pobierz plik - Wydział Biologii UW
Transkrypt
pobierz plik - Wydział Biologii UW
mgr Agata Kodroń Instytut Genetyki i Biotechnologii Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego Autoreferat rozprawy doktorskiej pt. Podłoże molekularne dziedzicznej neuropatii wzrokowej Lebera Promotor: Prof. dr hab. Ewa Bartnik Instytut Genetyki i Biotechnologii Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Recenzenci: Prof. nadzw. dr hab. Beata Burzyńska Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk Prof. dr hab. n. med. Rafał Płoski Zakład Genetyki Medycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny Mutacje w genomie mitochondrialnym (mtDNA) powodują choroby genetyczne, których objawy zwykle dotyczą tkanek o największym zapotrzebowaniu energetycznym – mięśniowej i nerwowej. Jedną z nich jest forma ślepoty zwana Dziedziczną Neuropatią Wzrokową Lebera (LHON - ang. Leber’s Hereditary Optic Neuropathy) opisana po raz pierwszy w 1871 r. przez Theodora von Lebera. Choroba w 90% - 95% przypadków powodowana jest przez jedną z 3 mutacji w genomie mitochondrialnym: m.11778G>A/ND4, m.3460G>A/ND1 lub m.14484T>C/ND6. Mężczyźni chorują dużo częściej niż kobiety (choruje 50% mężczyzn i około 10% kobiet z mutacją). Z powodu niepełnej penetracji choroby jak również wyraźnej dysproporcji między chorymi kobietami a mężczyznami postuluje się, że dodatkowe czynniki genetyczne (niezidentyfikowane geny jądrowe) i środowiskowe wpływają na ekspresję choroby. Patofizjologia LHON jest wciąż nieznana i nie ma żadnej skutecznej metody leczenia ten choroby. Dotychczas wysunięto kilka hipotez tłumaczących wpływ mutacji mitochondrialnych na funkcjonowanie komórek pacjentów z LHON. Jedna z nich zakłada, że mutacje w mtDNA zwiększają poziom apoptozy w komórkach zwojowych siatkówki, co prowadzi do degeneracji nerwu wzrokowego. Istnieją również hipotezy, że degeneracja nerwu wzrokowego w LHON spowodowana jest wzrostem poziomu wolnych rodników. Reaktywne formy tlenu są stale produkowane w mitochondriach jako produkt uboczny działania łańcucha oddechowego, jednak w zaburzeniach kompleksu I stwierdzano gwałtowny wzrost ich produkcji. Ponadto zakłada się, że mutacje mitochondrialne powodują spadek produkcji ATP prowadzący do zaburzenia transportu mitochondriów wzdłuż aksonów komórek zwojowych siatkówki do mających duże zapotrzebowanie energetyczne synaps, co prowadzi do kryzysu energetycznego i degeneracji komórek. W ramach niniejszej pracy doktorskiej spróbowano zbadać podstawy molekularne LHON poprzez analizę różnych procesów metabolicznych na trzech różnych modelach komórkowych oraz powiązać otrzymane wyniki z obserwowanymi zmianami w nerwie wzrokowym. Analizy genetyczne i biochemiczne przeprowadzono na liniach komórkowych wyprowadzonych od osób zdrowych oraz od pacjentów z LHON, u których wcześniej w Instytucie Genetyki i Biotechnologii zidentyfikowano kombinację dwóch mutacji „leberowskich”: m.11778G>A i m.3460G>A. Występowanie u jednego pacjenta dwóch mutacji powodujących chorobę jest niezwykle rzadkie. W literaturze opisano jedynie kilka przypadków rodzin z dwiema mutacjami charakterystycznymi dla LHON i we wszystkich przypadkach były to mutacje m.11778G>A i m.14484T>C. Do badań wykorzystano unieśmiertelnione wirusem Epsteina-Barr limfocyty B oraz fibroblasty skóry. Trzecim wykorzystanym modelem były hybrydy transmitochondrialne (cybrydy), które skonstruowano poprzez fuzję pozbawionych jądra komórkowego fibroblastów z pozbawionymi genomu mitochondrialnego komórkami rho 0. Model cybrydowy posłużył do określenia wpływu mutacji w mtDNA na fizjologię komórek przy ujednoliconym tle jądrowym. Na wyprowadzonych modelach komórkowych określono poziom mutacji mitochondrialnych z wykorzystaniem metody last cycle hot PCR-RFLP oraz przeprowadzono pomiary: - procesu apoptozy analizując