przereagowania [%] KEI 1-1 5,89 0,8595 1-2 9,32 0,9664 1-3 12,09 1,0254 1-4 13,86 1,0870 1-5 16,22 1,0991 2-1 9,95 1,0143 2-2 12,34 1,0354 2-3 19,70 1,1559 2-4 21,82 1,1591 2-5 24,12 1,1598 Kinetyczny efekt izotopowy 12 C/14C w pozycji 2 L-Phe O O H* C OH NH2 * C H PAL pH = 8,7 OH Kinetyczny efekt izotopowy 12C/14C w pozycji 2 L-fenyloalaniny Nr eksp.* R0, Rp, f R0, Rr, f Rp, Rr, f R0, Rr, Rp Średnia 1 0.9957 1.0262 1.0003 0.9981 1.0051 2 0.9955 0.9918 0.9955 0.9955 0.9946 3 1.0095 0.9696 1.0020 1.0050 0.9965 4 1.0085 1.0044 1.0075 1.0078 1.0070 średnia 1.0023 0.9980 1.0013 1.0016 1.0008 ±0.0062 ±0.0019 Procedura wyznaczenie KEI H/T w pozycji 3-pro-R Mieszanina reakcyjna: enzym, L-Phe [1-14 C, 3R-3H] bufor boranowy 0,2M pH = 8,7 Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnej Mierzę aktywność (A0) 14 C oraz stosunek aktywności3H/14 C (R0 ) t1 t2 t5 t3 t4 Pobieram 5 frakcji (każda V1) o różnym stopniu przereagowania w zakresie od 10% do 20% Procedura postępowania dla każdej frakcji Mieszanina reakcyjna pH=8,7 O T 14 C T O 14 O C + O NH3 H+ Reakcja enzymatyczna zatrzymana pH=0-1 T O 14 C T OH O 14 C + OH NH3 Ekstrakcja (Et2 O) Warstwa eterowa T O 14 C Warstwa wodna T O 14 OH C OH + NH3 Po wydzieleniu L-Phe zastosowana Pomiar aktywnosci14 C (Ai) do następnego eksperymentu oraz stosunku aktywności3 H/14C Rp Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji 3-pro-R L-Phe Nr Eksp. KEI 1 1,0594 Odchylenie stand. 0,0215 1,0535 0,0187 3 1,0566 0,0151 4 1,0480 0,0167 5 1,0585 0,0193 Średnia 1,0552 0,0046 2 Procedura badania KEI w pozycji 3-pro-S L-Phe Mieszanina reakcyjna: enzym, L-Phe [1-14C, 3S-3H] bufor boranowy 0,2M pH = 8,7 Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnej Mierzę aktywność (A0) 14 C oraz stosunek aktywności3H/14 C (R0) t1 t2 t3 t4 t5 Pobieram 5 frakcji (każda V1) o różnym stopniu przereagowania w zakresie od 10% do 20% Procedura postępowania dla każdej frakcji Mieszanina reakcyjna pH=8,7 NH2T O T 14 C O 14 O C + NH3 H+ O Reakcja enzymatyczna zatrzymana pH=0-1 + NH3T O T O 14 14 C C OH OH + NH3 Ekstrakcja (Et2O) elucja H2O Warstwa wodna Kolumna jonowymienna T + + NH3T Amberlit IR 120 (H) 0,3 M NH3 Warstwa eterowa O 14 C O 14 OH C OH + T NH3 O 14 C OH + NH3 HT O O T 14 C + NH3 OH Odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem Pomiar stosunku aktywności 3H/14C (Rri) Pomiar aktywnosci 14 C (Ai) Kinetyczny efekt izotopowy D/T w pozycji 3-pro-S L-Phe Nr Eksp. KEI Odchylenie Stand. 1 1,0750 0,0186 1,0953 0,0187 3 1,0899 0,0151 4 1,0734 0,0167 Średnia 1,0834 0,0109 (1,01%) 2 Zależność Swain’a-Schaad’a α= k kH = H kT kD Gdzie: 1, 44 α= kD kT 3 , 26 k = H kT obl k 〈 H kT obs kH/kT - KIE dla 1H/3H. kH/kD - KIE dla 1H/2H. kD/kT - KIE dla 2H/3H. Jeśli efekt 1H/3H, obliczony z efektów 1H/2H lub 2H/3H przy pomocy wspomnianych zależności, jest mniejszy od efektu zaobserwowanego, wtedy prawdopodobnie w reakcji następuje tunelowanie protonu. Jeśli wartość wyliczonego KIE jest większa od zaobserwowanej, to mamy do czynienia ze złożonością kinetyczną, tzn. nie tylko etap odrywania protonu decyduje o szybkości reakcji.