materiały
Transkrypt
materiały
Ćwiczenie 7 Miareczkowanie penicyliny metodą biologiczną Cel ćwiczenia: wyznaczenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) penicyliny dla szczepów Escherichia coli, Bacillus cereus. Określenie nieznanego stężenia antybiotyku metodą biologiczną. Podłoża: Bulion odżywczy wyciąg mięsny 3g pepton 10 g NaCl 5g glukoza 10 g woda do 1000 ml Bulion LB (Luria broth, Luria-Bertani broth, Lysogeny broth) wyciąg drożdżowy 5 g pepton trypton 10 g NaCl 10 g woda do 1000 ml Szczepy wzorcowe: E. coli, B. cereus Miareczkowanie penicyliny metodą seryjnych rozcieńczeń: 1. Rozlać aseptycznie do 12 probówek po 2 ml jałowego bulionu LB (dla E. coli) lub bulionu odżywczego (dla B. cereus). Zatkać probówki sterylnymi korkami i opisać je kolejnymi numerami. 2. Przygotować następujące kontrole, opisać probówki: kontrola jałowości (probówka 11) oraz kontrola wzrostu szczepu testowego (probówka 12). 3. Do pierwszej probówki dodać 2 ml roztworu penicyliny o stężeniu 0,5 j./ml i dokładnie wymieszać. 4. Wykonać szereg rozcieńczeń roztworu penicyliny w bulionie – przenieść jałowo 2 ml mieszaniny z pierwszej probówki do drugiej, ponownie dokładnie wymieszać i analogicznie postępować z kolejnymi probówkami aż do 10. Z ostatniej, dziesiątej, probówki usunąć 2 ml w celu zachowania stałej objętości hodowli. Obliczyć stężenie penicyliny w poszczególnych probówkach, wyniki zanotować w tabeli. 5. Przygotować rozcieńczenie hodowli szczepu wzorcowego 1:1000 w odpowiednim bulionie. 6. Dodać do probówek nr 1-10 oraz 12 (czyli do wszystkich z wyjątkiem kontroli jałowości) po 2 krople rozcieńczonej zawiesiny szczepu. Wszystkie probówki zatkać jałowym korkiem. 1 7. Inkubować probówki w cieplarce (temp. 30°C lub 37°C, 24 h). Określić minimalne stężenie hamujące (MIC – minimal inhibitory concentration) dla wybranego szczepu. 8. Analogicznie wykonać szereg rozcieńczeń dla penicyliny o nieznanym stężeniu. Wyznaczyć stężenie roztworu wyjściowego na podstawie otrzymanych wyników. ………. Ryc. Schemat przygotowania rozcieńczeń próbki Wyniki: Tabela. Obserwacja wzrostu w szeregu rozcieńczeń penicyliny o znanym stężeniu nr probówki stężenie penicyliny [j./ml] wzrost szczepu testowego [TAK/NIE] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Minimalne stężenie hamujące wzrost …………………… wynosi: …………………… Tabela. Obserwacja wzrostu w szeregu rozcieńczeń penicyliny o nieznanym stężeniu nr probówki wzrost szczepu testowego [TAK/NIE] 1 2 3 4 5 6 stężenie penicyliny [j./ml] 2 7 8 9 10 11 12 Stężenie penicyliny w próbce ……… wynosiło…………………… Uzasadnienie odpowiedzi: ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… 3