międzynukleosomalną fragmentację DNA, aktywność kaspaz wykonawczych 3 i 7 oraz profil proteolizy polimerazy poli (ADP-rybozy)-1 - stresu oksydacyjnego, przez analizę produkcji wolnych rodników tlenowych z zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej - procesu autofagii, przez określenie poziomu charakterystycznych białek markerowych tego procesu: białka LC3 izoformy I i II oraz białka p62, a także przez analizę formowania się autofagosomów z zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej - poziomu oddychania komórkowego z wykorzystaniem oksygrafu Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że mutacje powodujące LHON mogą modulować metabolizm komórek innych niż komórki nerwu wzrokowego, a ważnym parametrem wpływającym na intensywność różnych zmian metabolicznych jest poziom heteroplazmii danej mutacji. Z przeprowadzonych eksperymentów wynika, że: 1. W komórkach z dwiema mutacjami LHON występuje podwyższona produkcja wolnych rodników tlenowych, w szczególności rodników ponadtlenkowych, w stosunku do komórek bez mutacji w mtDNA, a intensywność stresu oksydacyjnego zależy od poziomu mutacji. Zwiększony poziom ROS w badanych komórkach może wynikać z zakłóconego przepływu elektronów między kompleksem I i ubichinonem. 2. W komórkach z mutacjami LHON zostają uruchomione różne mechanizmy kompensujące produkcję ATP na zasadzie wzmożonej glikolizy oraz podwyższenia tempa oddychania komórkowego i zwiększenia wydolności oddechowej. Od wydajności systemów kompensujących produkcję ATP może zależeć zdolność komórek do przezwyciężenia negatywnych skutków mutacji. 3. Wydolność oddechowa komórek jest uzależniona od rodzaju i poziomu mutacji i wzrasta wprost proporcjonalnie do rosnącego poziomu m.11778G>A. 4. Stres metaboliczny wywołany hodowlą komórek z mutacjami LHON na pożywce zmuszającej je do produkcji ATP z fosforylacji oksydacyjnej (galaktoza) bądź wywołany hodowlą z inhibitorem kompleksu I (rotenon) wpływa na zmniejszenie aktywacji kaspaz. Możliwe, że inaktywacja kaspaz odbywa się na drodze oksydacyjnej modyfikacji tych enzymów, bądź jest spowodowana niedostateczną produkcją ATP do przeprowadzenia apoptozy zależnej od tych proteaz, wynikającą z niewydolności łańcucha oddechowego lub systemów kompensujących niedobory energii w komórkach. 5. Polimeraza poli (ADP-rybozy)-1 nie bierze czynnego udziału w przebiegu apoptozy niezależnej od aktywności kaspaz w komórkach z mutacjami LHON. W pracy poszukiwano także nowych mutacji przyczyniających się do rozwoju LHON poprzez analizę sekwencji wybranych genów lub pełnych genomów mitochondrialnych u pacjentów z zanikiem nerwu wzrokowego oraz ich krewnych, u których wcześniejsze analizy wykluczyły obecność najczęstszych mutacji odpowiedzialnych za tę chorobę. Przeprowadzone analizy pozwoliły na zidentyfikowanie dwóch rzadkich mutacji z ustalonym bądź potencjalnym statusem patogennym (m.3635G>A/ND1 i m.13042G>A/ND5). Bardzo rzadka mutacja m.13042G>A została zidentyfikowana we wszystkich analizowanych tkankach pacjenta, podczas gdy w tkankach matki była nieobecna. Jest to pierwsze doniesienie o mutacji de novo w tej pozycji. Uzyskane wyniki wskazują, które procesy metaboliczne mogą mieć potencjalnie istotniejszy wpływ na ekspresję LHON, co stanowi podstawę do dalszych badań. Co więcej, zaprojektowano dwa proste testy oparte o technikę PCR-RFLP w celu określenia poziomu mutacji m.3635G>A i m.13042G>A, które mogą zostać włączone do diagnostyki genetycznej u kolejnych pacjentów z zanikiem nerwu wzrokowego. Na przeprowadzenie badań wykorzystałam środki z grantu PRELUDIUM 2011/03/N/NZ3/00655 przyznane mi przez Narodowe Centrum Nauki, a uzyskane wyniki zostały opublikowane w dwóch artykułach w czasopiśmie The Journal of Clinical Pathology, oraz zostały zaprezentowane na licznych konferencjach krajowych oraz międzynarodowych.